氣相中堿基與核苷自由基的產生與結構研究

寇 敏,徐詩音,焦魯楊,杜夢穎,李樹奇,孔祥蕾,2,3

(1.南開大學化學學院,元素有機化學國家重點實驗室,天津 300071;2.南開大學有機新物質創造前沿科學中心,天津 300071;3.南開大學化學學院,天津市生物傳感與分子識別重點實驗室,天津 300071)

自由基在涉及蛋白質和DNA等生物分子的反應中發揮著關鍵作用。核苷自由基在生物體內可能引發一系列重要的反應,如氧化、還原、自由基鏈式等,這些反應可以導致DNA和RNA的進一步損傷,從而對細胞的正常功能和遺傳信息造成影響。近年來,有研究[1-3]表明,核苷自由基是RNA/DNA損傷的關鍵中間體。以氮為中心的核苷自由基通常是暴露于γ射線或氧化劑的DNA產生的反應中間體,但對其關鍵結構以及相關反應的細節仍不清楚。為研究反應中形成的瞬態物種,科學家們開發了多種產生核苷自由基的方法,然而,由于不同方法產生的自由基可能具有不同的位點,因此對產生的自由基及其異構體結構的精準確定非常重要,但也非常困難。

一般情況下,DNA電離通過氧化或還原途徑進行,分別形成陽離子自由基和陰離子自由基中間體。以腺嘌呤為例,目前公認的堿基自由基形成機制有2種[4]:一種是通過氧化電離產生瞬態陽離子自由基,這些陽離子自由基通過電子或質子轉移后進一步反應;另一種是通過還原電離捕獲電子,形成短壽命的陰離子自由基,通過陰離子消除或溶劑質子化轉化為自由基。在液相研究中,羥基自由基直接進攻核苷是一種常用的方法[5-7],可以選擇性地產生羥基自由基,使其與核苷發生反應產生核苷自由基。此外,一些研究人員利用其他自由基氧化劑,如硫酸根自由基[8-9]、氯自由基[10]等,在適當的實驗條件下誘導核苷的氧化反應產生核苷自由基,并利用瞬態吸收光譜對其結構進行研究。這些方法均具有較高的選擇性和靈敏度,但需要準確控制實驗條件和選擇合適的試劑。

在凝聚相中產生的這些不穩定自由基很容易與所處的環境分子(如溶劑分子)發生一系列反應,使它們的結構分析更復雜。利用氣相中的離子分子不受溶劑和抗衡離子效應干擾的優勢[11-12],科學家們在氣相中對相關自由基進行研究,通過比較實驗結果與理論計算結果,能夠從分子水平上更加清晰地獲得它們的結構和動力學信息。近年來,隨著質譜技術的發展,尤其是串聯質譜法以及電噴霧電離(ESI)[13]的廣泛應用,使氣相自由基的相關研究取得了很大進步。

本文將聚焦基于質譜技術的堿基自由基與核苷自由基的氣相研究,詳細介紹它們的產生方式、研究方法以及結構研究進展。

1 氣相中堿基核苷自由基的產生方法

傳統的電子轟擊電離(EI)雖然可以用來產生核苷自由基離子,但受產率的影響,難以進行后續的結構研究。為揭示核苷自由基的結構和性質,研究人員開發了一些新的自由基產生方法,如利用堿基與金屬離子和相關配體形成的配合物通過碰撞誘導解離(CID)產生自由基離子[14-15],使用不同的前體分子并結合各種離子活化技術在氣相中制備多種類型的自由基離子等,示于圖1。

圖1 氣相中堿基、核苷和核苷酸陽離子自由基的形成方法Fig.1 Formation methods of cationic free radicals of base, nucleoside, and nucleotide in gas phase

1.1 EI源直接產生

最早,研究人員采用高能電子撞擊電離(EI)技術產生核苷堿基的自由基陽離子,示于圖1a。由于含氮的核苷堿基是富電子體,在初期形成核酸自由基時,電子空穴主要集中在堿基上,產生以堿基為中心的自由基。在氣相中,核苷堿基的電離能量從低到高依次為鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、尿嘌呤(U)[16-18]。有關核苷構建模塊的報道大多數是基于高能電子碰撞電離方法研究堿基自由基陽離子的碎裂途徑[19-20],然而,由于方法本身的局限性,缺乏對自由基深入的研究。

1.2 三元過渡金屬配合物

O’Hair等[21]研究表明,一些核苷自由基陽離子可以通過ESI形成的三元金屬配合物離子[M(L3)(N)]2+(M:Cu(Ⅱ),Pt(Ⅱ);L:dien,tpy,Nu:A,dA,G,dG,C,dC)的碰撞誘導解離引發分子內電子轉移而產生,示于圖1b[21]。隨后,研究人員先后研究了脫氧胞苷-脫氧鳥苷配對、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤[22-25]。以三聯吡啶(terpy)作為配體,將ESI產生的[M(Ⅱ)(L3)N]2+(m/z211)作為前體離子,通過CID方法可以在其串聯質譜圖上觀察到胸腺嘧啶自由基陽離子(m/z126),示于圖2。

圖2 [Cu(terpy)(thymine)]2+·離子的CID質譜圖[24]Fig.2 Collision-induced dissociation mass spectrum of [Cu(terpy)(thymine)]2+·[24]

1.3 引入自由基引發劑

注:a.MS2m/z 570;b.MS3m/z 416;c.MS4m/z 291圖3 多級串聯質譜顯示A+·的形成過程[26]Fig.3 Formation process of A+· by multistage tandem mass spectrometry[26]

1.4 電荷基團標記法

圖4 m/z 414.5處(12++DBCE)的ETD-MS2質譜圖(a),插圖為m/z 469處1+·的CID-MS3質譜圖;m/z 394.5處(22++DBCE)的ETD-MS2質譜圖(b),插圖為m/z 429處2+·的CID-MS3質譜圖[28]Fig.4 ETD-MS2 spectrum of (12++DBCE) at m/z 414.5 (a), the inset shows the CID-MS3 spectrum of 1+· at m/z 469; ETD-MS2 spectrum of (22++DBCE) at m/z 394.5 (b), the inset shows the CID-MS3 spectrum of 2+· at m/z 429[28]

1.5 紫外光解離法

光解離法通過使用光能將分子激發到激發態進而生成自由基[33-34]。該方法具有靈活性和可擴展性,通過調整激光的波長、強度和脈沖寬度等參數,可以有效控制核苷自由基的產生?？紫槔僬n題組[35]通過在傅里葉變換離子回旋共振(FT-ICR)分析池中對鋰離子化或鈉離子化的2-碘代核苷陽離子進行UV照射,使其發生C—I鍵均裂,進而產生核苷及配對核苷自由基陽離子,示于圖1f。將鋰離子化或鈉離子化的2-碘代核苷陽離子選擇出來,然后引入紫外激光,在紫外光解離-串聯質譜(UVPD-MS2)圖中可以觀察到相應的腺苷自由基陽離子[36],示于圖5。該方法可以通過在不同位置靈活地引入C—I 鍵來制備不同自由基異構體。

注:a.c.分別為質量選擇后的母離子m/z 400.00、415.98;b.d.分別為m/z 400.00、415.98對應的紫外光解離質譜圖(280 nm,照射5 s)圖5 [IAde+Li]+(a,b)和[IAde+Na]+(c,d)的質譜圖[36]Fig.5 Mass spectra of [IAde+Li]+ (a,b)和[IAde+Na]+ (c,d)[36]

1.6 中和-再電離質譜法

2 氣相中堿基核苷自由基結構的研究方法

對于在氣相中產生與DNA相關的自由基離子,可以在質譜儀中進行質量選擇,并利用串聯質譜和光解離光譜等方法進一步研究其結構、反應性和動力學。對目標自由基離子進行選擇后,可以采用不同的離子活化方法進行活化,并進一步利用串聯質譜研究裂解通道和產物。目前,離子活化手段主要有CID、紅外多光子光解離光譜(IRMPD)以及紫外-可見光解離(UV-VisPD),采用可調諧激光可進一步獲得自由基離子的IRMPD光譜或UVPD光譜。另外,還有一些結合質譜或串聯質譜研究離子結構和動力學的方法,如與相關物種的反應質譜[4,37-38]、光電子能譜(PES)[39-45]以及離子碰撞橫截面(CCS)測量[46-51]等,示于圖6。其中,PES在自由基研究中的應用較廣泛,但主要集中于小分子自由基,如丙烯自由基和苯胺自由基等[40-41,44];基于離子遷移的CCS測量已逐漸增多,但只有少數研究涉及若干陽離子自由基[46-51],這是因為自由基的不穩定性導致其在遷移過程中可能伴隨CCS改變。

圖6 基于不同串聯質譜方法的堿基與核苷自由基的結構研究Fig.6 Structural study of free radicals of bases and nucleosides based on different tandem mass spectrometry methods

由于目前大部分商品化質譜儀不提供IRMPD和UVPD光譜的功能,為實現這一目標,需要對其進行改造。這要求所選擇的質譜儀應具備較強的多級串聯質譜能力或多種活化手段,以便能夠產生相應的自由基離子。其中,基于離子阱的用于串聯MSn-UVPD光譜學研究的實驗裝置主要有2種[52]:1種是基于Thermo LTQ質譜儀改造的,以實現將紫外光束引入線性離子阱中,改造的主要方法是在用于產生陰離子的輔助化學電離源的插入塊中鉆出直徑為1 mm的孔,并使用1塊在入射光束路徑位置上有1個密封石英窗的鋁板取代化學電離源的背面真空法蘭,示于圖7a;另1種是基于Bruker amaZon質譜儀改造的,將紫外光束引入3D離子阱中,在環形電極上鉆出2個直徑1 mm的孔(分別在頂部中心和底部中心),將改裝后的環形電極正上方的真空法蘭更換為紫外線窗口法蘭,同時將2個反射鏡固定在改裝后的環形電極下方,示于圖7b。

注:a.改造后的Thermo LTQ質譜儀;b.改造后的Bruker amaZon質譜儀;c.實驗裝置示意圖;d,e.實驗裝置實物圖,PG表示脈沖發生器,SC表示快門控制器圖7 通過引入可調諧激光,可獲取MSn-UVPD光譜的儀器裝置(a,b)[52];通過向FT-ICR質譜儀引入可調諧激光,可獲取MSn-UVPD和IRMPD光譜的儀器裝置(c～e)[35] Fig.7 Instrument setups for obtaining MSn-UVPD spectra by introducing tunable lasers (a, b)[52]; instrument setup for obtaining MSn-UVPD and IRMPD spectra by introducing tunable lasers in a FT-ICR mass spectrometer (c-e)[35]

為了能夠在同一臺質譜儀上同時獲得目標離子的紅外及紫外光解離質譜與光譜,孔祥蕾課題組[35]將2束可調諧激光引入到1臺磁場強度為7.0 T的FT-ICR質譜儀分析池中,示于圖7c、7d。其中,1臺是紫外-可見OPO激光器,可用于產生堿基自由基陽離子或核苷自由基陽離子,也可用于研究紫外光解離質譜與光譜;另1臺是可調諧紅外激光器,輸出波長范圍為2 700～3 800 cm-1,可以對自由基離子的紅外光解離光譜進行研究。該裝置雖然不具備ETD功能,但可以實現IRMPD、UVPD、CID等3種離子活化方法的任意結合,并共同作用于同一離子[11-12,35-36]。

3 氣相中堿基核苷自由基結構的研究進展

近年來,科學家們基于以上自由基的產生方法和結構研究手段[22-32,36-38],并結合理論計算[53-54],對核苷自由基離子的結構和反應性進行了較全面的研究。核酸中的核苷是由嘌呤或嘧啶堿基與核糖或脫氧核糖縮合而成,一般來說,核糖分子中的碳原子(C1)與嘧啶分子中的氮原子(N1)或嘌呤分子中的氮原子(N9)之間形成糖苷鍵,稱為核糖核苷。為方便文章閱讀,對堿基及糖環上的原子進行編號,示于圖8。

圖8 堿基及糖環上的原子編號Fig.8 Reference numbers for the atoms on base and sugar rings

3.1 腺嘌呤以及腺苷自由基

Turecek等[25]利用三元過渡金屬配合物通過碰撞誘導解離形成腺嘌呤(A)和9-甲基腺嘌呤的陽離子自由基,提出了腺嘌呤可能存在的異構體,并通過紫外-可見光譜和基于理論計算的振動光譜證明了離子化的嘌呤核堿基在氣相中傾向于形成經典互變異構體結構;為了研究氫原子與腺苷結合位點,該課題組利用固定電荷基團標記法在氣相中產生帶有固定電荷基團的腺苷自由基,通過串聯質譜、氘標記和UV/Vis作用光譜對其進行結構表征,發現帶電荷標記的自由基在波長200～600 nm處有紫外吸收;同時還考慮了H原子結合在N1、C2、N3、N7、和C8這5種情況,通過開展氘標記實驗,得出H原子僅結合在N1、N3和N7位點上;進一步與分子動力學、從頭計算和激發態計算相結合,明確此處產生的腺苷自由基為N7氫原子加合物。Gerbaux等[4]利用NRMS方法產生腺嘌呤自由基,并將電噴霧電離、氣相離子化學和碰撞電子轉移相結合,發現N1氫原子加合物最穩定,被認為是DNA放射性損傷的初始中間體之一。

為了揭示堿金屬離子與腺苷自由基的相互作用,孔祥蕾課題組[36]利用紫外光解離法產生鋰離子化和鈉離子化的腺苷自由基,示于圖9,通過將紅外多光子解離與理論計算相結合,確定了2種自由基最穩定的異構體,它們具有金屬離子三配位模式的共同特征。對于這2種自由基物種而言,最低能量的異構體都經歷了氫轉移,但考慮到C—I均裂后直接形成的自由基具有一些相似的光譜特性,不能排除存在經直接均裂后生成的自由基異構體。

圖9 [Ade+Li-H]+·(a)和[Ade+Na-H]+·(b)的紅外實驗光譜圖[36]Fig.9 Experimental IRMPD spectra of [Ade+Li-H]+· (a) and [Ade+Na-H]+· (b)[36]

3.2 胸腺嘧啶以及胸苷自由基

3.3 鳥嘌呤以及鳥苷自由基

對于與腺嘌呤結構相似的鳥嘌呤(G)來說,Marek等[29]利用電荷標記法在氣相中產生(G+H)·型鳥苷自由基,作者首先考慮了N1、N7、N3、O6這4種質子化位點,然后通過CID、UVPD和紫外-可見光譜與理論計算相結合,表征離子為N7-H鳥苷自由基互變異構體,發現可見光和近紫外區域的吸收帶是H原子結合在N7位上特異性(G+H)·型鳥苷自由基的特征。

3.4 胞嘧啶以及胞苷自由基

對于1+·來說,通過監測m/z468(損失H)、358(損失胞嘧啶)、343(丟失甲基胞嘧啶)、272這4個主要的光碎片離子通道,從紫外光譜圖中觀察到最強的吸收在250 nm處,而在500 nm以上未觀察到光解離,示于圖10a。對于2+·來說,主要吸收帶在250、300 nm處,有m/z428(損失H)、259、203等3個主要碎片離子通道,示于圖10b?？傮w而言,胞苷自由基在動力學和熱力學上比先前報道[27,29]的類似腺苷和鳥苷自由基更穩定。

圖10 1+·(a)、2+·(b)自由基離子的紫外光解離光譜圖[28]Fig.10 Experimental UVPD spectra of 1+· (a) and 2+· (b) radical ions[28]

3.5 尿嘌呤以及尿苷自由基

3.6 鳥嘌呤-胞嘧啶配對

4 總結與展望

通過不同方法產生和研究核苷自由基,為深入了解其形成機制、反應性質以及生物學功能具有重要意義。質譜儀系統中的高真空為高反應性瞬態分子和自由基等提供了惰性環境,有利于它們的生成和結構研究。本文總結了近20年來基于質譜技術的堿基自由基與核苷自由基的氣相研究,詳細介紹了產生方式、研究方法以及結構研究進展,具體信息列于表1。從產生方法來看,除早期使用的EI法外,目前已有多種方法被應用,如基于堿基或核苷與CuⅡ和配體形成的三元過渡金屬配合物或通過引入自由基引發劑的CID方法,基于電荷標記后的ETD方法,以及基于引入碳碘鍵后的UVPD法等。在結構研究中,既可以通過基于串聯質譜的離子活化法獲得解離碎片信息,又可以獲得重要自由基離子的紫外-可見或紅外光解離光譜,并與理論計算結果對比?；谝陨戏椒?許多不同堿基與核苷自由基離子的結構得以明確,但其高活性自由基中間體的結構表征,以及不同自由基位點的自由基異構體的選擇性產生仍具有挑戰性。目前,相關自由基離子的研究主要集中于陽離子,而對于陰離子的產生和研究仍然非常困難,可以進一步利用反應質譜、光電子能譜以及CCS測量等方法實現對這些物種結構的精準分析。

表1 氣相中堿基與核苷自由基的產生以及結構研究方法Table 1 Production and structural research methods of free radicals of bases and nucleosides in gas phase