基于網絡藥理學的二仙湯“異病同治”乳腺增生和圍絕經期綜合征的作用機制

遲皓南，孫小慧，楊 毅△

1 山東中醫藥大學中醫學院，山東 濟南 250014；2 山東中醫藥大學附屬醫院乳腺甲狀腺外科，山東 濟南 250011

乳腺增生（hyperplasia of mammary glands，HMG）是一種由于乳腺組織不斷增生與復舊導致的良性病變，好發于中青年女性，臨床常表現為乳房疼痛，反復發作，易形成乳房腫塊［1-2］。目前治療HMG 的方法多樣，如中西醫結合治療、物理治療等［3-5］，但治療效果不一，甚則出現胃腸道不適等不良反應。圍絕經期綜合征（perimenopausal syndrome，PMS）是由于中老年女性卵巢生理功能減退，性激素分泌紊亂，骨密度降低等原因出現的一類臨床癥候群，發病風險較高［6］，可伴有潮熱盜汗、睡眠障礙、情緒異常等癥狀，嚴重者可導致心血管及泌尿系統疾?。?］，影響患者身心健康與生活質量。相關指南指出，激素治療能夠緩解PMS［8］，但部分患者會引發陰道流血等婦科疾?。?］。

二仙湯出自《中醫方劑臨床手冊》，是張伯訥教授創制的一首經驗方。該方由仙茅、淫羊藿、巴戟天、當歸、知母、黃柏組成，具有陰陽雙補，調理沖任之功。相關研究［10-12］顯示，二仙湯治療HMG與PMS 均在于調節體內雌、孕激素水平及調控信號傳導通路異常等，其中仙茅、淫羊藿、巴戟天等單味中藥能分泌卵巢顆粒細胞促進雌二醇，進而改善人體內分泌環境。然而二仙湯組方有效成分較多，涉及的靶點通路復雜，具體分子作用機制尚未闡明，且單用傳統藥理學難以系統分析。因此，本研究運用網絡藥理學方法，探究二仙湯“異病同治”HMG及PMS的分子機制，為臨床治療提供依據。

1 研究方法

1.1 二仙湯活性成分及靶點篩選運用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmspsearch.php）進行數據挖掘，以“仙茅”“淫羊藿”“知母”“巴戟天”“當歸”“黃柏”為關鍵詞，經過對既往中藥有效成分的藥物代謝動力學研究結果［13］，根據口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30% 和藥物類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18篩選二仙湯有效活性成分及潛在作用靶點，然后使用Uniprot 數據庫（https：//www.uniprot.org），以“人”為屬性設定，進行靶點整合和基因規范化處理。

1.2 疾病靶點預測在人類基因數據庫（the human gene database，GeneCards）（https：//www.genecards.org）與在線人類孟德爾遺傳數據庫（online mendelian inheritance in man，OMIM）（http：//omim.org）中輸入疾病關鍵詞“hyperplasia of mammary glands”和“perimenopausal syndrome”，剔除重復靶點后，確定乳腺增生和圍絕經期綜合征的疾病靶點。

1.3 藥物與疾病交集靶點預測與構建利用Venn圖（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），獲得二仙湯中的活性成分與HMG及PMS的重疊靶基因。

1.4 藥物-成分-靶點-疾病網絡構建將二仙湯中活性成分、藥物與疾病的交集靶點導入Cytoscape 3.7.2 軟件，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡，其中節點代表藥物、成分、疾病及靶點，邊代表藥物、成分、靶點、疾病間的相互作用關系。

1.5 PPl 及核心靶點網絡構建利用STRING（http：//string-db.org/）數據庫構建藥物與疾病的交集靶點PPI網絡；借助Cytoscape 3.7.2軟件，以≥Degree 平均值篩選二仙湯治療HMG 和PMS的核心靶點。

1.6 GO功能和KEGG通路富集分析利用核心靶基因導入基因功能注釋數據庫（the database for annotation visualization and integrated discovery，DAVID）對藥物與疾病的交集靶點進行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，以P＜0.05 為篩選標準，分別選取前10 條GO 功能及KEGG 通路，制成柱狀圖進行可視化分析。

2 結果

2.1 二仙湯活性成分及靶點預測共得到二仙湯有效活性成分104 個，其中仙茅7 個，淫羊藿23個，知母15個，巴戟天20個，當歸2個，黃柏37個，刪除重復活性成分得到二仙湯活性成分對應靶點147個。見表1。

表1 二仙湯活性成分基本信息

2.2 HMG 與PMS 靶點預測在GeneCards 和OMIM疾病數據庫以“hyperplasia of mammary glands”和“perimenopausal syndrome”為關鍵詞檢索，得到疾病靶點HMG 4153 個、PMS 155 個。將二仙湯靶點與兩種疾病靶點進行映射，得到二仙湯“異病同治”HMG和PMS的29個靶點。見圖1。

圖1 二仙湯與乳腺增生和圍絕經期綜合征Venn圖

2.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡構建通過Cytoscape 3.7.2 軟件構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖。該網絡圖中藍色節點代表二仙湯中藥物名稱，紅色節點代表疾病名稱，黃色節點代表藥物活性成分，綠色節點代表靶點。其中，β-谷甾醇（MOL000358）、豆甾醇（MOL000449）、槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422）等節點的自由度分別為198、176、170、106，提示以上活性成分可能是二仙湯治療HMG 和PMS 的關鍵活性成分。見圖2。

2.4 PPl網絡構建將二仙湯與HMG和PMS的交集靶點導入STRING在線數據庫平臺，設置屬性為“人”，構建靶點間的蛋白互作關系圖，圖中共有29 個節點，174 條邊，平均節點值為12。利用Cytoscape 3.7.2 軟件，以Degree 值≥12 為篩選標準，其中IL-6、VEGFA、TNF、TP53、ESR1、CAT、IL-1β等靶點的自由度較高，說明以上靶點可能是二仙湯作用于HMG和PMS的核心靶點。見圖3。

圖3 二仙湯治療HMG與PMS的PPI網絡

2.5 交集靶點的GO功能與KEGG代謝通路富集分析共篩選得到生物過程（biological process，BP）121條，主要涉及DNA模板轉錄正調控、基因表達的正調控、缺氧反應等生物過程；細胞組分（cellular component，CC）15 條，主要涉及胞外間隙、胞外區、質膜等；分子功能（molecular function，MF）26 條，主要涉及類固醇結合、酶結合、類固醇激素受體活性等分子功能。分別選取前10 條制成柱狀圖。通過篩選得到KEGG 通路20條，主要涉及TNF信號通路、NOD樣受體信號通路、HIF-1 信號通路、癌癥信號通路、PI3K-Akt 信號通路等。見圖4—5。

圖4 GO功能富集分析

圖5 KEGG富集分析

3 討論

運用網絡藥理學方法探討二仙湯“異病同治”HMG 和PMS 的分子機制，二仙湯“異病同治”HMG 和PMS的活性化合物104個，預測得到靶點147個。

通過“藥物-成分-靶點-疾病”網絡可以看出，β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山柰酚等活性成分可能是二仙湯治療HMG 和PMS 的關鍵活性成分。研究顯示，β-谷甾醇可以通過誘導ERα和Erβ兩種受體發揮雌激素樣作用［14］，改善機體內分泌環境，其中Erα和Erβ受體可促進和抑制乳腺組織增殖［10］，二者作用協同保護乳腺組織。此外，β-谷甾醇還能通過刺激卵巢顆粒細胞分泌雌二醇［15］，進而增強成骨作用及抑制破骨作用，提高骨密度［16］，改善PMS。槲皮素作為天然黃酮類中的一員，具有與雌激素相似的化學結構，可發揮雌激素樣作用［17］，同時也可調節雌激素代謝途徑，直接調節乳腺癌T47D-β細胞的Erβ受體表達，影響ERα/ERβ比值，抑制細胞異常增殖［18］，防止乳腺組織癌變。研究發現，槲皮素能通過改善雌激素水平進而修復卵巢功能，促進卵泡發育與顆粒細胞增殖，增加雌激素分泌［19］，從而緩解PMS 癥狀。二仙湯中的活性成分可通過發揮雌激素樣作用與調控雌激素代謝從而達到“異病同治”HMG和PMS的目的。

通過STRING在線數據庫平臺分析得出，IL-6、VEGFA、TNF、TP53、ESR1、CAT、IL-1β等靶點可能為二仙湯治療HMG 和PMS 的關鍵靶點。IL-6 作為細胞因子家族的核心成員，在機體免疫、炎癥、細胞生成等方面起重要作用［20-22］。其中，在正常乳腺組織中，IL-6 通過與IL-6R 結合激活IL-6/STAT3信號通路，并通過與細胞核中相對應的靶基因發揮作用，調節芳香酶活性，促進雌二醇表達［23］，調節機體內分泌環境，在防治HMG 方面起重要作用。同時，TNF、IL-6 等炎癥細胞因子可抑制成骨細胞活性，增加破骨細胞活性［24］，因此抑制炎癥因子的激活可以減少骨質流失，改善由PMS 導致的骨密度降低，降低骨折風險。VEGFA 是VEGF 家族中的一員，在血管生成過程中，該基因是對內皮細胞有特異性的唯一因子，參與了多種生理及病理過程的血管生成［25-26］。圍絕經期女性體內激素水平變化與細胞凋亡關系密切，該階段女性體內卵巢粒細胞凋亡導致卵泡停止發育，雌激素減少。研究發現，VEGFA 高表達參與了卵泡發育等生殖過程［27］，可產生雌激素。同時，雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）可與槲皮素結合發揮雌激素樣保護作用，影響PMS 的發展進程，提示二仙湯可通過多靶點“異病同治”HMG和PMS。

GO 富集分析發現二仙湯治療HMG 和PMS 的生物過程主要涉及DNA 模板轉錄正調控、基因表達的正調控、缺氧反應、生物合成過程的正向調節、類固醇結合、酶結合、類固醇激素受體活性等。KEGG通路富集分析發現靶基因主要富集在TNF信號通路、NOD 樣體信號通路、HIF-1 信號通路、癌癥信號通路、PI3K-Akt 信號通路等信號通路上，說明二仙湯主要通過調控信號通路參與治療HMG 和PMS。研究表明，PI3K-Akt信號通路通過影響其下游靶蛋白而促進乳腺細胞增殖及抑制凋亡等［28］，同時也參與骨形成和骨重建過程［29-30］。PI3K-Akt 可通過ErbB 信號通路激活，促進神經干細胞分化，防治神經系統疾?。?1］，緩解由PMS 造成的睡眠障礙、情緒失常等癥狀。研究發現［32］，HIF-1 通路參與絕經后骨質疏松的病理演變，抑制HIF-1 可改善絕經后骨質疏松嚴重程度。HIF-1 信號通路對缺氧導致的血管生成發揮重要作用［33］，可增強乳腺組織抗氧化能力，提高機體免疫功能，改善增生病理組織，具有抗乳腺增生作用。因此，二仙湯中的活性成分可能通過PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路等參與治療HMG和PMS。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法分析二仙湯“異病同治”HMG和PMS的分子機制，發現有147 種可直接或間接影響HMG 和PMS 的有效成分以及可治療HMG 和PMS 的29 個核心靶點。推斷PI3K-Akt 信號通路、HIF-1 信號通路可能是治療HMG 和PMS 的關鍵和主要途徑。這些數據可為二仙湯的臨床應用及進一步開發提供一定理論依據，但具體機制仍需結合體內實驗進一步驗證。