電化學酰胺化反應中間體的原位質譜分析

羊 雪,惠人杰,胡 軍

(江南大學生命科學與健康工程學院,江蘇 無錫 214200)

酰胺鍵是構筑各類生物活性分子的重要化學鍵,其廣泛存在于多肽、蛋白質、臨床批準的合成及天然藥物中,例如利多卡因、撲熱息痛、阿托伐他汀、嗎氯貝胺、卡托普利、乙酰唑胺、帕納替尼、甲氨蝶呤、曲美芐胺、青霉素、氯霉素類藥物。酰胺鍵具有獨特的化學結構和性質:1) 氮原子為sp2雜化,孤對電子所在的p軌道與羰基形成p-π共軛,因此,其C—N鍵具有部分雙鍵特征;2) 整個酰胺鍵呈平面幾何結構,與酰胺相連的基團之間可呈反式(trans)或順式(cis)構象;3) 酰胺鍵中的羰基和氨基可分別作為氫鍵受體和氫鍵給體與靶蛋白形成復雜的氫鍵相互作用[1]。除作為重要的藥效團,酰胺鍵也常被用作各類化學偶聯的連接化學鍵,在生化傳感探針構建中應用廣泛[2]。因此,研究酰胺鍵的構建方法與機理具有重要意義。

酰胺鍵的構建除采用羧基(—COOH)與氨基(—NH2)在高溫下直接縮合外,更常見的策略是使用酰鹵、?；B氮化合物、酸酐、活性酯等活性前體化合物反應生成[3]。其中,應用最廣泛的是活性酯法,常見的縮合試劑(如磷正離子、脲正離子等)均是通過生成活性酯而最終形成酰胺鍵[4]。近年來,利用單電子轉移(single electron transfer, SET)的電化學氧化或電化學還原過程,通過產生自由基等活潑中間體促使合成反應在溫和條件下平穩進行,有機電化學合成已成為一種高效、高選擇性的綠色合成方式。例如,Nagahara等[5]利用三苯基膦存在情況下的電化學酰胺化反應實現了多種藥物分子(如亮丙瑞林)的高選擇性合成,但受限于反應的復雜性以及電化學反應產生的自由基活潑中間體的短壽命特性,對該電化學酰胺化反應中自由基中間體形成的實驗證據及其超快轉化過程的解析仍具有挑戰性。

電化學反應監測常用的方法有紫外-可見光譜法[6]、瞬態吸收光譜法[7]、核磁共振波譜法[8-9]、電子順磁共振波譜法[10]等。雖然光譜法在反應中間體監測方面有較深入的發展,但在直接同時檢測多種反應物、中間體、最終產物及副產物,特別是在瞬態中間體的形成與轉化動態過程等方面仍存在一定的局限性。質譜法通過測量質荷比能夠實現多個物質的同時免標記、高靈敏測定,利用串聯質譜技術能夠獲取關于電生成物種,特別是自由基中間體的結構信息。在化學反應在線監測方面,已報道多種基于解吸附電噴霧離子化質譜(DESI-MS)[11-15]、萃取電噴霧離子化質譜(EESI-MS)[16-20]、納升電噴霧質譜(nESI-MS)[21-25]、超聲噴霧離子化質譜(SSI-MS)[26-30]等裝置的接口。例如,Liu等[31]報道了使用納升解吸電噴霧電離(nano-DESI)裝置實現電化學與質譜的在線聯用,但受限于nano-DESI較慢的流體輸運過程,其僅能實現電化學反應產物以及部分長壽命中間體的質譜檢測。

本工作擬開發一種新的電化學-質譜聯用接口,以實現電化學反應中瞬態中間體的直接質譜檢測,并研究這些活潑中間體的形成與轉化動態過程,希望為電化學反應的機理研究及電有機合成反應的快速篩選提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

LTQ-Orbitrap Velos質譜儀:美國Thermo Fisher Scientific公司產品,配有Xcalibur型數據處理系統;微量上樣器:德國Eppendorf股份公司產品;P-2000玻璃管拉制儀:美國Sutter Instrument公司產品;ZZS700-6/G電子束蒸發鍍膜儀:成都南光機器有限公司產品。

1.2 樣品與試劑

三苯基膦(純度>99.0%)、對甲基苯甲酸(純度98%)、芐胺(純度99%)、磺胺噻唑(純度98%)、六氟異丙醇(純度99.5%):上海麥克林生化股份有限公司產品;二氯甲烷(純度99.9%):上海泰坦科技股份有限公司產品。

以二氯甲烷(CH2Cl2)-六氟異丙醇(HFIP)溶液(2∶1,V/V)作為空白溶劑。分別稱取1 mmol/L三苯基膦、對甲基苯甲酸、芐胺、磺胺噻唑溶液,加入空白溶劑,配制成1 mol/L樣品溶液。

1.3 電化學-質譜聯用接口的制備與表征

本研究開發的電化學-質譜聯用接口示于圖1a。該集成化接口由1根噴鍍金屬薄層的玻璃毛細管構成,其同時作為微型電化學反應池和電噴霧電離的噴針。使用1臺配備有二氧化碳激光的微電極拉制儀拉制玻璃毛坯管(外徑1.00 mm,內徑0.58 mm,長度10.0 cm),可得到所需開口直徑約2 μm的錐形空白噴針,示于圖1b。然后,使用電子束蒸發鍍膜儀完成毛細管外表面和針尖內壁上金屬鉑的蒸鍍,即得鍍鉑噴針,其中,針尖內金屬鍍層的元素表征結果示于圖1c。

圖1 電化學-質譜聯用裝置示意圖(a),鍍鉑噴針尖端掃描電鏡圖(b)和內壁元素表征圖(c)Fig.1 Schematic illustration of the combination of electrochemistry and mass spectrometry (a), scanning electron microscopy of a Pt-decorated ion emitter (b) and its element characterization (c)

1.4 電化學-質譜聯用裝置

電化學-質譜聯用裝置的接口針尖外表面的金屬鍍層與高壓電源連通以驅動電噴霧電離過程;針尖內的金屬鍍層與針尖外表面的金屬鍍層也呈連通狀態,且直接作為電化學反應的工作電極。因此,通過施加高電壓可以同時驅動針尖上的電噴霧過程與電化學反應過程,且毛細管針尖內電化學反應產生的物質能夠快速地轉移至噴霧液滴中,經歷去溶劑過程而完成離子化,并最終被質譜檢測。

1.5 質譜條件

LTQ-Orbitrap質譜儀正離子模式,質量掃描范圍m/z50～500;毛細管溫度275 ℃;噴霧電壓0.5～1.5 kV;最大離子注入時間50 ms(全掃描模式);二級質譜分析所用的碰撞誘導解離(CID)參數為標準化碰撞能量25%～35%。質譜測試前,使用微量上樣器將約20 μL樣品灌注鍍鉑噴針,并置于質譜入口前,其中,針尖前端與質譜入口的距離約5 mm。使用正離子模式時,將質譜儀內置的正高壓電源通過導線與毛細管外表面的金屬鍍層相連,施加高電壓即可觸發針尖內的電化學氧化反應和電噴霧電離過程,進而完成針尖內電化學氧化反應的原位質譜分析。

2 結果與討論

2.1 芐胺的電化學酰胺化反應原位質譜分析

電噴霧電離過程可被看作電化學反應過程。為驗證鍍鉑噴針進行原位電化學反應的能力,本研究考察了空白噴針和鍍鉑噴針分析三苯基膦溶液的情況,結果示于圖2。使用空白噴針進行電噴霧電離質譜分析時,三苯基膦樣品產生m/z263.098 5質譜峰,示于圖2a。根據精確質量數分析,其為三苯基膦的加氫峰(即[PPh3+H]+,分子式為[C18H15P+H]+,理論質荷比為263.098 4,質量偏差Δm=0.1 mu)。進一步對m/z263.098 5進行CID分析,結果示于圖2b。根據三苯基膦的分子結構,并結合精確質量數分析,對主要的碎片離子進行結構確認。其中,m/z262.090 0是母離子丟失1個氫原子(H)后形成的;m/z185.049 2是母離子同時丟失1個苯基(C6H5)和1個H后形成的;而m/z108.012 9則是母離子同時丟失2個C6H5和1個H后得到的。以上碎裂形式均與三苯基膦的分子結構吻合。

圖2 使用空白噴針得到的三苯基膦質譜圖(a)和m/z 263二級質譜圖(b),使用鍍鉑噴針得到的三苯基膦質譜圖(c)和m/z 262二級質譜圖(d)Fig.2 Mass spectrum of PPh3 using a bare ion emitter (a) and MS/MS spectrum of m/z 263 (b), mass spectrum of PPh3 using a Pt-decorated ion emitter (c) and MS/MS spectrum of m/z 262 (d)

使用鍍鉑噴針得到的三苯基膦溶液質譜圖示于圖2c。與空白噴針相比,出現了m/z262.090 5譜峰,根據精確質量數,推測其為三苯基膦的自由基陽離子(即[PPh3]·+,分子式為[C18H15P]·+,理論質荷比為m/z262.090 6,Δm=-0.1 mu)。該自由基陽離子的形成主要源自電噴霧電離過程中三苯基膦分子在噴針尖端內金屬鉑層上的單電子轉移電化學氧化。使用串聯質譜對該陽離子自由基結構進行確認,結果示于2d。其中,m/z261.082 5是母離子丟失1個H形成的;m/z184.043 4是母離子同時丟失1個C6H5和1個H形成的;m/z183.035 7可能是m/z184.043 4繼續失去1個H后形成的;m/z108.012 0是母離子丟失2個C6H5形成的。此外,還觀察到m/z155.085 4譜峰,其可能為母離子丟失[C6H4P]碎片形成的;m/z79.053 8可能為母離子丟失[C12H8P]碎片形成的?？梢钥闯?在相同的CID能量下,三苯基膦自由基產生了豐富的碎片離子,其碎裂模式與其加氫峰不同,主要體現在[C6H4P]、[C12H8P]等中性丟失過程。對三苯基膦自由基陽離子的成功檢測,表明了本研究的鍍鉑噴針具有監測電化學反應過程的能力,能夠實現原位質譜分析電氧化反應產生的自由基中間體。

為進一步研究三苯基膦對羧基的活化過程,在相同實驗條件下,向已含有三苯基膦溶液的空白噴針和鍍鉑噴針中加入等摩爾質量的對甲基苯甲酸,其結果示于圖3?？梢钥闯?加入對甲基苯甲酸后,空白噴針和鍍鉑噴針的譜圖中均出現了m/z137譜峰,其為對甲基苯甲酸的加氫峰(即[4-methylbenzoic acid+H]+,分子式為[C8H8O2+H]+,理論質荷比為m/z137.059 7,Δm=0.4 mu)。與空白噴針相比,在鍍鉑噴針的質譜圖上還觀察到m/z397.135 9譜峰。根據精確質量數分析,其為對甲基苯甲酸與三苯基膦進行電化學氧化反應得到的活性酯中間體(即((4-methylbenzoyl)oxy)triphenylphosphonium,分子式為[C26H22O2P]+,理論質荷比為m/z397.135 2,Δm=0.7 mu)。對活性酯中間體進行串聯質譜CID模式分析,結果示于圖3c。其中,m/z279.093 1和119.049 3是該活性酯中間體酯鍵斷裂后形成的;m/z263.098 2則是母離子P—O鍵斷裂后形成的,即三苯基膦的質子化離子,其碎裂形式與其分子結構吻合。

圖3 使用空白噴針(a)和鍍鉑噴針(b)得到的三苯基膦-對甲基苯甲酸混合溶液的質譜圖,m/z 397二級質譜圖(c)Fig.3 Mass spectra of mixed solution of PPh3 and 4-methylbenzoic acid using ion emitters of bare (a) and Pt-decorated (b), MS/MS spectrum of m/z 397 (c)

本實驗進一步研究電化學反應產生的活性酯中間體與氨基的反應,向三苯基膦-對甲基苯甲酸溶液中加入芐胺,原位質譜分析結果示于圖4。由于芐胺的加入,質譜圖中出現了m/z108.081 0譜峰,為芐胺的加氫峰(即[benzylamine+H]+,分子式為[C7H9N+H]+,理論質荷比為m/z108.080 8,Δm=0.2 mu),示于圖4a。除芐胺信號,在使用鍍鉑噴針所得的質譜圖中還觀察到酰胺化反應產物的信號峰m/z226.122 5(即[N-benzyl-4-methylbenzamide+H]+,分子式為[C15H15NO+H]+,理論質荷比為m/z226.122 6,Δm=-0.1 mu),示于圖4b,進一步的串聯質譜分析結果示于圖4c,可以看出碎裂主要發生在酰胺鍵位置。其中,m/z119.050 0和106.065 8是母離子酰胺鍵斷裂后產生的,m/z91.054 8可能為m/z119.050 0丟失1分子CO后形成的芐基碳正離子。需要指出的是,在使用空白噴針所得的三苯基膦-對甲基苯甲酸-芐胺質譜圖中未見酰胺化反應產物的質譜峰,表明電化學在該酰胺化反應中具有重要作用。

圖4 使用空白噴針(a)和鍍鉑噴針(b)得到的三苯基膦-對甲基苯甲酸-芐胺混合溶液的質譜圖,m/z 226二級質譜圖(c)Fig.4 Mass spectra of mixed solution of PPh3, 4-methylbenzoic acid and benzylamine using ion emitters of bare (a) and Pt-decorated (b), MS/MS spectrum of m/z 226 (c)

圖5 芐胺的電化學酰胺化反應機理Fig.5 Proposed mechanism of the benzylamine amidation

2.2 磺胺噻唑電化學酰胺化反應原位質譜分析

磺胺類藥物為人工合成的抗菌藥,臨床使用已超過50年,具有抗菌譜廣、性質穩定、使用簡便等優點。其中,磺酰胺基對位上的游離氨基是抗菌活性的必需基團,若該游離氨基被酰胺化,則通常會失去抗菌活性。因此,制備用于特殊病灶的磺胺類藥物需要進行前藥修飾(如酰胺化修飾),以增加藥物穩定性、延長藥物作用時間、提高藥物選擇性。以酞磺胺噻唑為例,游離氨基的酰胺化使其成為主要作用于腸道感染的抗菌藥。該化合物在腸道內被水解為游離氨基,進而產生抑菌作用,常用于治療細菌痢疾[32]。用傳統方法合成酞磺胺噻唑需要將磺胺噻唑與苯酐進行?；磻?但這一過程往往需要較長的反應時間,并涉及復雜的步驟。鑒于此,利用原位質譜技術探究磺胺噻唑(ST)的電化學酰胺化反應發生的可能性。

本實驗分別使用空白噴針和鍍鉑噴針分析磺胺噻唑-對甲基苯甲酸-三苯基膦的混合溶液,考察電化學酰胺化的反應情況,結果示于圖6。由于磺胺噻唑的加入,譜圖中均出現了其加氫峰m/z256.021 0(即[ST+H]+,分子式為[C9H9N3O2S2+H]+,理論質荷比為m/z256.020 9,Δm=0.1 mu)。使用鍍鉑噴針在m/z374.063 1處觀察到新的譜峰,根據精確質量數,推測其是磺胺噻唑酰胺化產物的加氫峰(即[4-methyl-N-(4-(N-(thiazol-2-yl)sulfamoyl)phenyl)benzamide+H]+,分子式為[C17H15N3O3S2+H]+,理論質荷比為m/z374.062 8,Δm=0.3 mu),示于圖6b。串聯質譜結果驗證了該酰胺化產物的形成,示于圖6c。其中,m/z358.031 8是母離子同時丟失1個CH3和1個H形成的;m/z345.060 3是母離子同時丟失1個CH和1個O形成的;m/z276.069 8是母離子失去[C3H2N2S]碎片后形成的;m/z156.011 4是m/z276.069 8碎片離子的酰胺鍵斷裂,進一步丟失[C8H7O]碎片和1個H形成的,其中[C8H7O]碎片對應圖6c中m/z119.049 0;m/z219.056 8可能是母離子丟失[C6H5NO2S]碎片形成的;m/z201.048 1可能是碎片離子m/z219.056 8上的羰基發生酮式-烯醇式互變,進一步丟失1分子OH和1個H形成的。此外,在圖6c中還觀察到m/z108.044 1譜峰,可能是碎片離子m/z156.011 4失去1分子SO后產生的[C6H6NO]+,這與Du等[33]的報道一致。

圖6 使用空白噴針(a)和鍍鉑噴針(b)得到的三苯基膦-對甲基苯甲酸-磺胺噻唑混合溶液的質譜圖,以及m/z 374二級質譜圖(c)Fig.6 Mass spectra of mixed soultion of PPh3, 4-methylbenzoic acid and ST using ion emitters of bare (a) and Pt-decorated (b), MS/MS spectrum of m/z 374 (c)

圖7 磺胺噻唑酰胺化機理Fig.7 Proposed mechanism of sulfathiazole amidation

3 結論

本研究通過在納升電噴霧電離的噴針尖端集成金屬工作電極的方式,構建了一種新型的電化學-質譜聯用接口,實現了對電化學反應的原位質譜監測。通過在線監測一系列以三苯基膦為縮合劑的芳伯胺酰胺化反應過程,該裝置接口的適用性得到了較好驗證,特別是對多種關鍵中間體(如三苯基膦陽離子自由基、活性酯中間體等)的質譜鑒定,首次為Nagahara等提出的反應機理提供了直接的實驗證據。此外,利用該原位質譜方法成功驗證了磺胺噻唑酰胺化反應的可能性,為磺胺類藥物的酰胺化修飾提供了思路。該電化學-質譜耦合接口具有延遲低、樣品耗量小、制備簡單等優點,有望成為電有機合成反應快速篩選和機理研究的重要工具。