基于網絡藥理學探討百合知母湯抗焦慮與失眠的分子機制*

許海燕，劉艷紅，王 珊，侯敏娜，王 青，彭修娟

陜西國際商貿學院，陜西 咸陽 712046

焦慮癥是以焦慮為主要特征的神經癥［1］，其可導致或加重失眠，反過來失眠也可加重焦慮，二者相互影響，形成惡性循環［2］。失眠不僅降低了焦慮患者的生活質量，而且可能引發糖尿病、高血壓、認知障礙等疾病。焦慮癥屬中醫“百合病”“焦躁”“怔忡”范疇［3］，張仲景《傷寒雜病論》載：“心中煩，不得臥”“心煩，不得眠”等。清代蔣寶素《問齋醫案》明確記載：“驚悸、怔忡、不寐、汗眩、饑嘈乃一體之病?！笨梢?，焦慮、失眠屬中醫百合病等范疇。

百合知母湯［4］出自張仲景《金匱要略·百合狐陰陽毒病脈證治第三》，由百合、知母組成，其中百合味甘微苦，性寒；歸心肺經；具有清心安神，養陰潤肺功效；主治陰虛燥咳，虛煩驚悸，失眠多夢，精神恍惚等癥［5］。知母味甘苦，性寒；歸肺、胃、腎經；具有清熱瀉火、滋陰潤燥功效；用于外感熱病，肺熱燥咳，內熱消渴，腸燥便秘等癥［6］。百合甘寒清潤而不膩，知母甘寒降火而不燥，百合偏于補，知母偏于瀉，二藥伍用，一潤一清，一補一瀉，共奏潤肺清熱，寧心安神之效。故百合知母湯可治療心煩不安、失眠、情志不遂、精神恍惚等癥及百合?。?］。

中醫藥整合藥理學研究平臺（integrative pharmacology-based research platform of traditional Chinese medicine，TCMIP）V2.0 數據來源于ETCM［8］（http：//www.ehbio.com/ETCM/）中醫百科全書數據庫。本研究數據來源于TCMIP V2.0（http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/）“中藥材數據庫”“中藥成分數據庫”“中藥靶標數據庫”和“疾病相關分子庫”等。其中與中藥、疾病相關的靶標基因及相關數據來源于Drugbank、在線人類孟德爾遺傳數據庫（online mendelian inheritance in man，OMIM）、基因相關性數據庫（DisGeNET）、人類疾病表型特征數據庫（human phenotype ontology，HPO）、基因本體（gene ontology，GO）、藥物靶標數據庫（therapeutic targetdatabase，TTD）等。TCMIP V2.0 鑲嵌 了HAPPI、Reactome、OPHID、In Act、HPRD、PDZ Base、MINT、DIP 等數據庫中的蛋白-蛋白互作網絡（proteinprotein interactions，PPI）數據。3種拓撲結構特征值包括：連接度（Degree）、介度（Betweenness）、緊密度（Closeness），以確定中藥矯正疾病失衡網絡的候選靶標。本研究借助TCMIP V2.0 以百合知母湯為研究對象，初步闡明其抗焦慮與失眠的作用機制，為百合知母湯的進一步深入研究提供理論及數據支持。

1 研究方法

1.1 百合知母湯化學成分來源在TCMIP V2.0平臺的“中藥材數據庫”項下分別以“百合”“知母”為關鍵詞進行檢索，收集兩藥的化學成分，建立百合知母湯的化學成分數據庫。

1.2 百合知母湯候選靶標來源在TCMIP V2.0平臺“疾病相關分子集及其功能挖掘數據庫”中，分別以目標疾病“Anxiety”“Insomnia”為關鍵詞進行檢索，獲得與焦慮、失眠相關的靶點。然后在“中藥（含方劑）靶標預測及功能分析數據庫”中，依次添加“百合”“知母”，預測百合知母湯化學成分庫中成分靶標，選擇“相似性分數≧0.8”的成分預測靶標作為候選靶標。應用TCMIP V2.0 研究平臺采用二維結構（.mol或.sdf）進行相似性比對，以Tanimoto系數定義的相似度計量方法進行相似性打分，與FDA上市藥物的化學結構進行比對［9］。

1.3 PPl通過TCMIP V2.0獲得百合知母湯的潛在靶標與焦慮及失眠疾病靶標之間的PPI信息［10］。

1.4 中醫藥關聯網絡構建與關鍵網絡靶標基因功能挖掘在TCMIP V2.0 平臺的“中醫藥關聯網絡挖掘數據庫”中，建立百合知母湯作用的潛在靶標與焦慮及失眠疾病靶標之間的相互作用網絡，通過計算網絡節點的連接度（Degree）、介度（Betweenness）和緊密度（Closeness），篩選網絡中的核心節點基因，作為百合知母湯抗焦慮與失眠的關鍵靶標網絡。根據中藥方劑、中藥材、中藥成分、核心靶標、通路、疾病和證候之間的關聯性，可任意選擇不同類型節點，構建中藥多維關聯網絡，篩選百合知母湯關鍵網絡靶標基因顯著參與的生物學反應（GO-Biological Process）、所行駛分子功能（Molecular Function）及其所在細胞內定位（Cellular Component）；依托Reactome 數據庫的Pathway信息，篩選百合知母湯關鍵網絡靶標基因顯著參與的分子通路（Reactome-Pathway）。依托ETCM 數據庫的疾病和表型數據庫，篩選百合知母湯關鍵網絡靶標基因顯著相關的疾病和表型。最終形成“中藥方劑-中藥材-化學成分-核心靶標-關鍵通路-疾病關鍵病理環節”多層次網絡關聯圖［11-12］。

2 結果

2.1 百合知母湯靶點預測結果共得到百合化學成分12 種，知母化學成分42 種，主要為揮發油類、多糖類、生物堿類、有機酸類、甾醇類、黃酮類、皂苷類等。為了保證靶標預測結果可信度，設定百合、知母中化學成分與FDA 藥物之間的相似性分數≥0.8，得到二者的靶標數目分別為221、196個，其中共有靶標133 個，包括糖皮質激素受體基因（glucocorticoid receptor gene，NR3C1）、重組蛋白（Recombinant Protein，GABRG1）、雌激素受體1（Elabscience，ESR1）、多克隆抗體（polyclonal antibody，GABRA3）、凝集素（galactoside-binding，LGALS2）、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）、ATP 酶α2 亞基基因（Transporting Alpha 2 Polypeptide，ATP1A2）、小鼠多克隆抗體（mouse polyclonal antibody，CYP2B6）、干擾素β1（interferon beta 1，IFNβ1）、γ氨基丁酸A型受體γ2亞單位基因（γgamma-aminobutyric acid A receptor gamma 2，GABRG2）等。動物實驗表明［13］百合知母總皂苷具有良好的鎮靜催眠作用，并與百合、知母單用比較優勢明顯，可知百合、知母配伍在鎮靜催眠方面具有協同增效作用。百合知母湯候選靶標基因功能涉及神經系統過程、突觸傳遞、氨基丁酸信號通路、膜電位調節、類固醇激素介導的信號通路、離子傳輸、類固醇代謝過程、異型生物質的代謝等生物學過程。中藥候選靶標涉及通路有核受體轉錄途徑、氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）受體激活、膳食碳水化合物消化、微管蛋白折疊通路、N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic receptor acid，NMDA）受體介導的受神經元傳遞的負調控、外源性物質等通路。

2.2 焦慮與失眠疾病靶點收集結果獲得與焦慮相關的疾病靶點210 個，與失眠相關的疾病靶點27個，焦慮與失眠共有靶標分別是鄰鋅指結構域1B（bromodomain adjacent to zinc finger domain 1B，BAZ1B）、兔單克隆抗體（rabbit anticpox polyclonal antibody，CPOX）、（人）重組蛋白［（Human）recombinant protein，DCTN1］、彈性蛋白（elastin，ELN）、含GTF2I 重復域1GTF2I［（Human）repeat domain containing 1，GTF2IRD1］、人體黑素促皮質素3 受體（human mammary carcinoma cell membrane proteinase，HMBS）、單絲氨酸蛋白激酶1抗體（LIMK1 antibody，LIMK1）、多發性內分泌腫瘤1 型綜合征（multiple endocrine neoplasia，MEN1）、朊蛋白基因（prion protein gene of large animals and human beings，PRNP）、復制因子C亞單位（2replication factor C subunit2，RFC2）、轉導蛋白（β）樣2［Transducin（β）-like 2，TBL2］。

2.3 百合知母湯抗焦慮與失眠的“藥物靶標-疾病靶標”核心網絡共得到128個與焦慮、失眠以及藥物相關核心網絡靶標，其中與藥物相關靶標14個，與疾病相關靶標114個。利用PPI模塊構建核心網絡靶標圖，平臺設定同時滿足大于節點“連接度”“介度”“緊密度”的中位數為卡值，得到關鍵核心靶標54個，如GABRA1、NFKB1、AR、SMC1A、PIK3CA、NR3C1、DRD2 等。已知藥物靶標14 條，即NFKB1、NFKB2、NR3C1、GABRA1、GABRA3、GABRA4、GABRA5、NCOA2、ESR1、CASP3、AHR、AR、CYP2D6、GABRB2。藥物與疾病共有靶標2 條。其中，與焦慮相關靶標為NR3C1，與失眠相關靶標為GABRA1。NR3C1［14］可影響HPA 軸的負反饋調節，改變個體對應激的反應性，而對應激的過度反應是焦慮障礙的重要誘因，研究表明在焦慮障礙中HPA 軸通常表現為較弱的負反饋抑制，由此可認定NR3C1 為焦慮障礙的重要候選基因。也有研究發現糖皮質激素［15-16］可使中樞神經系統的興奮性增高，導致患者出現失眠或加重原有失眠，引發焦慮、抑郁，甚至誘發精神失常。GABRA1是GABA的受體，而GABA［17］是一種廣泛存在于中樞神經系統中的抑制性神經遞質，能夠抑制神經系統神經元，具有神經保護作用，有催眠、鎮靜和抗焦慮等功能。有實驗發現，電針刺激能增加失眠大鼠GABA及GABRA1表達與分泌，抑制覺醒和興奮，促進睡眠，調節睡眠-覺醒周期平衡。通過實驗可看出GABRA［18-19］等基因所參與的神經活性配體-受體相互作用通路與神經遞質的傳遞在失眠的治療過程中發揮重要作用。見圖1。

2.4 百合知母湯抗焦慮與失眠的基因功能及通路信息通過關鍵靶標功能信息推測，百合知母湯抗焦慮及失眠主要通過調節氨基丁酸信號通路、氯離子跨膜運輸等信號轉導效應和基因表達改變GABA含量，從而抑制焦慮癥、抑郁癥、癲癇、帕金森等精神心理障礙或中樞神經系統疾病的發生［20-21］。并通過增加GABA與GABAA受體結合后氯離子通道的開放頻率，起鎮靜催眠作用［22-23］。見表1。

表1 百合知母湯抗焦慮與失眠候選靶標基因及數目

百合知母湯抗焦慮與失眠的分子通路主要涉及GABA受體激活、GABAA受體激活、胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）調節胰島素分泌、胰高血糖素信號中PKA的激活、細胞內受體的SUMO化（SUMOylation）、成纖維細胞生長因子受體（FGFR1）信號通路等。通過調節GABA與GABAA受體含量可抑制焦慮，起鎮靜催眠作用。GLP-1［24-25］不僅可通過保護胰島生存環境對抗細胞因子對細胞的損傷，改善細胞對葡萄糖敏感性，刺激胰島β細胞分泌胰島素，而且在中樞神經系統中具有重要作用，包括調節攝食行為、胰島素敏感性、心血管功能以及抗焦慮、抗抑郁、保護神經等作用。FGFR的過度表達或過度激活與多種腫瘤、骨骼系統疾病、關節炎等相關［26］，而腫瘤、關節炎等疾病都能引起焦慮與失眠［27-28］，百合知母湯可通過調節FGFR表達，抑制多種疾病引起的焦慮與失眠。有研究表明SUMO 化修飾及其路徑與人類疾病相關［29-30］，SUMO化修飾與癌癥、神經退行性疾病、糖尿病、腦損傷等疾病有關，如SUMO 蛋白具有保護腦神經細胞功能。研究發現，人體處于中風或癲癇狀態時，SUMO化降低了紅藻氨酸受體的作用，從而保護神經細胞免受損失，防止大腦神經細胞過度興奮，起抗焦慮及失眠作用。故百合知母湯通過多種途徑、多種信號通路作用于多種靶點發揮功效。見表2。

表2 百合知母湯抗焦慮與失眠候選靶標的分子通路及數目

2.5 百合知母湯抗焦慮與失眠的“中藥-靶標-通路-疾病”網絡可視化分析利用核心靶標及其與中藥成分和疾病之間的關系繪制“中藥-成分-關鍵藥靶-通路”網絡可視化圖，可以看出百合知母湯化學活性成分有9 個、直接靶標54 個及25 條主要通路，其中皂苷類、黃酮類、揮發油類、有機酸類等可作用于藥物與疾病共有靶標NR3C1、GABRA1，如百合中的甾醇、百合皂苷、蒽醌類、生物堿類，知母中的知母皂苷、芒果苷、黃酮類、揮發油、雙苯吡酮類等。見圖2。

圖2 “中藥-成分-關鍵靶標-通路”多維關聯網絡

有研究發現［31］，生物堿類、揮發油類、黃酮類、皂苷類均具有鎮靜催眠作用。百合具有明顯鎮靜安神作用，WANG 等［32］研究發現百合的鎮靜催眠作用與其總皂苷及薯蕷皂苷具有明顯相關性，表明百合皂苷可能是百合發揮鎮靜催眠作用的主要藥效物質基礎。知母中的皂苷類可減少小鼠活動次數，延長小鼠睡眠時間［33］。研究表明，百合知母總皂苷具有顯著鎮靜催眠作用，能減少個體活動次數，延長戊巴比妥鈉所致睡眠時間，并隨著劑量增加，鎮靜催眠作用也增加［34］。有課題組基于其研究成果［35］，對調控睡眠較為重要的GABA 進行靶標分析，并將所得化合物與GABA通路下的GABRA1蛋白進行分子對接，發現知母皂苷和GABRA1 蛋白分子對接最佳。從知母中分離出的木脂類化合物被證明是較強的cAMP 磷酸酯酶抑制劑，能延長環戊巴比妥所致睡眠時間［36］。故百合知母湯的抗焦慮與失眠作用與其所含總皂苷含量有關。

3 討論

失眠是臨床常見癥狀，數據顯示，中國存在失眠的人群為42.5%，嚴重危害人們身心與生活質量。失眠癥狀常與其他疾病同時或相繼發生，臨床中失眠與焦慮障礙和抑郁癥的共患率較突出［37］。其中70%的焦慮障礙患者伴隨睡眠紊亂，廣泛性焦慮障礙、驚恐障礙和創傷后應激障礙與失眠的關系更為密切，病情嚴重者甚至可出現自殺行為［38］。西醫治療焦慮、失眠多采用艾司唑侖、勞拉西泮等藥物，但多數患者依從性差或服用不當容易形成耐藥性及依賴性的缺點，影響療效及安全性。中藥方劑治療焦慮、失眠具有療效穩定、不易復發、無成癮性、無依賴性的優勢，故越來越多的焦慮與失眠等神志精神疾病多用中醫藥進行防治。

百合知母湯加減用于治療焦慮及失眠癥臨床雖有確切療效［39］，但目前缺乏對其活性成分及其作用機制的研究。本研究共得到百合知母湯活性成分9 個，分別作用于54 個直接靶標和25 條主要通路上，其藥效物質基礎主要為皂苷、黃酮、甾醇等。有研究發現［40］抗焦慮有效成分涉及黃酮類、生物堿類、有機酸和酚類等多種成分。黃酮與皂苷可作用于GABA 受體，調節激素水平、細胞因子、生理節律及興奮性氨基酸（谷氨酸及天門冬氨酸）等的異常，達到催眠抗焦慮目的。

本研究是基于網絡大數據所做的預測，研究結果還需要通過進一步的實驗研究加以驗證。