氚β 粒子照射對發育中的中樞神經系統的影響及機制研究

王冰 周湘艷 崔鳳梅

1 日本國立研究開發法人量子科學技術研究開發機構，放射線醫學研究所，千葉 263-8555；2 中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫學所放射毒理研究室，北京 100088；3 蘇州大學蘇州醫學院放射醫學與防護學院，放射醫學與輻射防護國家重點實驗室，蘇州 215123

1 導言

電離輻射對發育中的中樞神經系統的影響及其機制的研究是國際放射防護委員會（International Commission on Radiological Protection，ICRP）和聯合國原子輻射效應科學委員會（United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation，UNSCEAR）的重要課題[1-4]。對原子彈爆炸幸存者進行流行病學調查研究的結果是目前評價輻射對人類腦發育和神經行為危險度的主要依據。然而，這些結果是基于對一次性短時間內高劑量率輻射所產生的影響的總結，并不能代表在連續長時間內低劑量率輻射情況下所產生的生物效應。中樞神經系統的輻射敏感性會隨著其發育階段而變化，這就造成了在不同的輻射情況下所產生的輻射危險度的不同。

伴隨著對氚的研究的深入和其廣泛應用，特別是隨著核聚變產業的快速發展，氚的環境排放量正在逐漸增加，因此，人類受到低劑量氚β 粒子照射的機會也隨之增加?；陔暗纳镉绊懚贫ǖ娜梭w攝入氚核素的限量，也一直是ICRP 的重要課題[5-6]。環境中的氚主要以氚水的形式存在，其可以通過食物鏈、呼吸和皮膚接觸等途徑進入機體。氚水可以通過胎盤屏障進入胚胎和胎兒，氚水和有機氚化物還可以通過乳汁等進入哺乳中的新生兒消化道，再經吸收循環透過腦血屏障進入中樞神經系統。由于氚β 粒子在體內的照射一般是持續性的低劑量率輻射，ICRP 和UNSCEAR 目前所推薦的基于對一次性短時間內高劑量率輻射所產生影響的致畸閾劑量值，并不適用于對氚輻射對發育中的中樞神經系統危險度的準確評估。因此，在受到公眾極大關注的同時，氚輻射對發育中的中樞神經系統的影響及其機制的研究，也成為學術界亟待和必須解決的重要科研課題。

氚β 粒子致機體損傷的研究可以追溯到上世紀五十年代。截至上世紀九十年代初，中外研究人員在氚的體內分布、代謝、轉移以及生物影響方面做了大量的研究工作。除了發表了大量的論著和綜述文章，還出版了很多專著和特輯[7-14]。盡管當時這些研究成果使人們對氚輻射的危險度有了較為廣泛和深入的了解，然而關于氚β 粒子射線在子宮內照射對子代中樞神經系統可能產生的生物效應的研究，卻還處在起步階段。雖然前蘇聯、美國、加拿大和日本等國家在該領域的調查研究工作開展的比較早，但是這些研究缺乏系統性，使用的照射劑量偏高，而且評估采用的生物學終點指標也非常有限。

鑒于有關人類的資料極為有限，利用實驗動物來實施的研究工作成為本領域最重要的方法和手段。原衛生部工業衛生實驗所周湘滟的氚生物效應研究團隊建立了當時在世界上亦是為數不多的可以實施氚輻射影響研究的動物實驗設施，在對氚β 粒子輻射對子代中樞神經系統危險度研究方面，經過努力追趕，做到了后來居上。她們自上世紀八十年代至今，從分子、細胞、器官到整體，從組織結構、神經生化、行為到學習記憶功能，全面評價了低劑量氚β 粒子連續輻射對發育中的中樞神經系統的危險度[7-13]。ICRP 在2021 年發布的148 號出版物《參考動植物的輻射權重》中，引用了周湘滟團隊的成果，以總結氚β 粒子的相對生物效能[15]。本文以周湘滟團隊的研究工作為主線，概述了中國研究人員在低劑量氚輻射對發育中的中樞神經系統的影響及其機制領域開展的一系列系統的研究中所取得的重要成果。

哺乳類動物孕體的發育通?？梢苑譃? 個主要時期：植入前期、主要器官發生期和胎兒發育期。人類的這3 個時期分別在受精后0～8 d、9～60 d 和60～270 d；小鼠的在受精后0～5 d、6～13 d 和14～19.5 d。腦從發生到發育成熟，跨越了后兩個時期直至出生后的一段時間。人類在排卵受精后0～7 周時，產生大腦的兩類主要細胞（神經元和神經膠質細胞）的前體細胞，進行活躍的有絲分裂；8～15 周時神經元的數量迅速增加并遷移到功能區，最終失去遷移和增殖能力而成為多年生細胞；16～25 周時分化加速，其中突觸在第18 周開始形成，前體細胞發育成特定的腦細胞；26 周及以后，腦結構和細胞繼續形成和分化，大腦突觸發生，小腦生長和發育顯著加速。在發生時間上，小鼠腦的形態形成始于第8～9 天的胚胎；第10 天時已具備5 個腦泡；第11～15 天時形成丘腦；第14 天時形成原始大腦皮層；第17～19 天時各種聯合纖維開始形成。哺乳類動物在出生后，其腦部仍在繼續發育，直至發育為成熟個體。由此可見，哺乳類動物腦的發生、發育和成熟經歷了主要器官發生期的后期、胎兒期和出生后的一段時期[1-2,13]。

電離輻射誘發孕體發育障礙或損傷屬于特殊的軀體效應。不同于成年個體，發育著的孕體的組成細胞處于分化、增殖和遷移階段，具有固有的生物學特征：從受精著床到胎兒出生，各個器官和組織從發生到成熟是有條不紊地進行的。在器官發生期，增殖、分化和遷移中的細胞對輻射的敏感性較高。由于中樞神經系統的重要性，有關電離輻射對發育中的中樞神經系統的效應受到人們的高度重視。在對人類受到宮內照射后胎兒的生長發育效應的研究中，倍受關注的是輻射對中樞神經系統的損傷。1969 年UNSCEAR 在向聯合國大會提交的報告中，就已經將該方面的研究資料單獨予以評述[3]。電離輻射對發育中的中樞神經系統的影響，是通過對其從形成到成熟過程中組織結構化和功能化過程的擾亂或破壞實現的。這種效應使得子代發育成為成年的復雜的形態學和生理學過程受到影響，從而產生不同性質和不同程度的畸形，包括整體形態學和器官組織學上的缺陷（如小頭畸形和腦神經元數量減少等）、神經生化學的改變（如腦DNA 和神經遞質水平的紊亂）以及神經行為和功能的改變（如腦電圖改變和學習運動機能受阻等）。

在對日本因原子彈爆炸受到子宮內照射后出生的兒童所進行的調查中發現，有害效應包括出生后低體重、頭圍減小和智商指數降低[1]。這些結果為人類在胚胎和胎兒期受到電離輻射照射所產生的對中樞神經系統的影響提供了直接和有力的證據。ICRP 和UNSCEAR 基于人類流行病學的這些資料，總結出人類中樞神經系統對輻射最敏感的時期為孕齡8～15 周，對組織和行為致畸的閾劑量為0.1 Gy 或以上[1,4]。UNSCEAR 在1986 年的數據表明，電離輻射對人類發育中的中樞神經系統影響（發育異常）的最可能的表現形式為智力遲鈍[3]。對受到照射的時期的分析結果表明，受精后0～8 周受到照射，與輻射有關的智力遲鈍的概率基本為0，在8～15 周受到照射，這一概率達到最大數值，在16～25 周受到照射，這一概率的數值下降[16]。 這個皮層神經元的產生最活躍、向大腦皮層遷移的敏感階段（受精后8～15 周），正是輻射致嚴重智力遲鈍的危險度最高的時期。假定智力影響的誘發與輻射劑量呈線性關系，在高峰敏感時每單位吸收劑量的誘發概率估計為0.4/1 Gy，在妊娠16～25 周時為0.1/1 Gy[16]。對處于發育階段的兒童腦組織進行低劑量（1～2 Gy）照射可引起長期的認知和行為缺陷，嬰兒在出生后18 個月內受到＞0.1 Gy 劑量的照射后，在成年時更易患認知障礙[17]。我國學者就輻射對著床前胚胎發育的影響、輻射致胚胎和胎兒損害的危險度估計也進行了比較全面的總結[11,13]。

2 氚水暴露對神經系統的影響

在周湘滟團隊的研究中，他們利用懷孕小鼠和大鼠成功地建立了子宮內照射的動物模型，并將其應用于對低劑量氚β 粒子輻射對發育中的中樞神經系統影響的研究[7-13]。在研究中他們選用了8～12 周齡C57BL/6J 小鼠和10 周齡Wistar 大鼠，交配次日早晨查到陰栓確定為妊娠第0 天。每只孕鼠單籠飼育，在室溫（22±1）℃下，給予充足的飼料和飲水，并在妊娠和哺乳期添加葵花籽和雞蛋等輔食。孕鼠自然分娩并哺育仔鼠。在仔鼠出生后第3 天，將各窩仔鼠隨機減至最多8 只，將減下的仔鼠隨機分給同劑量組但仔鼠數少于4 只的母鼠哺育。在仔鼠出生后第7 天，將不足4 只仔鼠的窩連同母鼠舍棄，處以安樂死。在仔鼠21 天齡時，與母鼠分窩飼養。在完成預定實驗后，將仔鼠處以安樂死。

在ICRP 和UNSCEAR 的報告書中闡述的閾劑量，主要是基于對原子彈爆炸后急性照射的流行病學研究，輻射的種類以γ 射線和中子為主，劑量是經過當量劑量換算后的γ 射線劑量[1,4]。與γ 射線一次急性照射相比，氚水體內污染所造成的β 粒子射線照射的劑量，取決于氚水在體內的生物半衰期和組織的含水量，呈現為指數下降式的連續照射的累積劑量。周湘滟團隊的研究采用了向孕鼠腹腔內單次注射氚水的方法來模擬事故時所導致的母體體內氚水污染的狀況[7-13]。子代動物在母體子宮內受到吸收劑量為指數下降式的低劑量氚β 粒子照射。人類中樞神經系統對輻射的敏感期為妊娠第8～15 周，即中樞神經系統器官發生后繼續分化時期，輻射造成的主要損傷為智力障礙。研究使用了C57BL/6J 小鼠和Wistar 大鼠，在相當于人類中樞神經系統對輻射最敏感的妊娠第8～15 周期間開始階段的時點，即在小鼠孕齡12.5 d 和大鼠孕齡13.0 d 時，采用單次腹腔內注射的方法來模擬事故時所導致的母體全身體內氚水污染的狀況。這個時期C57BL/6J 小鼠和Wistar 大鼠的腦細胞正處在高度分化、增殖和遷移最活躍的狀態，適于進行從腦發生、發育到成熟階段的中樞神經受輻射的損傷程度及相關機制的研究。在所開展的一系列實驗中，研究人員向對照組動物腹腔一次性注入蒸餾水，向照射組動物分別投入 放 射 性 活 度為24.09×104、48.18×104、144.54×104Bq/g動物體重的氚水。子代動物在母體子宮內受到吸收劑量為指數下降式的低劑量氚β 粒子照射。小鼠仔鼠在出生時受到的累積照射劑量分別是0.036、0.071、0.213 Gy，對照組是0 Gy；大鼠仔鼠在出生時受到的累積照射劑量分別是0.044、0.088、0.264 Gy（對于各個劑量的照射組，依劑量高低，以下分別簡稱為低、中和高劑量組），對照組是0 Gy。

在母鼠自然分娩后，對仔鼠的生長發育、神經行為學、腦組織病理學、腦組織神經生物化學、初代培養大鼠大腦組織細胞電生理學和初代培養小鼠中腦細胞形態學和生物化學的變化，使用了總計56 項生物學終點作為評價指標，從多層次綜合地評估和探討了低劑量氚β 粒子子宮內照射對發育中的中樞神經系統的影響及其機制。

2.1 低劑量氚水β 粒子子宮內照射對出生后仔鼠體重增長和生理標志完善的影響[18-21]

首先以體重增長和生理標志完善情況的生物學終點為衡量指標，對仔鼠生長發育的影響進行了評價。主要的指標包括仔鼠從出生后到發育成熟期的體重的動態增長以及仔鼠張耳、開眼、出牙、睪丸下降和陰道張開5 個生理標志出現的平均天齡。結果顯示，氚水β 粒子子宮內照射對仔鼠可以產生不同程度的影響。對于小鼠仔鼠，低、中、高劑量3 個照射組仔鼠的張耳和出牙時間均比對照組仔鼠顯著延遲。中劑量照射可以導致開眼的平均達標天齡顯著延遲。另一方面，與對照組比較，對于睪丸下降和陰道張開，各實驗組間差異均無統計學意義。即高劑量照射組仔鼠也未顯示產生差異有統計學意義的影響。對于大鼠仔鼠，與對照組相比，中、高劑量組仔鼠出牙標志出現的平均天齡顯著延遲；而張耳和開眼兩個生理標志出現的平均天齡只在高劑量組仔鼠中顯著延遲。

受到低劑量照射即可使張耳和出牙的平均達標天齡顯著延遲的結果，提示了在子宮內受到低于0.10 Gy 的氚水β粒子照射劑量，即可導致評價生長發育的生理學指標的異常。

2.2 低劑量氚水β 粒子子宮內照射對出生后仔鼠新生反射的影響[18-21]

以抓握反射、斷崖回避、空中翻正、平面翻正和負趨地性等生物學終點為檢測指標，就氚水β 粒子輻射對仔鼠新生反射的影響進行了評價。結果顯示，對于小鼠仔鼠，與對照組相比，受到低劑量照射的仔鼠抓握反射的出現時間顯著延緩；受到中、高劑量照射的仔鼠，其斷崖回避、空中翻正和平面翻正反射的出現時間也顯著延緩。另一方面，即便是受到高劑量照射的仔鼠，其負趨地性出現時間卻沒有出現差異有統計學意義的變化。對于大鼠仔鼠，與對照組相比，受到中、高劑量照射的仔鼠的平面翻正和負趨地性反射的出現時間顯著延遲。

2.3 低劑量氚水β 粒子子宮內照射對出生后仔鼠感覺功能的影響[18-21]

以聽覺驚愕、痛覺反應、趨母性試驗和視覺定位等生物學終點為檢測指標，就氚β 粒子輻射對仔鼠感覺功能的影響進行了評價。結果顯示，對于小鼠仔鼠，與對照組相比，即便是受到低劑量照射，仔鼠也發生了聽覺驚愕出現的天齡延緩、痛覺反應潛伏期延長和趨母性試驗出現發育受阻；受到中、高劑量照射后，仔鼠的視覺定位出現的天齡延緩。對于大鼠仔鼠，與對照組相比，受到中、高劑量照射后，仔鼠的聽覺驚愕出現的天齡顯著延緩。

2.4 低劑量氚水β 粒子子宮內照射對出生后仔鼠運動協調功能和活動度的影響[22]

以轉體、足展開、連續通道活動轉彎和前肢懸掛等生物學終點為指標，就氚水β 粒子輻射對仔鼠運動協調功能和活動度的影響進行了評價。結果顯示，對于小鼠仔鼠，與對照組相比，即便是受到低劑量照射，仔鼠的轉體和15 d 足展開均明顯推遲；受到中、高劑量照射后，仔鼠的30 d 足展開仍然顯著延緩，28 天齡時的連續通道活動轉彎數也顯著減少。受到高劑量照射的仔鼠，63 天齡時的連續通道活動轉彎數依然顯著減少。對于大鼠仔鼠，與對照組相比，受到高劑量照射的仔鼠在14 天齡及16 天齡時，前肢懸掛時間顯著縮短；28 天齡仔鼠的連續通道活動轉彎數在低劑量照射組已經顯著減少。

2.5 低劑量氚水β 粒子子宮內照射對出生后仔鼠神經行為的影響[18]

在對仔鼠神經行為影響的評價中，以曠場實驗中離開曠場中央的潛伏期和仔鼠走格數這兩項指標，以及以孔板探究實驗中首次探孔時間和平均探孔數為生物學終點指標，首先對神經行為學中情緒和對新奇環境探索能力方面的影響進行了檢測。結果顯示，對于小鼠仔鼠，與對照組相比，中、高劑量受照組仔鼠在測試早期時的離開曠場中央潛伏期和仔鼠走格數兩項指標間的差異有統計學意義。具體表現為潛伏期的縮短和走格數的增加，而且上述改變呈現良好的劑量-效應關系，這提示中樞神經系統處于興奮狀態。另一方面，中、高劑量受照組仔鼠在測試晚期時的孔板探究實驗中，表現為首次探孔時間顯著延長，平均探孔次數明顯減少。這提示中樞神經系統處于抑制狀態。由早期的興奮狀態轉為后期的抑制狀態，這都是神經行為發生了異常的表現。

2.6 低劑量氚水β 粒子子宮內照射對出生后仔鼠學習能力及記憶功能的影響[18,23-24]

對仔鼠學習能力及記憶功能的評價可揭示氚水β 粒子子宮內照射對中樞神經系統高級功能的影響。

研究結果顯示，對于小鼠仔鼠的電擊回避學習情況，與對照組相比，中、高劑量照射可以導致仔鼠在學習能力上的明顯差異，具體表現為初次和再次學習時出現高比例的失敗。在對已產生記憶的仔鼠記憶保持情況的檢測中，與對照組相比，中、高劑量照射組動物記憶喪失比例增加的差異有統計學意義。子代小鼠食物迷宮實驗測試結果顯示，與對照組相比，低劑量照射組仔鼠首次獲食時間顯著縮短；中、高劑量照射組仔鼠的首次進食時間和平均獲食時間也顯著縮短；平均錯誤次數在照射組中呈現隨劑量增大逐漸增加的趨勢，與對照組相比，高劑量照射組仔鼠的平均錯誤次數顯著增加，且差異有統計學意義。食物迷宮實驗結果提示受照仔鼠的中樞神經系統處于興奮狀態。

在水迷宮實驗中，與對照組相比，低、中、高各劑量照射組仔鼠的平均錯誤次數都明顯增加；而各劑量組首次登岸時間和平均登岸時間兩項指標間的差異并無統計學意義；在Y 迷宮刺激回避反射實驗中，低劑量照射組仔鼠的刺激單向回避反射的逃避時間顯著延長，中、高劑量照射組仔鼠的回避反射的無誤率及陽性率均比對照組顯著降低。低劑量照射組仔鼠條件反射的每日達標率從實驗開始到結束均與對照組的差異無統計學意義，而中、高劑量照射組仔鼠的初期達標率顯著降低。經學習后雖然有所改善，但達標率達到最高值（中、高劑量照射組分別僅為50%和約42%）后反而在測定后期呈現降低趨勢。

大鼠仔鼠Y 迷宮刺激回避反射實驗的檢測結果表明，與對照組相比，即使是低劑量照射組的仔鼠，其逃避時間也已明顯延長；中、高劑量照射組的仔鼠，其逃避無誤率顯著降低；但所有受照仔鼠在最終測定時，其逃避無誤率的差異已無統計學意義。子代大鼠條件反射的實驗結果與子代小鼠的結果基本一致。與對照組相比，低劑量照射組大鼠仔鼠的每日達標率均無顯著變化；而中、高劑量照射組大鼠仔鼠的每日達標率顯著降低，且差異有統計學意義。雖然其條件反射每日達標率隨訓練時間的延長而增加，但最高值也不超過50%。

2.7 低劑量氚水β 粒子子宮內照射對仔鼠腦發育及腦細胞學的影響[25-29]

以腦體重量比、大腦和小腦皮質厚度、大腦皮質第五層錐體細胞和小腦浦氏細胞計數、大腦錐體細胞發育（初級、次級樹突數及樹突分枝比）和腦海馬各區錐體細胞計數等腦組織病理學終點為指標，就氚β 粒子輻射對仔鼠腦發育及腦細胞學的影響進行了評價。

結果顯示，出生前照射對仔鼠腦重有著顯著的影響。中、高劑量照射組45 天 齡仔鼠的腦重與對照組相比顯著降低。腦體重量比的結果也表明，出生前氚水β 粒子照射會明顯降低仔鼠的腦體重量比，與對照組相比，中、高劑量照射組21 天齡仔鼠，以及高劑量照射組49 和66 天齡仔鼠的腦體重量比均明顯降低。對于大腦皮質和小腦皮質厚度，其減少程度與受到的照射劑量的增加呈正相關趨勢，但僅在高劑量照射組差異有統計學意義。與對照組相比，低劑量照射組150 天齡雄性仔鼠的大腦錐體細胞數、小腦浦氏細胞數以及大腦錐體細胞初級樹突數、次級樹突數和樹突比值已顯著減少，且差異均有統計學意義。在小鼠仔鼠21 和66 天齡時，研究人員就氚水β 粒子照射對仔鼠海馬CA1、CA2、CA3 和CA4 區錐體細胞數的影響進行了解析，結果表明，即使受到低劑量的照射，各天齡仔鼠的CA1 區錐體細胞數就已經顯著減少；CA2 和CA4 區錐體細胞數的顯著減少只發生在高劑量組仔鼠低天齡時；而對CA3 區錐體細胞數的影響介于前述兩者之間。

大鼠實驗得到了與上述小鼠實驗相似的結果。以52 天齡仔鼠腦體重量比為例，與對照組相比，高劑量氚水β 粒子照射組仔鼠的腦體重量比顯著降低。氚水β 粒子照射對子代大鼠海馬錐體細胞的影響亦表現為海馬各個腦區對輻射敏感性的不同。其中以CA1 區最為敏感，與對照組相比，低劑量照射組仔鼠錐體細胞數已經發生明顯的減少，細胞減少的程度隨受到照射的劑量的增加而加重。CA3 區錐體細胞數的顯著減少發生在中劑量照射組，CA4 區錐體細胞數的顯著減少只發生在高劑量照射組，而CA2 區錐體細胞數在各個照射組仔鼠中并沒有發生明顯的改變。在大鼠妊娠第10 天，經腹腔單次注入放射性活度為370×104Bq/g 動物體重的氚水，結果顯示，仔鼠腦內與神經細胞遷移相關的神經細胞黏附分子的表達受到抑制，神經細胞的遷移和分布發生異常。而與子宮內氚水β 粒子照射的影響相比，子宮內γ 射線照射的實驗結果顯示，需要較高的劑量才能誘發差異有統計學意義的顯著變化。比如：用γ 射線照射妊娠11 d 的大鼠孕鼠，在劑量高于0.15 Gy 時，仔鼠海馬錐體細胞計數才出現顯著減少；1.0 Gy 時才可使20 天齡的大鼠仔鼠海馬下托等腦皮質發生形態學的改變。

2.8 低劑量氚水β 粒子子宮內照射對仔鼠腦神經肽含量的影響[30]

在腦組織神經生物化學方面，就輻射對雄性小鼠仔鼠腦垂體生長抑素和下丘腦精氨酸加壓素兩種腦神經肽的含量變化進行了探討。結果顯示，氚水β 粒子子宮內照射可以對腦垂體中生長抑素的含量產生影響：隨著照射劑量的增加，生長抑素的含量也在增加；與對照組相比，中、高劑量照射組則出現了顯著升高。而下丘腦中精氨酸加壓素含量的變化趨勢卻與此相反，即隨著照射劑量的增加，精氨酸加壓素的含量卻在減少；與對照組相比，高劑量照射組仔鼠下丘腦中精氨酸加壓素含量顯著降低。與此相比，γ 射線連續照射對小鼠仔鼠腦垂體生長抑素含量的影響的閾劑量為0.1～0.2 Gy。

2.9 氚β 粒子照射對初代培養腦組織細胞形態學、電生理學和生物化學的影響[28-29,31-32]

這些研究在細胞和分子水平觀測了腦組織結構；在神經生化和行為功能方面，通過體外初代培養大鼠腦組織細胞和ICR 品系胎鼠中腦組織細胞的方法，探求病變發生的基礎。并以海馬神經元計數和Ca2+電流幅度變化評價了氚輻射對腦海馬神經元及其電生理學的影響；以中腦細胞p53 蛋白質表達、細胞周期變化和細胞凋亡為指標，觀察了氚輻射特別是有機氚化核苷酸對腦細胞形態學和生物化學指標的影響，探討了低劑量氚β 粒子子宮內照射對發育中的中樞神經系統影響的機制。

2.9.1 子宮內低劑量氚水β 粒子照射對大鼠仔鼠海馬神經元的影響[28-29]

海馬是腦邊緣系統中最重要的結構之一，經過腦干網狀結構接受來自外周的視覺、聽覺、觸覺、痛覺、本體感受性和內感受性刺激所產生的感受性沖動，是腦中情感行為和學習記憶等高級神經活動的重要部位。這兩項研究利用體外初代細胞培養的方法，培養經過酶解分散后的海馬神經元，并對在子宮內受到低劑量氚水β 粒子照射后出生的大鼠仔鼠的海馬神經元的形態學和電生理學指標進行了觀測[28-29]。神經元形態學指標包括細胞體的大小、表面光潔度、邊緣清晰度、胞體暈光程度和折光性強度、神經突觸和突觸分枝以及神經網絡的形成。與取材于對照組仔鼠的海馬神經元形態學指標相比，取材于中、高劑量照射組仔鼠的海馬神經元數量顯著減少、生長緩慢、胞體較??；退化出現早，呈現為細胞輪廓不清、界限模糊、胞漿顆粒增多，出現空泡、腫脹、斷裂、崩解和網絡稀疏。關于電生理學指標的檢測，研究采用膜片鉗技術，通過細胞外液的河豚毒阻斷鈉電流，電極內液中的氯化銫阻斷鉀電流以獲得理想的Ca2+電流；在膜片鉗放大器上，用全細胞記錄方式測定海馬神經元最大Ca2+電流，比較Ca2+電流幅度；使用步幅遞增的去極化刺激的方法，誘發幅度不同的Ca2+電流而測繪出相應的電流電壓曲線。結果顯示，Ca2+電流的衰減取決于神經元的狀態，而與受照劑量和培養時間無關。與取材于對照組仔鼠的海馬神經元相比，取材于高劑量照射組仔鼠的海馬神經元Ca2+電流顯著下降。

2.9.2 氚β 粒子照射對體外初代培養的小鼠胎鼠中腦細胞在細胞及分子水平的影響[31-32]

利用體外初代細胞培養的方法，對經過酶解分散后的小鼠胎鼠中腦細胞進行培養，并在培養基中加入氚水，或氚化胸腺嘧啶、氚化尿嘧啶、氚化谷氨酸和氚化精氨酸等有機氚化物，并以X 射線為參考輻射，來檢測氚β 粒子照射對小鼠胎鼠中腦細胞的細胞形態學、細胞周期、細胞分化和增殖、p53 蛋白質表達以及細胞凋亡的影響。結果顯示，氚β 粒子照射可以導致中腦細胞p53 蛋白質高表達、細胞核凝集、DNA 梯狀斷裂、周期阻滯、細胞分化和增殖受阻，以及細胞凋亡。特別需要指出的是，以上述絕大多數生物學終點為評價指標而獲得的氚β 粒子的相對生物效能值為4.6～8.7，以來自氚化胸腺嘧啶的為最高。兩種氚化物或者一種氚化物與X 射線的同時照射可以對細胞分化產生更大的抑制效應。小鼠胎鼠中腦初代培養細胞對氚β 粒子比X 射線更為敏感，0.05 Gy 低劑量即可引起可檢測到的抑制效應。

2.10 氚β 粒子照射對小鼠和大鼠發育中的中樞神經系統致畸的閾劑量[12,20-21]

在氚β 粒子照射對發育中的中樞神經系統影響的研究中，作為評價指標所使用的56 項生物學終點的絕大多數（＞80%）所顯示的致畸的閾劑量值在0.092 Gy 以下。關于氚β 粒子生物影響閾劑量方面的研究，本?？形恼铝碜髟敱M的總結，在此不多贅述。

3 總結

3.1 氚β 粒子的子宮內照射與原子彈爆炸的γ 射線等的子宮外照射的異同點

電離輻射對發育中的中樞神經系統的影響及其機制的研究是ICRP 和UNSCEAR 重要的課題。輻射對胚胎和胎兒的致畸效應屬于特殊軀體效應。胎兒在主要器官發生期受到照射，會導致包括中樞神經系統在內的各主要器官在結構和功能方面的損傷。不同器官組織對輻射的敏感性存在著差異，而且不同器官組織對輻射最敏感的時期也存在著差異。因此輻射所致損傷的嚴重程度不僅與照射劑量相關，還與組織器官的發生階段相關。對原子彈爆炸幸存者開展的流行病學研究的結果是該領域目前評價輻射危險度的主要依據。但這些結果局限于對一次性短時間內高劑量率輻射所產生的影響的調查，并不能準確地反映出連續性長時間內低劑量率輻射所致的生物效應。特別是對于中樞神經系統這樣的輻射敏感性隨著發育階段而變化的機體系統，不同的照射情況會直接導致輻射危險度的不同。

雖然胎兒體內各個組織器官中的含水量存在著一定的差異，但氚水在腦組織中基本呈均勻分布。胎兒在主要器官發生期受到氚水β 粒子連續性長時間照射的情況，與原子彈爆炸時胎兒受到γ 射線和中子粒子單次短時間照射的情況完全不同。對于氚水β 粒子照射，從主要器官發生期開始一直到仔鼠出生（不包括通過哺乳的氚攝入以及離乳后仔鼠體內殘留氚的衰變所產生的照射，也忽略氚衰變過程中生成的中微子可能產生的任何影響），一直受到氚水β 粒子照射，因此包括腦組織在內的多種組織器官，都在對輻射最敏感的時候受到了照射；而在主要器官發生期時胎兒所受到的原子彈爆炸照射是一瞬間的，并且只有一部分組織器官在它們對輻射最敏感的時候受到了照射。另外，氚衰變所放出的β 粒子是低能量帶負電荷的電子，雖然氚水在細胞中均勻分布，但由于氚β 粒子的射程短，與低線性能量傳遞γ 射線的光子相比，其具有相對較高的線性能量傳遞值，在細胞內的微劑量分布是不均一的。特別是以氚化胸腺嘧啶等形式存在的氚化核苷酸，其參與DNA 合成，可以導致細胞核局部劑量較高，進而對處于增殖狀態的細胞產生更嚴重的損傷，可以產生比較高的相對生物效能。原子彈爆炸產生的中子粒子雖然是高線性能量傳遞輻射，但其對總劑量的貢獻度不高，而氚水照射所產生的劑量全部來自β 粒子。

3.2 氚β 粒子輻射與影響發育中的中樞神經系統的指標間的相關性

由于機體是由中樞神經系統調控的由分子、細胞、器官和組織所構成的一個相互關聯、相互制約、高度復雜的綜合有機體，腦的學習和記憶功能在相當程度上受制于如運動、心血管和內分泌等諸多系統。在評價氚β 粒子輻射對發育中的中樞神經系統的影響機制時，需要同時考慮來自氚輻射導致的其他系統影響所產生的相關作用。

中樞神經系統結構的復雜性和能力的代償性，決定了單一或少數幾個行為試驗不足以揭示輻射對機體整個行為的影響，而必須采用一組行為實驗進行縱向追蹤觀察。周湘艷團隊的實驗利用輻射的行為致畸學試驗方法，通過生長發育、早期反射和感覺功能、運動協調功能和活動度及學習記憶功能等多項指標對出生前氚水照射產生的行為致畸進行了較全面的研究。體重增長的變化是較行為改變更靈敏的指標，檢測在子宮內受到氚β 粒子照射后出生的仔鼠體重和生長發育指標的變化，是從生理學角度綜合全面地評價包括發育中的中樞神經系統在內的全身各個系統的方法。研究結果顯示，與對照組相比，低劑量照射組仔鼠出生時的體重更低，體重增長更慢；低劑量照射組張耳和出牙時間已經顯著延遲；中、高劑量照射可以導致仔鼠開眼、平面翻正和聽覺驚愕的平均達標天齡顯著延遲；高劑量照射造成前肢懸掛時間的縮短；而睪丸下降和陰道張開在各實驗組間的差異無統計學意義。有趣的是，低劑量γ 射線宮內一次照射對仔鼠出生后生長發育及行為產生顯著影響的最低劑量為0.106～0.518 Gy，即便是低劑量γ 射線宮內持續照射（妊娠13～18 d），對小鼠生長發育及反射行為影響的劑量也高達0.21～0.42 Gy。這些研究結果說明，在出生前受到氚水照射，即便在低于誘發同樣效應的γ 射線的最低劑量時，已經可以觀察到氚水對機體不同的組織系統產生不同程度的抑制作用。事實上，條件反射的建立、運動行為的學習和記憶的鞏固與身體的諸多系統（如心血管系統、內分泌系統和運動系統）都是密切相關的。體重和生長發育指標，不僅可以間接甚至直接用于評價輻射致畸作用，而且還是被公認的最靈敏的指標。需要特別指出的是，盡管用于評價氚β 粒子影響的生物學終點指標的敏感性存在著一定的差異，但由于研究在多層次多水平都采用了多項綜合指標，而且所獲得的實驗結果中絕大多數指標的變動程度都呈現了良好的劑量-效應的相關性，這為劑量-效應關系的解析提供了有效的樣本數和統計學效力，保證了對致畸閾劑量值估算結果的高度信賴性。

對腦病理學改變的檢測是研究輻射對腦發育影響最經典的方法，包括腦重，此外腦組織構造（如皮質厚度、細胞分布）、神經細胞數量和突觸等生物學終點都是常用的指標。高衛民和周湘艷[33]研究并總結發現，γ 和X 射線照射改變體外海馬組織的電生理特性的劑量至少需要幾個戈瑞。與仔鼠的體重改變情況一樣，外照射的研究結果提示，在小于0.5 Gy 劑量下的子宮內照射未見腦重有明顯改變，而致腦皮層厚度改變的外照射劑量為1 Gy。對于成熟仔鼠，體重的差異已經不再具有顯著性，中、高劑量組仔鼠全腦重均分別低于對照組，腦發育受阻的程度大于體重發育所受的阻礙。而大腦和小腦皮質厚度變薄、錐體細胞數減少、初級和次級樹突數和比值明顯減少、海馬錐體細胞數減少以及腦神經元細胞缺失的結果，從解剖學和生理學的病因學方面也強有力地支持神經行為異常改變的劑量-效應關系。子宮內照射使腦神經元細胞缺失和殘存神經元細胞發育不良，直接影響錐體系和錐體外系傳導、神經元的化學信息傳遞和大、小腦之間的聯系，造成軀體運動調節功能障礙，導致腦神經系統功能減退：新生鼠反射發育遲緩，成年鼠智力活動失調和遲鈍。

動物神經行為學常用電擊回避和迷宮實驗觀測動物本能傾向、條件反射的建立、記憶鞏固過程和保持能力。通過檢測動物初級和高級學習記憶功能的變化，評估輻射對學習和記憶功能以及智力影響的危險度。比如電擊回避學習訓練結果表明：低劑量照射的仔鼠對短期學習發生障礙，但經過連續訓練學習后可以恢復；而在對電擊回避記憶保持上，中、高劑量照射組的仔鼠存在長期記憶障礙。這些結果提示了氚輻射損害了仔鼠記憶鞏固過程。周湘艷團隊的研究以腦組織內神經活性物質變化為指標，從腦神經生化學角度進行評價，可以直接用神經行為的變化推論損傷的因果關系。比如可以通過生長抑素和精氨酸加壓素神經肽的改變解釋生長發育和學習記憶的變化。生長抑素的主要生理功能是抑制垂體前葉生長激素的釋放，具有廣譜的抑制對象，包括消化系統和內分泌系統。精氨酸加壓素的主要生理功能是通過調節體液的滲透壓，調控運動和心血管系統。精氨酸加壓素還有鞏固記憶、間接改善注意力、學習和短期記憶的作用。高劑量照射組的仔鼠腦垂體生長抑素含量的增高和下丘腦精氨酸加壓素含量的減少，也與生理學標志完善的遲延和神經行為障礙存在劑量相關性。同時，作為與光子輻射比較的重要研究，低劑量γ 射線宮內持續照射（妊娠13～18 d）導致仔鼠腦組織生長抑素降低的有效劑量為0.1～0.2 Gy，這一劑量與體重和生理指標的影響結果也呈現出良好的相關性。

初代培養腦組織神經元的方法為在基因表達、分子和細胞水平揭示氚輻射影響機制的研究提供了非常接近體內情況的體外實驗系統。王冰和周湘滟[26]首次把檢測神經形態學和神經電生理學的變化應用于對低劑量輻射影響的研究。取自中、高劑量照射組動物的海馬神經元表現出生長緩慢、胞體較小和早期退化的情況。神經元生長發育與增殖能力的抑制作用呈現出良好的劑量相關效應。離子通道是神經、肌肉和其他組織細胞膜興奮性的基礎，也是生物電活動的基礎。Ca2+具有遞質釋放、肌肉收縮和第二信使作用等極重要的生理功能。用膜片鉗技術記錄海馬神經元Ca2+通道，結果發現，隨氚水照射劑量的增加，Ca2+電流有下降趨勢，在高劑量照射組出現顯著性下降。Ca2+電流降低，與輻射導致的海馬神經元功能受損密切相關，也可能對海馬神經元突觸活動產生影響，發生如突觸電位的改變、神經遞質釋放減少和神經信息傳導的不良，從而導致神經行為尤其是學習記憶功能的嚴重受損。另一方面，受到氚照射的腦細胞中p53 蛋白表達增高、細胞周期阻滯、DNA 斷片增多和細胞凋亡增加，也提示了中樞神經細胞受到氚水β 粒子照射后，會發生p53 依賴性細胞凋亡。

3.3 氚β 粒子輻射對發育中的中樞神經系統影響的機制概括

氚β 粒子輻射致發育中的中樞神經系統損傷的機制，可以用輻射致神經元等細胞，特別是干細胞的DNA 損傷、Ca2+電流幅度下降、p53 蛋白質高表達、細胞周期阻滯和細胞凋亡的增加，阻礙了對細胞分化、遷移、增殖和細胞突出形成，導致了中樞神系統在組織發生學和神經生物化學的變化，進而產生神經行為學的異常來合理地推理和解釋。3.4 氚β 粒子輻射對發育中的中樞神經系統的致畸閾劑量值

本?？形恼铝碜髟敱M的總結，在此不多贅述。

4 展望

周湘滟團隊的研究在世界上是第一次在同一系列實驗系統中，從分子、細胞、器官到整體，從組織結構、神經生化、行為到學習記憶功能，從動物的個體到細胞的離體培養，綜合評價了低劑量氚β 粒子連續照射對發育中的中樞神經系統的危險度。這些基于多水平、多層次的研究所取得的科研成果，為中國研究人員在氚β 粒子輻射對發育中的中樞神經系統影響的研究領域奠定了一座光輝的里程碑。特別是所得出的氚β 粒子的致畸閾劑量值，低于ICRP 和UNSCEAR 所推薦的基于γ 射線劑量當量所估算的數值。這些重要的研究成果為全面系統地評價氚β 粒子的危險度，提供了最具可信度和權威性的科學依據。這些基于多生物學終點指標和多水平、多層次的研究成果，還為今后在輻射對中樞神經系統影響研究中方法學的恰當選擇，如實驗體系的建立、生物學終點的選擇、照射劑量組的設定、結果分析數學模型的采用以及多因素因果關系解析的統計學方法的應用等，提供了重要信息。

關于氚生物學效應的研究迄今已有將近70 年的歷史。氚輻射潛在的健康危害已經得到國內外學者和國際權威機構的高度重視。雖然我國學者在氚β 粒子輻射對發育中的中樞神經系統影響及其機制研究方面取得了累累碩果，但他們沒有滿足于現狀，仍在繼往開來、不斷創新。關于氚的相關研究的最新進展，最近張蒙等[34]和李圣日等[35]綜述了氚的環境排放、吸收劑量估算和氚生物學效應，特別是致癌效應、致畸效應和致突變效應，為更深入地研究氚輻射危險度提供了新的思路。另外，在有關氚水照射對空間學習記憶能力影響機制方面，又取得了喜人的新進展[36]。例如，就氚水β 粒子照射對初代培養的大鼠新生仔鼠海馬細胞遷移相關因子表達的變化，特別是骨架蛋白、腦源性神經細胞營養因子及絡絲蛋白的mRNA 的表達情況做了詳盡的調查研究。氚水β 粒子輻射通過引起神經元細胞發生DNA 雙鏈斷裂，促進其p53 基因表達，引發細胞凋亡及超氧陰離子釋放減少，最終導致神經元增殖的抑制。

雖然氚被視為低毒核素，最大容許負荷為3.7×107Bq，然而越來越多的動物實驗結果顯示，氚β 粒子子宮內照射致中樞神經系統畸形的閾劑量低于γ 射線。盡管這些結果不能直接外推到人類，但是這些結果提示我們需要重新考慮有關氚的最大容許負荷問題。隨著生命科學以及與其相關學科的技術進步和方法創新，在輻射對發育中的中樞神經系統的影響及其機制的研究領域，學者們必將利用更精準可靠的實驗體系和客觀合理的解析方法，在多水平、多層次深入地探討和不斷完善，并將基于動物實驗所取得的成果客觀地外推于人類，逐步制定合理的防護標準，使核技術在保護人類健康的同時造福人類。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 王冰、周湘艷負責文章中實驗的開展、初稿的撰寫；崔鳳梅負責文章的校對和修改