四環素對不同品種蔬菜毒性閾值及其敏感性分布

黃世聰，陳麗珂，張政杰，陳科華，陳澄宇，曾巧云*

1. 華南農業大學資源環境學院，廣東 廣州 510642；2. 廣州造紙集團有限公司，廣東 廣州 511462

四環素（TC）是畜禽糞肥中普遍存在的典型抗生素（Zhou et al.，2020），長期大量施用畜禽糞肥勢必導致農業土壤TC 污染（曾巧云等，2018；丁丹等，2023；Wu et al.，2023）。土壤TC 污染不僅能夠誘導、篩選和滋生出抗生素耐藥菌（ARB），危害人類健康和生態安全（Guo et al.，2021；Wang et al.，2022）。同時，農田土壤TC 污染還會破壞作物葉綠體結構和葉肉細胞超微結構，降低細胞膜通透性，引起作物的氧化應激，從而抑制作物的生長發育（Khan et al.，2021）。蔬菜生產基地強調畜禽糞肥等有機肥的施用，較高的復種指數和施肥頻率導致蔬菜基地土壤TC 污染尤為嚴重（Sun et al.，2021；Li et al.，2023）。施用畜禽糞肥蔬菜基地土壤中TC含量為102 μg·kg-1，超過喹諾酮類（86 μg·kg-1）、磺胺類（1.1 μg·kg-1）和大環內酯類（0.62 μg·kg-1）的含量（Li et al.，2023），也超出了獸藥國際協調委員會（VICH）籌劃指導委員會提出的土壤抗生素生態毒害效應的觸發值（100 μg·kg-1）。因此，TC 污染對蔬菜生長發育的影響應受到重視。

種子發芽率、芽伸長和根伸長經常被作為環境污染物對受試作物毒性效應的關鍵指標（An et al.，2009）。目前，國內外關于TC 等抗生素對作物毒性的研究方法也主要是通過種子萌發實驗，考察抗生素污染脅迫下作物種子發芽和生長情況，然后綜合評價其毒性（Luo et al.，2019a；張天瑩等，2021；趙肖瓊等，2022）。10—100 mg·L-1的TC 處理下，小麥種子萌發芽長與根長分別下降7%—73%和41%—84%（Han et al.，2021）。但作物對TC 污染的毒性響應存在種間和種內差異（張乙涵等，2014；Luo et al.，2019b）。以毒性數據為基礎的物種敏感性分布法（Species sensitivity distributions，SSD）不僅能體現多物種間的敏感性差異，降低將單一物種的毒理學數據外推到其他物種的不確定性，還可以利用適當的模型和統計分布軟件對毒性數據進行擬合，從而獲得環境中95%的物種不受危害時的最大污染物濃度（HC5），并在此基礎上計算污染物的預測無效應濃度值（PNEC）（Wan et al.，2020；Gu et al.，2021；Kamo et al.，2022），是目前環境污染物生態風險評估的重要方法。但目前關于TC 污染對某一特定區域多種品種蔬菜毒性閾值及物種敏感性分布的研究報道還較少（張乙涵等，2014）。

因此，本文采用室內培養方法，選取TC 作為代表性抗生素，調查其對珠三角地區廣泛種植的蔬菜品種種子發芽率、芽長和根長的影響；并選用影響程度較大的指標，采用Log-logistic 分布模型，對TC 的毒性劑量-效應關系進行擬合，獲得TC 污染對不同品種蔬菜毒性的劑量-效應曲線，并計算其相應的IC50和IC10；以IC50為評價參數，采用SSD法，構建TC 污染對不同品種蔬菜的SSD 曲線，并獲得基于保護95%的蔬菜品種的TC 毒性閾值（HC5）和無效應濃度（PNEC），從而為土壤TC 污染的生態風險評估提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

四環素（tetracycline，TC）購買于阿拉丁試劑公司，純度級別為USP（美國藥用級別）。供試蔬菜種子購自廣東省農業科學院蔬菜研究所種子市場，通過種子發芽預實驗棄去發芽率小于90%的品種，最終確定9 種南方常見蔬菜品種種子作為后續實驗對象，包括，白菜（BrassicapekinensisL.）、白瓜（CucurbitapepoL.）、菜心（BrassicaparachinensisL.）、豆角（Vigna unguiculataL.）、花葉芥菜（BrassicajunceaL.）、芥蘭（BrassicaalboglabraL.）、青瓜（CucumissativusL.）、線椒（CapsicumannuumL.）和玉米（ZeamaysL.）。

1.2 實驗方法

種子發芽實驗采用培養皿濾紙法。根據預實驗結果，設置正式實驗溶液中TC 的質量濃度為0、0.1、1、10、30、50、100、300 和500 mg·L-1。用質量濃度為0.1%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒10 min，用去離子水沖洗2 遍，取出置于棉紗布內。挑選大小相近、品相良好、籽粒飽滿的種子均勻排列在鋪有兩層濾紙的培養皿（直徑為90 mm）中，視種子大小確定放入種子粒數，白菜、菜心、花葉芥菜和芥蘭放置20 粒種子，其余品種均放置15 粒種子，保持種子的朝向一致，然后分別加入不同質量濃度TC 溶液10 mL。每個處理設置3 個重復。

以上步驟處理好后蓋上玻璃培養皿，稱重并記錄重量，然后將培養皿放置于30 ℃的培養箱避光培養。每日觀察種子的萌發情況，并采用恒重法來維持培養液的體積。當對照組內種子發芽率大于90%并且45%—55%的種子的芽長大于20 mm 時停止培養（張乙涵等，2014）。

取出培養皿，統一切斷根和芽，使用電子示數游標卡尺測定各品種蔬菜種子的芽長和根長，并以對照組樣品的芽長和根長為基準（100%），計算各處理種子相對芽長和相對根長，具體見式（1）和式（2）。

式（1）中：

l1——各處理種子相對芽長，%；

ls——各處理種子的芽長，cm；

ls0——對照組種子的芽長，cm。

式（2）中：

l2——各處理種子相對根長，%；

lr——各處理種子的根長，cm；

lr0——對照組種子的根長，cm。

1.3 TC 對不同品種蔬菜種子毒性的劑量-效應曲線擬合及修正

TC 對不同品種蔬菜種子毒性的劑量-效應關系曲線采用Log-logistic 分布模型進行擬合，具體見式（3）。然后使用OriginPro 8 的定位功能，尋找當y分別為90%和50%時，ρ的數值，即IC10和IC50。

式中：

y——各處理種子相對根長，%；

y0、b——擬合的參數，由軟件自動生成；

ρ——TC 質量濃度值，mg·L-1；

m——ICρ的自然對數值，由軟件自動生成。

當TC 在低質量濃度時會對種子萌發和生長產生刺激效應，可采用低劑量污染物刺激效應（hormesis）曲線進行修正，并將橫坐標軸改為以10為底的對數坐標軸。擬合可用OriginPro 8 軟件來完成，方程如式（4）所示。

式中：

Y——植物相對含量或相對生物量，%；

ρ——TC 的質量濃度，mg·L-1；

a、b、c、d——方程參數，由曲線擬合時自動生成。

當k為10、50 時，參數c定義為IC10及IC50，由曲線擬合時自動生成。

1.4 TC 對不同品種蔬菜毒性的敏感性分布曲線擬合

目前常用于擬合SSD 曲線的分布模型包括Burr-Ⅲ、Log-logistic、Log-normal 以及Log-triangular等。根據文獻研究結果（Li et al.，2018），本文采用Burr-Ⅲ模型（式 (5)）及相應BurrliOZ 統計軟件，選用IC50作為物種敏感性分布的指標（根據公式 (3)和 (4) 得到IC50），獲得TC 對不同品種蔬菜毒性的敏感性頻次（SSD）分布曲線。

式中：

ρ——溶液中TC 的質量濃度，mg·L-1；

b、c、k——函數的3 個參數，由曲線擬合時自動生成。

1.5 生態風險閾值（HC5）和預測無效應濃度（PNEC）的計算

根據1.4 中物種敏感性分布曲線，計算得到TC的HC5，然后根據式（6）獲得TC 的PNEC（Gu et al.，2021）。

式中：

ρ(PNEC)——TC 的預測無效應質量濃度，μg·L-1；

ρ(HC5)——TC 的生態風險閾值，μg·L-1；

K——評價因子，在生態毒性試驗中取值通常為5（Gredelj et al.，2018）。

1.6 數據處理和分析

采用Microsoft Excel 2016 對實驗數據進行整理，文中所有實驗數據均為平均值±標準誤（n=3）；使用SPSS 17.0 對數據進行單因素方差分析及多重比較（P=0.05）。

2 結果與分析

2.1 TC 污染對蔬菜種子發芽率的影響

TC 污染對試驗品種蔬菜種子發芽率的影響見圖1。

圖1 不同質量濃度TC 污染處理下蔬菜種子的發芽率Figure 1 Germination rates of vegetables seeds under TC contamination treatment

從圖1 可以看出，隨TC 污染質量濃度的增加，9 種試驗品種蔬菜種子的發芽率總體呈下降趨勢，且隨蔬菜品種的不同而不同。除玉米外，其余8 種蔬菜發芽率保持在75%以上。當TC 質量濃度為100 mg·L-1時，除白瓜種子的發芽率低于90%以外，其他品種蔬菜種子發芽率均大于90%；當TC 質量濃度為500 mg·L-1時，除白瓜、芥蘭和玉米種子的發芽率低于80%以外，其他品種蔬菜種子發芽率均大于80%。

2.2 TC 污染對蔬菜種子芽伸長的影響

試驗品種蔬菜種子芽長對TC 污染的響應（見圖2）可以歸為兩種類型。第一種類型為敏感型。低質量濃度TC 處理下，種子芽長即呈現出顯著下降，且種子芽長下降程度隨TC 質量濃度的增加而增加，如白瓜和青瓜種子。當TC 質量濃度為0.1 mg·L-1時，種子芽長分別是對照處理的73.4%（白瓜）和77.9%（青瓜），差異顯著；當TC 質量濃度為10 mg·L-1時，種子芽長僅為對照處理的42.3%（白瓜）和57.8%（青瓜）。第二種類型為低質量濃度促進高質量濃度抑制型，即低質量濃度TC 處理對種子芽伸長具有一定的促進作用，高質量濃度TC處理抑制種子芽伸長。本實驗中，除白瓜和青瓜種子以外，其他品種蔬菜種子均屬于第二種類型。以花葉芥菜為例，當TC≤1 mg·L-1時，對種子芽長具有一定的促進作用，相對芽長大于對照處理，TC 質量濃度為1 mg·L-1時，相對芽長為對照處理的111.2%，差異顯著；但當TC＞1 mg·L-1時，對種子芽長具有抑制作用，且抑制程度隨TC 質量濃度的增加而增加，當TC 質量濃度為10 mg·L-1和100 mg·L-1時，相對芽長分別為對照處理的84.1%和51.2%，差異顯著。

圖2 不同質量濃度四環素污染處理下蔬菜種子的相對芽長Figure 2 Relative shoot elongation of vegetables seeds under different TC contamination treatment

2.3 TC 污染對蔬菜種子根伸長的影響

試驗品種蔬菜種子根伸長對TC 污染的響應類型（見圖3）與芽伸長相似。第一種類型為敏感型，如白瓜、豆角、青瓜和玉米種子。以白瓜種子為例，當TC 質量濃度為0.1 mg·L-1和1 mg·L-1時，白瓜種子相對根長分別為45.5%和56.7%，顯著低于對照處理。第二種類型為低質量濃度促進高質量濃度抑制型，如白菜、菜心、花葉芥菜、芥蘭和線椒種子。以芥蘭種子為例，當TC 質量濃度為0.1 mg·L-1和1 mg·L-1時，相對根長分別為153.1%和140.1%，顯著高于對照處理；而當TC 質量濃度為100 mg·L-1和300 mg·L-1時，相對根長分別為23.8%和10.9%，顯著低于對照處理。

圖3 不同質量濃度四環素污染處理下蔬菜種子的相對根長Figure 3 Relative root elongation of vegetables seeds under different TC contamination treatment

從圖2 和圖3 可以看出，TC 污染對試驗品種蔬菜種子根長的影響程度大于芽長。本實驗質量濃度范圍內，TC 污染對豆角種子芽長的影響范圍為112.0%—43.8%，而對根長的影響范圍為96.0%—24.3%；對玉米種子芽長的影響范圍為73.3%—129.4%，而對根長的影響范圍為84.7%—26.5%。因此，本文以蔬菜種子根長作為測試終點來評價TC污染對不同品種蔬菜的毒性閾值。

2.4 TC 污染對不同品種蔬菜種子根伸長的劑量-效應關系

經污染物低劑量刺激效應修正后，TC 對不同品種蔬菜種子根伸長的劑量-效應的關系曲線見圖4，并獲得10%和50%根長抑制質量濃度及置信區間，見表1。

表1 基于蔬菜根長的TC 毒性閾值與95%的置信區間Table 1 Toxicity thresholds of TC based on vegetable root elongation and 95% confidence intervals

圖4 蔬菜根長與四環素添加質量濃度的劑量-效應曲線Figure 4 Dose-response curves of added TC on root elongation of vegetables

如圖4 所示，隨著溶液中TC 質量濃度的增加，9 種試驗品種蔬菜種子根長逐漸下降。當TC 質量濃度為1 mg·L-1時，根長開始急劇下降；當質量濃度達到500 mg·L-1時，除豆角和玉米種子以外，其他品種蔬菜種子相對根長低于10%，甚至接近“0”，基本停止生長。

從表1 可以看出，TC 對不同品種蔬菜的毒性閾值差異較大，IC50值最小為2.98 mg·L-1（青瓜），最大值為83.60 mg·L-1（玉米）；IC10值最小0.03 mg·L-1（玉米），最大值為5.63 mg·L-1（芥蘭）；且從IC50和IC10大小排序來看，不同品種蔬菜對TC的敏感性程度并非一致，如，玉米種子的IC50最大，但IC10最小。

2.5 TC 污染對不同品種蔬菜種子毒性的敏感性分布及HC5、PNEC

從TC 污染對不同品種蔬菜種子毒性（基于根長IC50）的SSD 曲線（圖5）可以看出，不同品種蔬菜對TC 污染毒性的敏感性頻次分布擬合效果較好，其敏感性分布頻次的大小順序為：玉米＞菜心＞芥蘭＞豆角＞白菜＞線椒＞花葉芥菜＞白瓜＞青瓜。即，玉米種子對TC 污染的耐受性最強，其次為菜心；青瓜種子對TC 污染最敏感。

圖5 不同品種蔬菜種子基于根長IC50的SSD 曲線Figure 5 SSD curve of different species of vegetables seeds based IC50 of their root elongation

Burr-Ⅲ分布模型擬合結果表明，本實驗中，TC對不同品種蔬菜種子的HC5為9.64 μg·L-1，PNEC為1.93 μg·L-1。

3 討論

本實驗設置質量濃度范圍內，TC 污染對9 種蔬菜種子發芽率具有不同程度的抑制作用，而對于除白瓜和青瓜種子的芽長和根長，以及豆角和玉米根長以外的指標，則表現出低質量濃度TC 具有促進作用，高質量濃度TC 具有抑制作用。0.1 mg·L-1的TC 污染處理下，菜心種子的相對芽長和相對根長分別為123.2%和125.6%，顯著高于對照處理；1 mg·L-1的TC 污染處理下，線椒種子的相對芽長和相對根長分別為119.4%和115.0%，顯著高于對照處理。這可能是由于低質量濃度的抗生素污染提高了植物的應激能力，促使植物加強自身蛋白質的合成以抵抗抗生素的毒害作用，從而表現出低質量濃度抗生素對根伸長的促進作用（陳敏杰等，2019）。這種抗生素對植物根長的“低促高抑”的現象也存在于前人的研究中。如，土霉素（OTC）質量濃度為0—9.38 mg·L-1時，小白菜、甘藍、大白菜、玉米、豇豆、生菜和黃瓜等蔬菜種子相對根長均有促進作用，而當OTC 質量濃度達到37.5 mg·L-1時，根伸長開始受到抑制，且其抑制程度隨OTC 質量濃度的升高而增加（姚洪偉等，2019）。

一般來說，污染物對種子萌發指標的影響程度為：根長＞芽長＞發芽率，即，根長對環境污染物的敏感程度最高，發芽率對環境污染物的敏感程度最低。這可能是由于植物的根系直接暴露在外界環境中，與污染物直接接觸，對污染物的響應也最直接（保瓊莉等，2020；李柯等，2020；周睫雅等，2020）；而種皮構成了種胚與外界環境之間的屏障，阻止環境中的污染物進入種皮內部，使得發芽率受外界污染物的影響程度最?。ˋraújo et al.，2005）。芽長對環境污染物的敏感程度介于發芽率和根長之間，這可能是由于種子發芽時可以從胚內獲取養分，即使在根的生長受到抑制時，芽的伸長還可以吸收種子的養分而不受抑制（金彩霞等，2009）。已有文獻研究表明，TCs 污染對種子萌發的影響也表現出同樣的規律，即，根長＞芽長＞發芽率（鮑艷宇等，2008；葛成軍等，2012）。如，OTC 和金霉素（CTC）污染（50 mg·L-1）下，白菜種子根伸長分別下降了60%（OTC）和30%（CTC），而種子發芽率的響應不明顯（葛成軍等，2012）；TC 污染（≤300 mg·L-1）對萵苣等4 種蔬菜種子的根伸長抑制作用大于芽伸長的抑制作用（Pan et al.，2016）。本文TC 污染（≤500 mg·L-1）對9 種蔬菜種子萌發指標的影響程度為：根長＞芽長＞發芽率，當TC 質量濃度為10 mg·L-1時，9 種品種蔬菜種子相對根長、相對芽長和發芽率分別為16.9%—72.5%，42.3%—129.4%，83%—100%，與文獻研究結果相一致。

抗生素對種子萌發過程中根伸長的影響與種子品種有關。當OTC 質量濃度達到10 mg·L-1時，小麥種子根長出現明顯縮短，而玉米和高梁種子根長出現明顯縮短的質量濃度分別為20 mg·L-1和40 mg·L-1時（王磊等，2017）。當TC 質量濃度為100 mg·L-1時，番茄的相對根長小于20%，而玉米的相對根長大于50%（張乙涵等，2014）。生菜、苜蓿和胡蘿卜種子（Hillis et al.，2011），以及生菜、胡蘿卜、黃瓜和西紅柿種子（Pan et al.，2016）對TC 污染的響應程度也存在顯著差異。本文9 種蔬菜種子萌發對TC 污染的響應程度變化較大，如，當TC 質量濃度為10 mg·L-1時，玉米、青瓜和白瓜種子的相對根長分別為72.5%、35.9%和16.9%，差異顯著。

以根長作為測試終點，TC 對9 種蔬菜的IC50值最大值為83.60 mg·L-1（玉米），最小值為2.98 mg·L-1（青瓜）；IC10最大值為5.63 mg·L-1（芥蘭），最小值為0.03 mg·L-1（玉米）；且從IC50和IC10大小排序來看，不同品種蔬菜對TC 的敏感性程度并非一致，如，玉米種子的IC50最大，但IC10最小。Liu et al.（2009）的研究表明，TC 對黃瓜種子的IC50（203 mg·L-1）顯著高于水稻種子（69 mg·L-1）和燕麥種子（57 mg·L-1），而其IC10（8 mg·L-1）卻顯著低于水稻種子（16 mg·L-1）和燕麥種子（14 mg·L-1）。玉米種子的IC50為108.38 mg·L-1，是8 種實驗植物品種中最大的；而其IC10（3.81 mg·L-1）卻顯著低于萵筍（8.36 mg·L-1）和黑麥草（6.28 mg·L-1）（張乙涵等，2014）。這可能與不同品種植物種子自身性狀，如，總糖、總蛋白、總脂和灰分，等指標有關（Luo et al.，2019b）。

對比文獻研究報道可知，本文青瓜種子的IC50為2.98 mg·L-1，其低于Liu et al.（2009）、張乙涵等（2014）以及Pan et al.（2016）的研究結果，分別為203、10.74 和34.8 mg·L-1，這可能是實驗所選青瓜品種不同所致，即種內差異。Luo et al.（2019b）開展了抗生素對植物種內毒性差異的研究，結果表明，TC 對3 種白菜的IC50分別為119.90、24.60 和16.03 mg·L-1，對3 種食用油菜的IC50分別為86.64、55.53 和63.77 mg·L-1，對3 種卷心菜的IC50分別為52.25、15.88 和75.25 mg·L-1。但目前還未見抗生素對青瓜種內毒性差異的研究報道。

同時，本文獲得TC 對珠三角常見品種蔬菜的HC5為9.64 μg·L-1，PNEC 為1.93 μg·L-1，這一研究豐富了TC 對蔬菜的毒性數據，為土壤TC 污染的生態風險評估提供科學依據。

4 結論

TC 污染對實驗所選品種蔬菜種子萌發指標的影響程度為：根長＞芽長＞發芽率。當TC 質量濃度為10 mg·L-1時，9 種品種蔬菜種子相對根長、相對芽長和發芽率分別為 16.9%—72.5%，42.3%—129.4%，83%—100%。TC 污染對種子萌發的影響程度不僅與測試指標相關，還與蔬菜品種密切相關。當TC 質量濃度為10 mg·L-1時，玉米、青瓜和白瓜種子的相對根長分別為 72.5%、35.9%和16.9%，差異顯著。毒性劑量-效應曲線表明，TC 對不同品種蔬菜毒性閾值差異較大，IC50最大值為83.60 mg·L-1（玉米），最小值為2.98 mg·L-1（青瓜）。SSD 曲線表明，不同品種蔬菜對TC 毒性敏感性頻次分布順序為：玉米＞菜心＞芥蘭＞豆角＞白菜＞線椒＞花葉芥菜＞白瓜＞青瓜。即，玉米種子對TC 污染的耐受性最強，青瓜種子對TC 最為敏感，可以作為珠三角區域TC 污染生態風險評估的蔬菜品種。本實驗獲得TC 對不同品種蔬菜的HC5為9.64 μg·L-1，PNEC 為1.93 μg·L-1。