蚯蚓驅動的濱海鹽堿農田土壤中多環芳烴生物降解的機制研究

吳煒龍，陳藝杰，衛婷，楊貴瓊，陽長洪，甄珍，藺中

1. 廣東海洋大學濱海農業學院，廣東 湛江 524088；2. 廣東海洋大學化學與環境學院，廣東 湛江 524088

土壤鹽堿化已成為全球性農業和環境問題。中國具有農業利用潛力的鹽堿荒地和鹽堿障礙耕地總面積約為1.33×107hm2（王佳麗等，2011），其中濱海鹽堿障礙耕地面積約1.1×106hm2（胡炎等，2023）。濱海鹽堿障礙耕地是中國重要的耕地資源，其合理的開發利用對中國的糧食安全具有重大戰略意義（牛東玲等，2002；孫池濤等，2018）。然而，濱海鹽堿障礙耕地鹽分高、物理結構差、肥力水平低。加之，海洋污染和近岸人類活動導致土壤污染越來越嚴重，嚴重影響著濱海鹽堿障礙耕地的糧食安全和生態健康（Yang et al.，2015；Shi et al.，2021）。多環芳烴（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）含有兩個或兩個以上苯環，具有低溶解、耐熱解和難降解等特性，是典型的致畸、致癌、致突變的“三致”持久性有機污染物（Persistent Organic Pollutants，POPs）。其主要來源于環境中的焦爐廢氣排放、化石燃料不完全燃燒、灌溉污水和海洋原油開采滲漏等（蔡楊等，2021；丁家琪等，2023）。由于高疏水性和脂溶性，邊緣海岸帶中的多環芳烴很容易被土壤吸附固定，使濱海鹽堿農田成為多環芳烴的重要儲存庫。16 種PAHs 在國際上被列為了優先控制的有機污染物（Hawliczek et al.，2012；Hernández-Veg et al. ， 2017 ； Nzila ， 2018 ；Kariyawasam et al.，2022）。其中，蒽（Anthracene，Ant）作為PAHs 中典型的線性三環芳烴，自然環境中降解緩慢，在PAHs 家族中生態風險相對較高。有研究表明，在廣東省許多地區不同利用方式的濱海鹽堿土壤PAHs 污染相對嚴重（Dai et al.，2022；Chen et al.，2023；）。且Zhao et al.（2023）研究了湛江灣海域中PAHs，得出PAHs 全年總濃度范圍為5.15—53.7 ng·L-1，這也間接加劇了湛江區域濱海鹽堿農田土壤PAHs 的污染。因此，尋找一種生態、環保、可持續的技術促進濱海鹽堿農田土壤PAHs 的降解具有重要的研究意義。

自然條件下，PAHs 污染土壤中土著微生物的生物降解起主導作用，是PAHs 去除的主要途徑之一（Li et al.，2009）。微生物可以將PAHs 當作唯一碳源或與其它有機質進行共代謝，轉換成生命活動所需物質，達到降解PAHs 的效果（Lu et al.，2011）。然而，在實際的污染場地中，由于土著微生物“數量不多、活性不高和降解能力不足”等因素、難以達到較好的降解效果，導致土壤自凈效果欠佳（Lin et al.，2016a，2016b）。濱海鹽堿農田中，鹽脅迫是影響土壤PAHs 降解的關鍵因素之一（Fernández-Luque?o et al.，2008）。鹽脅迫下土壤中的土著微生物的生長嚴重受到抑制，降解功能微生物種群結構單一、數量不高、活性不強，致使PAHs 在濱海鹽堿地土壤中的降解變得更加困難（Wang et al.，2012）。另外，PAHs 易被土壤有機質和團聚體等吸附固定，大大降低了其生物有效性和微生物反應接觸機會，更難以被微生物代謝利用（鐘茂生等，2012）。近年來，國內外較多研究利用外源物質激發土著微生物的降解效率，比如“添加營養物質、表面活性劑”等方法（Bolan et al.，2023），但面臨費用高昂、二次污染和可持續性不高等問題。因此，探尋一種環境友好、持續穩定的低成本修復技術尤為重要。

蚯蚓被稱作“土壤生態系統工程師”，廣泛分布在世界不同土壤，具有極強的環境適應力和繁殖力。蚯蚓習性等可以改善濱海鹽堿土壤PAHs 生物降解面臨的諸多限制因素。蚯蚓能夠在全鹽量較高的鹽堿土壤中生存（吳文良等，2001），并對土壤PAHs 污染表現出遠高于微生物的耐性和抗性（潘政等，2020）。蚯蚓挖掘、擾動和吞食土壤，并在消化道和蚓糞中充分混合，增加有機污染物和土壤微生物間的表面接觸和傳播機會，進而提高污染物的生物有效性。蚯蚓具有極強的分解有機質的能力，在消化有機物過程中分解產生大量的氨基酸、多糖類和生物酶（Xiang et al.，2006），可為污染物的生物降解提供共代謝碳源，增強土著微生物的數量和活性。更為關鍵的是，蚯蚓挖掘可改善土壤通氣透水條件，從而使鹽堿地表層土壤中的鹽分更易淋溶（張濤等，2017），進而緩解濱海鹽堿地的關鍵鹽脅迫障礙因素，改善濱海鹽堿地土壤健康質量狀況。大量研究表明，蚯蚓可加速農田土壤農藥、多氯聯苯、多環芳烴和鄰苯二甲酸酯等有機污染物的生物降解（Lin et al.，2018；Lin et al.，2021）。但蚯蚓強化濱海鹽堿農田土壤中PAHs 降解的效果和作用機制研究較少，降解過程中的強化效果主要源于非生物作用還是生物作用有待研究，且關鍵環境影響因子和降解功能微生物仍未可知。因此，深入了解蚯蚓對鹽堿土壤PAHs 污染的降解效果和微生物作用機制，可為豐富和發展濱海鹽堿農田的合理開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自廣東省湛江市麻章區廣東海洋大學實驗基地（21°09′10.07″N、110°18′51.98″E），該基地長期種植海水稻。在不同地塊的4 個角落以及中心點采樣，用土壤采樣器采集表層土（0—20 cm），并將所有地塊所采的土壤混勻，室內自然風干后除去植物根系和石子等雜物，過20 目篩（孔徑0.85 mm）備用。供試土壤未發現蒽污染，土壤pH為7.73，有機質含量為25.21 g·kg-1，胡敏素為13.05 g·kg-1，富里酸為2.30 g·kg-1，胡敏酸為1.57 g·kg-1，全鹽量為2.17 g·kg-1。

試驗供試蚯蚓為赤子愛勝蚓，購自廣東省元輝蚯蚓養殖場。試驗前將蚯蚓馴化，具體方法為：按每50 只放入1 kg 試驗土壤中，保持土壤濕度為最大田間持水量的60%，且在25 ℃恒溫培養箱中避光培養兩周。試驗時選取健壯、大小相當、具有環帶的成年蚯蚓，用無菌水清洗干凈放置于裝有濕潤濾紙的燒杯中。在黑暗培養箱中，室溫25 ℃條件下培養24 h，使其排出體內糞便。

蒽為分析純（ALFA，97%，中國醫藥公司）。用少量甲醇溶解蒽，再用正丁醇定容配制成500 mg·L-1的蒽的正丁醇溶液作為母液，避光保存，其他化學品均為分析純。

1.2 試供土壤處理與蚯蚓培養

將土壤分為兩個平行處理組，即不做處理的自然土壤（簡稱自然土）和在高壓滅菌鍋121 ℃條件下，滅菌3 h 的滅菌土壤（簡稱滅菌土）。滅菌土用平板劃線法判斷是否滅菌完全（羅舒文等，2020）。

在無菌操作臺上，取滅菌土和自然土各2 kg，分別裝入4 個滅菌的陶瓷盆（上口直徑28 cm、底座直徑18 cm、高度17 cm）中，每個陶瓷盆裝土1 kg，用無菌水將土壤保持在最大田間持水量的60%。通過對比試驗前期設置的不同污染濃度土壤試驗效果以及借鑒前人的研究經驗（井永蘋，2013；史志明，2014；Zhu，2022），土壤中蒽的濃度過低時，無法達到試驗效果，過高時則對土壤生物存在不可忽略的影響。因此試驗土壤中蒽的污染濃度設置為10 mg·kg-1。具體方法為：取每組少部分供試土壤分別加入20 mL 母液（500 mol·L-1蒽的正丁醇溶液），再采用逐級等份混合法充分混勻，待有機溶劑充分揮發后，將其分別拌入各組供試土壤中貼上標簽，室溫平衡24 h 后放蚯蚓。試驗設計如下：滅菌對照（SS）、自然對照（OS）、滅菌土壤+15 條蚯蚓（SE）、自然土壤+15 條蚯蚓（OE），每組處理設置3 個重復。

每組處理陶瓷盆均用紗布蓋上，放入溫度為25 ℃恒溫培養箱里通風避光培養40 d；每天用無菌水補充因蒸發損失的水分一次，分別于培養第0、10、20、30 天及第40 天時取樣，測定土壤pH、有機質（SOM）和腐殖質組分胡敏酸（HA）、胡敏素（HM）和富里酸（FA）的質量分數及蒽的含量。在第40 天培養結束時，取SE、OE 處理組中的蚓糞，將其儲存于-80 ℃冰箱中，用于微生物群落結構分析。

1.3 土壤理化性質測定

采用電位法測定土壤pH（鮑士旦，2000）。將過2 mm 篩的風干土樣5.00 g 置于25 mL 燒杯中，并加入12.5 mL 去二氧化碳蒸餾水，充分攪動，使土樣充分分散。靜置2 h 后，取上清液，用校準后的雷磁pH 計（型號為PHSJ-3F，上海儀電科學儀器股份有限公司）測定pH 值。

土壤有機質采用重鉻酸鉀外加熱法進行測定。取風干土壤0.3 g 置于消煮管中，加入體積分數為98%的硫酸和重鉻酸鉀溶液（0.8 mol·L-1）各5 mL，并在170—180 ℃下消煮5 min。消煮后，冷卻至室溫倒入錐形瓶中，用50 mL 蒸餾水多次沖洗消煮管，并將清洗液轉入錐形瓶。加入2—3 滴鄰菲羅啉作為指示劑，用0.2 mol·L-1的硫酸亞鐵滴定至磚紅色，按硫酸亞鐵的用量推算土壤有機質的含量。

參照標準方法（中國標準出版社，2007）對土壤中腐殖質組分進行測定。取10 g 風干土樣研磨后過0.149 mm 篩，裝于小廣口瓶中備用。將5 g 土樣置于250 mL 錐形瓶并加入100 mL 浸提劑（均為0.1 mol·L-1的焦磷酸鈉和氫氧化鈉混合液），加塞震蕩5 min 后，用沸水煮1 h。搖勻并用離心機離心澄清，取上清液于錐形瓶中待測。隨后操作同有機質的測定。

吸取10 mL 浸出液移入液試管中（盛有少量石英），用0.5 ml·L-1硫酸中和pH 為7，使溶液出現混濁為止。用水浴蒸發至近干，用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定胡敏酸和富里酸總碳。

取40 mL 浸出液移入錐形瓶中，加熱近沸，用0.5 mol·L-1硫酸調pH 至2—3，出現絮狀沉淀后，用80 ℃水浴保溫半小時，靜置過夜。取細孔濾紙用0.025 mol·L-1硫酸濕潤，過濾上述清液，再用0.05 mol·L-1硫酸洗滌沉淀多次。用熱的0.05 mol·L-1氫氧化鈉洗滌溶解沉淀，經細孔濾紙過濾移入100 mL容量瓶，用水定容并搖勻。取20 mL 溶液移入試管中，用0.5 mol·L-1硫酸調到pH 為7，出現渾濁為止。用水浴蒸發至近干，用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定胡敏酸碳量。

胡敏素含量采用差減法計算。

采取殘渣烘干-質量法測定（鮑士旦，2000），取過篩風干土樣15 g 配置水土比為5∶1 的土壤浸出液，吸取50 mL 土壤浸出液放于烘干的瓷蒸發皿內，在水浴中蒸干。用150 g·L-1的H2O2使殘渣濕潤，繼續蒸干，反復用H2O2處理，使殘渣全為白色。再將殘渣和蒸發皿放于105 ℃烘箱中烘干1 h，取出冷卻后稱質量。將蒸發皿和殘渣再次烘干0.5 h，取出放在干燥器中冷卻稱質量。用兩次質量計算出土壤水溶性鹽總量。

1.4 土壤中蒽含量的測定及相關計算

土壤中提取蒽參照姚炎紅等（2016）的方法，采用索氏提取法提取和濃縮。樣品中蒽的含量測定參照代軍帥等（代軍帥等，2018）的方法，用高效液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity II）測定。測定條件為：Φ4.6mm×250mm C18柱，進樣量為10 μL，甲醇（A 相）和超純水（B 相）作為流動相，流速0.6 mL·min-1，色譜柱維持在30 ℃下進行色譜分析，分析波長274 nm。配置濃度為50、100、200、500和1 000 μg·L-1的標準系列獲得標準曲線，校準曲線的相關系數大于0.995。該方法下回收率為82.6%—97.7%，檢出限為4.2 μg·kg-1，（信噪比S/N=3）。

1.5 土壤微生物群落的高通量測序

采用BioFast Soil Genomic DNA Extraction Kit（BIOEER，中國杭州）試劑盒對培養40 d 的不同處理土壤微生物總DNA 進行提取，利用核酸蛋白定量檢測儀測定DNA 的濃度，采用1%瓊脂糖凝膠電泳評價DNA 質量。提取的土壤總DNA 利用引物（338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對V3—V4 區域進行PCR 擴增。反應體系為：2×Tap PCR Master Mix 10.0 μL、引物2.0 μL、模板DNA 1.0 μL，超純水（用于將體積補至20.0 μL）。擴增條件為：95 ℃下，進行3 min 預變性，再進行30 s 變性，隨后55 ℃下進行30 s 退火，最后在72 ℃下進行45 s 延伸，循環27 次，最后于72 ℃下進行10 min 的延伸。用質量分數2%瓊脂糖凝膠回收擴增后的產物并進行檢測，最后送至美吉測序平臺進行測序。使用Flash 軟件對高通量所得數據進行拼接，過濾拼接得到的序列，再使用Uchime 軟件鑒定并去除嵌合體序列，獲得最終有效數據。使用QIIME 軟件對序列在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OUT。所有的OTUs 分類學注釋在Silva數據庫（https://www.arbsilva.de/）平臺完成。使用QIIME 中核糖體數據庫獲得科水平上的細菌群落物種豐富圖。使用QIIME 基于Euclidean 算法得到聚類熱圖。

1.6 數據處理與分析

蒽的降解效率通過公式來計算：

式中：

E——蒽的降解效率；

A0——第0 天土壤蒽含量（g·kg-1）；

Ai——第i天土壤蒽含量（g·kg-1）；

i——培養時間（d）。

利用SPSS 25.0 對試驗理化數據（蒽的降解效率、土壤理化性質）進行正態分布和方差齊檢驗，并且對數據進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。用Duncan’s 法對不同處理間進行多重比較（P＜0.05）檢驗不同處理間的顯著差異性。利用Origin 2022 完成環境因子（pH、有機質等）的柱形圖繪制。以Spearman 和Pearson 為基礎，采用Cytoscape 軟件將微生物、蒽殘留濃度和環境因子之間的相互作用通過共現網絡可視化。

2 結果與分析

2.1 不同處理下蒽的降解效率

整個培養期內，所有處理中土壤蒽的降解效率均呈顯著上升趨勢（圖1）。自然對照（OS）中蒽的降解效率始終高于滅菌對照（SS），添加蚯蚓可顯著提升自然土壤（SE）和滅菌土壤（OE）中蒽的降解效率。實驗結束時（40 d），SS 處理中蒽的殘留濃度最高（8.67 g·kg-1），降解效率僅為17.7%。OS 處理中蒽的殘留濃度為6.29 g·kg-1，降解效率為40.7%。OS 處理中蒽的降解效率比SS 處理中蒽的降解效率高23.0%，表明沒有蚯蚓的自然土壤中蒽的降解以生物降解為主（23.0%），而不是非生物降解（17.7%）。添加蚯蚓可以顯著加速土壤中蒽的降解，自然土壤中添加蚯蚓處理（OE）的蒽的殘留濃度最低為3.94 g·kg-1，降解效率高達62.1%，滅菌土壤添加蚯蚓處理（SE）的殘留濃度最低為5.27 g·kg-1，降解效率為50.4%。結果表明：蚯蚓強化非生物降解和腸道菌群作用共同的效果（32.7%）高于蚯蚓強化土著微生物降解的效果（21.4%）。

圖1 不同處理蒽降解效率隨時間的變化Figure 1 Variation of anthracene degradation efficiency with time for different treatments

2.2 土壤理化性質在不同處理下的變化

圖2 顯示了土壤pH 值、有機質、富里酸、胡敏酸、胡敏素和全鹽量的在整個培養過程中的變化情況。土壤pH 值（圖2a）在處理SE 和OE 中始終呈下降趨勢，而對照SS 和OS 中土壤pH 值變化不明顯。實驗結束時（40 d），添加蚯蚓的處理（SE 和OE）土壤pH 值分別為7.52 和7.34，均顯著低于對照SS 和OS（7.77 和7.70）的pH 值（P＜0.05）。添加蚯蚓可以顯著降低土壤的有機質含量，實驗結束時（40 d），自然土壤添加蚯蚓處理（OE）中有機質含量為（19.6 g·kg-1），顯著低于滅菌土壤添加蚯蚓處理（SE）中的有機質含量（21.7 g·kg-1），二者均顯著低于自然和滅菌土壤對照中的有機質含量（25.4 g·kg-1和24.6 g·kg-1）。添加蚯蚓顯著提升了土壤腐殖質各組分胡敏素、胡敏酸和富里酸的含量（P＜0.05），實驗結束時，處理OE 中胡敏素、胡敏酸和富里酸的含量分別增加了2.94、0.14 和0.63 g·kg-1，處理SE 中胡敏素、胡敏酸和富里酸的含量分別增加了2.40、0.34 和0.68 g·kg-1。

圖2 不同處理土壤理化性質隨時間的變化Figure 2 Variation of soil physicochemical properties with time for different treatments

2.3 不同處理的土壤微生物群落結構

在科水平上，將相對豐富度前27 的細菌科選為優勢細菌科，剩余歸為其他（Others）。從圖3a 中可以看出，在 OS 處理中以 unclassified_p__Acidobacteria、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）、unclassified_c__Betaproteobacteria、unclassified_p__Gemmatimonadetes_d__Bacteria、黃色單胞菌科（ Xanthomonadaceae）、嗜甲基菌科（Methylophilaceae）和環狀菌科（Cyclobacteriaceae）為主，約占樣品總豐度的38.2%，其中土壤中的假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、伯克氏菌科（ Burkholderiaceae）和氣單胞菌科（Aeromonadaceae）等微生物均占較低的樣品總豐度。在OE 處理中以unclassified_p__Acidobacteria、unclassified_c__Betaproteobacteria、unclassified_p__Gemmatimonadetes_d__Bacteria、伯克氏菌科、黃色單胞菌科和氣單胞菌科為主，約占樣品總豐度的34.7%。與OS 處理相比，OE 處理使伯克氏菌科、氣單胞菌科的豐度分別提高了238%、730%。在蚯蚓糞（SE-cast）中，以叢毛單胞菌科、假單胞菌科、環狀菌科、紅桿菌科（Rhodobacteraceae）、伯克氏菌科和氣單胞菌科為主，占樣品總豐度的38.3%。圖3b 為不同處理及蚓糞的細菌科水平微生物群落結構聚類熱圖。其中樣品SE 處理土壤和SE_cast 的微生物群落結構相近，但與OE_cast（蚯蚓糞）、OE處理和OS 處理分離。其中氣單胞菌科、黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、伯克氏菌科在OS 處理中的豐度較低，而在OE、OE_cast 中的豐度逐級增加。綜上結果表明，自然土中土著微生物伯克氏菌科、氣單胞菌科等微生物豐度均比較低，而添加蚯蚓后，改變了土壤中微生物的群落結構以及提升了土壤中土著微生物伯克氏菌科、氣單胞菌科等微生物的豐度。同時蚯蚓腸道中還存在伯克氏菌科、鞘脂單胞菌科、黃桿菌科和氣單胞菌科等腸道微生物，這些微生物通過蚓糞從蚯蚓腸道定植到土壤當中，進一步的改變了土壤中的微生物群落結構和豐度。

圖3 不同處理微生物在科水平上的相對豐度與群落結構Figure 3 Relative abundance and community structure of microorganisms at the family level in different treatments

2.4 蚯蚓影響下環境因子、土壤微生物及蒽的殘留濃度的相關性

通過網絡分析圖（圖4）來探討了土壤中的微生物、環境因子和土壤中蒽的殘留濃度之間的聯系。該網絡圖由17 個節點（10 種微生物科、蒽殘留濃度和6 個環境因子）和16 個邊緣組成。網絡分析圖中顯示，微生物均與蒽的殘留濃度呈負相關，其中氣單胞菌科、鞘脂單胞菌科、黃桿菌科和伯克氏菌科與蒽的殘留濃度為顯著負相關（P=0.02）。環境因子中，胡敏酸、胡敏酸和富里酸與與蒽的殘留濃度呈負相關，pH、有機質和含鹽量與蒽的殘留濃度呈正相關，其中pH、有機質與蒽的殘留濃度呈顯著正相關（P=0.03 和P=0.04）。

圖4 環境因子、土壤微生物與蒽的殘留濃度間的網絡分析圖Figure 4 Network analysis diagram of the residual concentration of anthracene among environmental factors,soil microorganisms

3 討論

本試驗探討添加蚯蚓對濱海鹽堿土壤中蒽降解效率的影響，以及蚯蚓在PAHs 污染土壤修復中的作用機制。在試驗第40 天時，不同處理之間蒽的降解效率依次排序為：SS (17.7%)＜OS (40.7%)＜SE(50.4%)＜OE (62.1%)（圖1），表明添加蚯蚓可顯著促進濱海鹽堿土壤中蒽的降解（P=0.001）。蚯蚓能夠對有機污染物產生富集作用，并且挖掘和吞食等生命活動改變土壤理化性質、微生物數量和活性，對蒽在土壤中的降解產生影響。在我們前期的研究結果證明，蚯蚓通過富集在體內的有機污染物量較少，對污染物總體的去除效果產生的影響較?。↙in et al.，2016b），降解效果主要來源于非生物降解和微生物降解。并且有研究表明，蚯蚓對PAHs 等有機污染物的富集能力較弱，其體內富集量只占去除總量的很少一部分，并不是去除污染物的主要途徑（Ma et al.，1998；井永蘋，2013）。在試驗中，蒽進入土壤后，與土壤組分容易緊密結合，限制了蒽在土壤中遷移、傳質和衰減（蔣緒洋，2022），降低了蒽的可提取性和生物有效性（Kelsey et al.，1997）。并且，在濱海鹽堿土壤中，微生物的生長由于鹽脅迫的影響受到抑制，使PAHs 在鹽堿土中的微生物降解變得更為困難（Wang et al.，2012）。

在40 d 時，OE 處理和SE 處理的含鹽量分別下降了0.12、0.16 g·kg-1，顯著低于OS 處理和SE處理（P=0.03），說明蚯蚓降低了土壤含鹽量。有研究表明，蚯蚓能夠在含鹽量較高的鹽堿土中存活（吳文良等，2001），具有改良鹽堿地的效果（伍玉鵬等，2013）。這可能是因為蚯蚓的生命活動間接的促進了土壤鹽分自然淋洗的過程（張濤等，2017），以及蚓糞中的Ca2+與土壤中的Na+交換量增加，降低了土壤中Na+含量，進而導致土壤全鹽量下降（Oo et al.，2015），與于英釵等（2019）的研究結果一致。此外，SE 處理中蒽的降解效率比SS 處理提高了32.7%，說明蚯蚓能夠在滅菌條件下促進蒽的降解，這主要為蚯蚓強化非生物降解和腸道菌群共同作用的效果。在SE 處理中有機質比SS 處理顯著下降了3.67 g·kg-1（圖2b）（P=0.001），胡敏素、富里酸和胡敏酸分別顯著提升了1.65、0.66 和0.40 g·kg-1（圖2c—e）（P=0.04、P=0.01 和P=0.011）。這主要是因為蚯蚓改善土壤結構、通氣性和疏水性，使土壤孔隙度變大，增加土壤中的O2含量和濕度（井永蘋，2013），并且促進土壤腐殖質的形成和富集（張與真等，1981；王慶洲等，2013），使土壤可溶性有機碳增加（Kalbitz et al.，2006）。而在可溶性有機碳中含有羧基等活性官能團（Zhang et al.，2022），羧基等活性官能團被Tian et al.（2023）證明在PAHs的氧化降解過程中發揮著關鍵作用。并且Xu et al.（2013）研究發現土壤中O2、水分的增加，均能增強土壤表層的PAHs 光解。這就表明添加蚯蚓影響土壤中O2含量和水分，并且增加土壤中活性官能團的含量，進而影響PAHs 在土壤中的非生物降解。在本實驗中，土壤有機質含量與土壤中蒽的殘留濃度呈顯著正相關（P=0.04）（圖4），表明隨著有機質含量的下降，土壤中蒽的降解效率增加，這很好的吻合了我們的研究結果。此外，土壤pH 是影響土壤污染物修復的重要因素。在第40 天時（圖2a），不同處理間的pH 值差異顯著（P=0.001）。OE 處理的pH 比OS 處理下降0.36 個單位，SE 處理的pH比SS 處理下降0.25 個單位。這主要是因為蚯蚓分泌體表粘液等生命活動對土壤的酸堿性起到調節作用（Hao et al.，2018；Luo et al.，2022）。蚯蚓可以沉積pH 值較高的土壤顆粒，顯著改變土壤微環境，中和土壤pH 值（Lin et al.，2016b），提高土壤的保水能力。已有研究表明，PAHs 類污染物在偏中性土壤中具有較高的生物有效性，從而促進PAHs 的生物降解（K?stner et al.，1998）。例如，Kim et al.（2005）研究表明，將土壤的pH 值調整到7.0 后，PAHs 的降解得到了有效的加強，甚至一單位的pH 值變化能使菲的降解效率增加了4 倍。在本實驗中，土壤pH 與土壤中蒽的殘留濃度呈顯著正相關（P=0.03）（圖4），表明隨著pH 的下降，土壤中蒽的降解效率增加，這很好的吻合了我們的研究結果。

土壤微生物是有機物污染土壤修復的主要因素，在環境中的PAHs 污染修復方法主要以微生物降解為主（Jacques et al.，2008；Moscoso et al.，2012）。如圖3b 所示，樣品SE 處理土壤和SE_cast（蚯蚓糞）中的微生物群落結構相近，說明SE 處理中的微生物均為蚯蚓通過排泄定植的腸道微生物，并且其中含有伯克氏菌科、氣單胞菌科和鞘脂單胞菌科等PAHs 降解菌（宋興良等，2010；于瑤瑤等，2015；黃興如等，2016；閆雙堆等，2021），說明蚯蚓能夠通過蚓糞將其腸道中功能微生物定植到土壤當中。而OE 處理和OS 處理土壤微生物群落結構相近，與OE_cast（蚯蚓糞）具有差異，說明OE 處理中，蚯蚓影響了土壤中微生物的群落結構。其中OE_cast中的微生物豐度相對較高，主要是因為蚯蚓糞中富含氮、磷、鉀、微量營養素和酶等（Yadav et al.，2011），促進了微生物的生長（Pramanik et al.，2010)，并且蚯蚓糞還會影響土壤微生物的相互作用（Singh et al.，2020；Zhao et al.，2020），進而影響到微生物群落結構。在本實驗中，相比OS 處理，OE 處理中的土壤微生物的豐度增加，其中伯克氏菌科、氣單胞菌科等降解菌的豐度分別提高了238%、730%。這主要是因為蚯蚓改善了土壤環境（袁向華等，2017），以及蚓糞定植的微生物與土著微生物相互作用（Lin et al.，2018），促使土壤中部分微生物的生長繁殖，從而影響土壤微生物群落結果。并且有研究表明，添加蚯蚓影響了土壤中污染物降解微生物的豐度（潘聲旺，2009），從而促進有機污染物的降解（Lin et al.，2021）。在本試驗中，土壤蒽的殘留濃度與伯克氏菌科、氣單胞菌科、鞘脂單胞菌科和黃桿菌呈顯著負相關（P=0.02、P=0.03、P=0.02 和、P=0.01），表明隨著伯克氏菌科、氣單胞菌科、鞘脂單胞菌科和黃桿菌豐度的增加，土壤中蒽的降解效率增加，這與我們的研究結果相符。

4 結論

1）蚯蚓可以顯著強化濱海鹽堿農田土壤中蒽的降解，其中包括強化非生物降解和微生物降解。強化降解效果主要源于土著微生物豐度的提升和蚯蚓腸道微生物的釋放等微生物降解作用。

2）蚯蚓可強化土壤原有降解微生物伯克氏菌科和鞘脂單胞菌科等微生物的豐度，加速土壤蒽的生物降解。蚯蚓通過蚓糞釋放腸道降解菌假單胞菌科、伯克氏菌科和氣單胞菌科，并可定植降解菌假單胞菌科、伯克氏菌科和鞘脂單胞菌科到土壤中，進而可加速土壤蒽的生物降解。

3）蚯蚓通過降低土壤pH 值，促進土壤有機質分解為腐殖質等改變環境因子的作用，間接加速了濱海鹽堿地土壤中蒽的非生物降解。