三疣梭子蟹受精卵離體孵化技術

牛雪瑩， 任志明， 吳佳穎， 母昌考*， 王春琳

(1. 寧波大學海洋學院，水產生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211；2. 寧波大學機械工程與力學學院，浙江 寧波 315211)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一種重要的海洋經濟甲殼類動物，廣泛分布于印度洋和西太平洋沿海水域[1]，其肉質鮮美、營養豐富，深受大眾喜愛，是中國沿海地區的特色海鮮[2]。2020年全國梭子蟹養殖產量達到10.09萬t，全國海洋捕撈產量42.46萬t，全國海水養殖面積20 671 hm2，產量和養殖面積均比2019年有所下降[3]，養殖技術急需改進。優質的苗種是養殖成功的關鍵，而三疣梭子蟹苗種的培育受多種病害的制約[4]，如弧菌病、固著類纖毛蟲病、發光病，黑鰓病和蛻殼障礙病等[5]都會在三疣梭子蟹幼體培育階段產生嚴重危害?，F有育苗生產過程，都是將抱卵蟹(攜帶受精卵的親體)直接放入育苗池進行幼體孵化，這種操作方式會導致極高的污染率，以上病原生物大部分是由抱卵蟹直接接觸育苗水體及初孵幼體(Z1)進行傳播的。

胚胎離體培養技術將受精卵和親體分離，能夠有效避免來自親體病原生物感染幼體的風險，但是關于甲殼動物胚胎離體孵化的研究進展緩慢。Cheng等[6]發現，如果采用合理的消毒、SPF檢測和病原分離方法，利用最佳的卵密度和孵化體系，就可以實現紅螯光殼螯蝦(Cherax quadricarinatus)的規?；x體生產。但離體孵化的效果往往與胚胎離體的時間呈負相關[7]。本研究以孵化率、孵化時間和幼體活力為評價指標，開展三疣梭子蟹離體孵化技術研究，可為三疣梭子蟹的苗種繁育提供新的技術手段，也將為基因編輯輔助育種等技術的實施奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗蟹飼養與管理

本研究中三疣梭子蟹親體(260±50) g來自寧波市奉化區臭皮匠水產養殖場，挑選附肢健全，活力好，無機械損傷的親蟹暫養于寧波大學海洋學院中試基地，采用帆布池作為培育池(長1.5 m，寬1.0 m，高0.6 m)，占池底面1/2位置鋪上厚15 cm 經過消毒處理的海沙作為棲息區；其余1/2作為投餌與親蟹攝食區，水位40 cm，日換水50%。親蟹的餌料主要是活沙蠶，每日換水后投餌料，日投餌量為親蟹總體重的10%～15%。實驗過程中操作人員嚴格遵守實驗動物福利倫理規范。

1.2 實驗設計

最適受精卵塊分離液的篩選 親蟹抱卵后，用無菌手術剪從親蟹腹部剪下受精卵約3 000顆，用消毒海水清洗3遍后，在消毒海水中充氣暫養8 h，再進行分離實驗。實驗設置4個酶液處理組，分別為中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和混合酶液(中性蛋白酶∶堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶 = 1∶1∶1，體積比)。酶液均由消毒海水配制，每組設置3個平行，每個平行放入成串的受精卵(200±20)顆，將受精卵和不同濃度的酶液放入一次性培養皿中，置于25 °C搖床中，轉速40 r/min。第一步，以酶濃度0.03 g/mL，處理2 h后測定分離率(分離率=單粒狀態受精卵數/受精卵總數)，依據分離率篩選出最適酶液種類。第二步，選取最適酶液種類，均設置3個濃度梯度：0.03、0.06和0.09 g/mL，處理2 h后測定分離率，依據分離率篩選出最適酶液濃度。第三步，選取最適酶液種類，在最適作用濃度下，進行最適處理時間的測定。最終確定最適分離液的種類及處理條件。

透射電鏡觀察分離液作用后卵膜的變化實驗分組三組，以沒有處理過的受精卵作為對照組，處理組1為0.09 g/mL木瓜蛋白酶作用30 min的受精卵，處理組2為0.09 g/mL混合酶液作用30 min的受精卵。采集樣品后立刻用戊二醛進行固定，然后用常規方法制備電鏡超薄切片(Lee H T, 2009)，用日立透射電鏡(H-7650)型透射電子顯微鏡，對超薄切片進行觀察，對卵細胞結構拍照，著重觀察卵膜結構。

不同時期受精卵離體孵化情況 親蟹抱卵后，剪取卵裂期、囊胚期、原腸胚、卵內無節幼體期、卵內溞狀幼體期的受精卵置于已篩選的最佳分離液中進行處理。用消毒海水沖洗5次后，將分離后的單粒受精卵放入離體孵化裝置。每天換水1次，海水經0.22 μm濾膜過濾后使用，控制pH在8.0～8.5，水溫25～26 °C，鹽度為25，溶解氧含量為8 mg/L，光環境為室內自然光照，每組實驗重復3次。

幼體活力測試 ①干露耐受力測試，從離體孵化器(原腸期)和親蟹育苗池中隨機選?、衿跍袪钣左w，置于墊有吸水紙的100目篩絹上。設置時間間隔為5、10、15、20和25 min。每個時間間隔組取10只Ⅰ期溞狀幼體，設置3個平行。干露結束后，立即將幼體放入盛有消毒海水的燒杯內，對強光沒有反應的幼體可判定其死亡，隨后觀察并記錄存活率。實驗分組包括對照組(不經分離液處理卵巢孵化幼體)、0.09 g/L木瓜蛋白酶組、0.09 g/L混合酶液組和母體孵化組。

②福爾馬林耐受測試，從離體孵化器(原腸期)和親蟹育苗池中隨機取10只Ⅰ期溞狀幼體，分別放入100 mL的燒杯中，設福爾馬林分為30、40、50、60和70 mg/L共5個濃度梯度(使用質量分數為40%的甲醛配置)，每個濃度組取10只Ⅰ期溞狀幼體，設置3個平行，3 h后觀察幼體的活動以及存活情況。實驗分組同干露耐受力測試。

③行為學觀察，從離體孵化器和親蟹育苗池中各隨機取10只Ⅰ期溞狀幼體置于行為拍攝室內拍攝觀察(全暗)。行為拍攝室為一個全部遮黑玻璃缸(長10 cm×寬3 cm×高12 cm)，在缸的頂部正中央放置光源，缸的正前方放置拍攝相機，缸后垂直放置1 cm×1 cm的刻度板。

針對獲取的視頻進行分析統計，記錄以下行為參數。趨光響應時間(s)：開燈瞬間到幼體開始游動的時間。運動速度(cm/min)：幼體游向光源的速度。運動距離(cm)：幼體游向光源的路徑長度。

1.3 數據分析

所有的實驗數據均以平均值±標準誤 (n=3)表示，用 Levene 氏法確定是否符合正態分布和方差齊性，之后再采用 SPSS 22.0 軟件對所有數據進行雙因素方差分析 (Two-Way ANOVA)，若存在顯著差異，則用 Tukey氏檢驗對數據進行多重比較分析，當P＜0.05 時，則認為組間在統計學上具有顯著差異。使用 GraphPad Prism 8.0.2 軟件 (美國) 進行圖形處理。

2 結果

2.1 不同分離液及其濃度對受精卵塊的分離效果

設定酶液作用時間為2 h，隨著濃度的增加，不同處理組的分離率均有所提升，組間分離率存在顯著差異。酶液濃度為0.03 g/mL時，堿性蛋白酶液、中性蛋白酶液、木瓜蛋白酶液和混合酶液的分離率分別為11.67%、23.34%、100.00%和100.00%。酶液濃度為0.06 g/mL時，堿性蛋白酶液、中性蛋白酶液、木瓜蛋白酶液和混合酶液的分離率分別為24.33%、36.00%、100.00%和100.00%；酶液濃度為0.09 g/mL時，堿性蛋白酶液、中性蛋白酶液、木瓜蛋白酶液和混合酶液的分離率分別為55.00%、64.67%、100.00%和100.00% (圖1)。結果顯示，酶液處理2 h，木瓜蛋白酶液和混合酶液在三個濃度下分離率均可達到100%，將作用時間縮短至30 min，在0.03、0.06 和0.09 g/mL的濃度下進行分離實驗。結果顯示，酶液作用時間為30 min，濃度為0.09 g/mL的酶液處理組，木瓜蛋白酶液和混合酶液的分離率也為100% (圖2)。隨后，選取木瓜蛋白酶液和混合酶液，酶液濃度為0.09 g/mL，作用時間為30 min，進行最適作用時間測定。結果顯示時間與分離率呈正相關，在酶液濃度為0.09 g/mL，作用時間為30 min時，可以達到最佳的分離效果(圖3)。

圖1 不同濃度酶液處理2 h的三疣梭子蟹卵塊的分離率不同小寫字母表示相同酶液濃度下，不同酶液之間卵塊分離率存在顯著差異(P＜0.05)；不同大寫字母表示相同酶液在不同濃度下卵塊分離率存在顯著差異(P＜0.05)，圖2～3同。Fig. 1 Effect of enzyme solution treatment on separation rate of P. trituberculatus egg block after 2 hDifferent lowercase letters indicate that under the same concentration of enzyme solution, there is significant difference in egg mass separation rate between different enzyme solutions (P＜0.05); different capital letters indicate significant difference in egg mass separation rate under different concentrations of the same enzyme solution (P＜0.05), the same as Figs.2-3.

圖2 不同濃度的木瓜蛋白酶液和混合酶液處理30 min的三疣梭子蟹卵塊的分離率Fig. 2 Effect of enzyme solution treatment on separation rate of P. trituberculatus egg block after 30 min

圖3 0.09 mg/L木瓜蛋白酶液和混合酶液處理三疣梭子蟹卵塊30 min的分離率Fig. 3 Effect of enzyme solution treatment on separation rate of P. trituberculatus egg block after 30 min

2.2 透射電鏡觀察分離液作用后卵膜的變化

透射電鏡觀察結果顯示，與對照組相比，經過酶液處理的受精卵的外卵膜結構稀疏，與內卵膜出現明顯的分層(圖4-a)。其中，木瓜蛋白酶處理的受精卵的外卵膜在厚度上減少至對照組的一半(圖4-b)，混合酶液處理的受精卵的外卵膜出現分層，但厚度沒有明顯變化(圖4-c)。

圖4 卵膜的透射電鏡觀察(a)對照組；(b)處理組1，為0.09 g/mL木瓜蛋白酶作用30 min的受精卵；(c)處理組2，為0.09 g/mL混合酶液作用30 min的受精卵。im.內卵膜，om.外卵膜。Fig. 4 Transmission electron microscopy transverse sections of the outer egg membrane(a) control group; (b) treatment group 1, the concentration of the papain was 0.09 g/mL and the separation time was 30 min; (c) treatment group 2, the concentration of the mixed enzyme was 0.09 g/mL and the separation time was 30 min. im. inner egg membrane, om. outer egg membrane.

2.3 不同發育階段受精卵離體孵化情況

在孵化水溫為(25±1) °C時，不同發育時期的離體胚胎在對照組、處理組1與處理組2處理后均能孵化出幼體，但孵化率存在顯著差異(圖5)。卵裂期受精卵塊的孵化率為31%，處理組1的孵化率為58%，處理組2的孵化率為64%。囊胚期受精卵塊的孵化率為42%，處理組1的孵化率為72%，處理組2的孵化率為72%。原腸期受精卵塊的孵化率為57%，處理組1的孵化率為76%，處理組2的孵化率為75%。卵內無節幼體期受精卵塊的孵化率為59%，處理組1的孵化率為89%，處理組2的孵化率為85%。卵內溞狀幼體期受精卵塊的孵化率為70%，處理組1的孵化率為89%，處理組2的孵化率為87%。對照組受精卵塊的孵化率比處理組低，且差異顯著(P＜0.05)，兩個處理組孵化率差異不顯著(P＞0.05)，且發育期越靠后，胚胎的孵化率越高。

圖5 不同發育時期三疣梭子蟹胚胎的的離體孵化效果1.卵裂期，2.囊胚期，3.原腸期，4.卵內無節幼體期，5.卵內溞狀幼體期。不同小寫字母表示相同發育時期，不同酶液之間孵化率差異顯著；不同大寫字母表示相同酶液在不同發育時期孵化率差異顯著。Fig. 5 Effects of P. trituberculatus embryo incubation in vitro at different developmental stages1. cleavage stage, 2. blastula stage, 3. gastrula stage, 4. nauplius stage, 5.zoea stage. Different lowercase letters indicate that there are significant differences in hatching rate between different enzyme groups at the same development stage; different capital letters indicate that the hatchability of the same enzyme group is significantly different at different developmental stages.

2.4 幼體活力測定

耐干露測試 孵化后的幼體進行耐干露試驗，包括對照組、木瓜蛋白酶組、混合酶液組、母體孵化組，4個組幼體耐干露能力無顯著差異(P＞0.05)，5 min內幼體的死亡率在5 %以下，15 min后幼體死亡率顯著上升(圖6)，在干露20 min后，幼體全部死亡。

圖6 干露對三疣梭子蟹幼體死亡率的影響不同字母表示在同組內，不同酶液之間死亡率存在顯著差異(P＜0.05)，圖7同。Fig. 6 Effects of exposure to air on the mortality rate of larval P. trituberculatusDifferent letters indicate that in the same group, there is significant difference in mortality rate between different enzyme solutions (P＜0.05),the same as Fig.7.

福爾馬林耐受測試 幼體的存活率受福爾馬林濃度的影響較為顯著，在濃度為30 mg/L的條件下，幼體在3 h時的死亡率在10%以下(圖7)，4個組無顯著差異(P＞0.05)。隨著福爾馬林濃度的升高，幼體的死亡率顯著升高。

圖7 不同濃度福爾馬林脅迫3 h后對三疣梭子蟹幼體存活率的影響Fig. 7 Effects of formalin on the survival rate of larval P. trituberculatus

行為學觀察 在完全黑暗的條件下，出現光源時，4個處理組的幼體響應時間沒有顯著差異(圖8)，平均響應時間為2.43 s；平均運動距離和平均運動速度分別為8.34 cm和1.65 cm/s，均無顯著差異(P＞0.05)。

圖8 離體和母體培養條件下三疣梭子蟹幼體的行為觀察(a)響應時間，(b)運動速度，(c)運動距離；1.混合酶，2母體，3.木瓜蛋白酶，4對照。Fig. 8 Observation of larval P. trituberculatus under the conditions of in vitro incubation and parental hatch(a) reaction time, (b) speed, (c) movement distance; 1. mixed enzyme, 2.parent hatched, 3. papain, 4. control.

3 討論

3.1 不同分離液對受精卵塊的分離效果

三疣梭子蟹產卵后，受精卵通過黏液腺分泌的黏液形成卵柄和外層卵膜，將其固著在腹肢的剛毛上，直到孵化[8]。但是甲殼類在離體培養時，受精卵之間黏連的黏液會附著大量的病原生物，例如聚縮蟲[9]、絲狀細菌[10]等病原體。此外，污染和死亡的受精卵會影響到周圍健康的受精卵，有時甚至導致100%的死亡率[11]。所以為提高受精卵的離體孵化率，不少研究者使用藥物或者清理死卵的方式來處理。Carral等[12]在白螯蝦(Austropotamobius pallipes)的離體培養中通過定期的清理死卵，可以有效地降低受精卵的死亡率。廖永巖等[13]則通過使用藥物來提高孵化率，使用0.2 mg/dm3的孔雀石綠處理遠海梭子蟹(P. pelagicus)離體卵效果顯著。鮑鷹等[14]在中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)胚胎離體孵化中發現，福爾馬林與孔雀石綠聯用比其單獨使用的效果明顯。雖然使用藥物處理離體胚胎取得了一定效果，但規?；a中將增加生產成本，且孔雀石綠等藥物已被禁用。本研究采用酶液使受精卵分離的方法，極大地避免了連接性污染，進而提高孵化率，通過酶的分解作用消化了受精卵之間黏連的蛋白，減少了受精卵黏連帶來的污染。結果顯示，在時間為30 min，濃度為0.09 mg/mL時，受精卵塊的分離率最高，可達100%，一定程度上減少了病原微生物造成的危害，還避免了藥物使用帶來的環境污染，為蝦蟹人工育苗技術創新提供新的參考。

3.2 分離液作用后卵膜的變化

在許多動物中，成熟卵子外有一層或多層被膜，它們對受精和胚胎發育具有十分重要的作用。在中華絨螯蟹[15]、普通濱蟹(Carcinus meanus)[16]、銳脊單肢蝦(Sicynia ingensis)[17]、日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)[18]，鋸緣青蟹(Scylla serrata)中均觀察到有兩層卵黃膜組成的結構。孵化膜為胚胎提供了良好的發育環境，一方面保護胚胎免受外界物質侵擾，另一方面又是胚胎與外界進行物質交換的篩選膜。本研究中，分離液處理過的受精卵孵化率增加，進行透射電鏡觀察后發現，酶液處理過的受精卵膜與對照組相比結構疏松，且厚度減少了將近一半，與日本絨螯蟹(E.japonica)[19]的報道一致，去除體外人工受精卵外膜后孵化率從10%上升到90%以上，認為卵膜的厚度能夠影響受精卵的孵化率，隨后Lee[20]利用水的張力將卵膜的厚度減少至原來的三分之一，正常孵化率從10.69%提高到66.67%。在本研究中，通過分離液的酶分解作用使得外卵膜的厚度變薄，外卵膜的變薄不僅可以提高氧的交換率，而且可以提高代謝物質的排出率，進而提高受精卵的孵化率。

3.3 不同時期受精卵離體孵化情況

本研究中，三疣梭子蟹未分散的卵塊在原腸期和原腸期之前的胚胎離體培養時期的孵化率普遍低于50%。原腸期之后的胚胎孵化率提高到50%以上，分離處理的受精卵孵化率可提高至75%以上?？梢娫c期是離體培養的一個關鍵時期。在鋸緣青蟹[21]中也存在相似的現象，青蟹在原腸期和原腸期之前的胚胎離體培養時的孵化率普遍較低而且相近，都未超過40%。原腸期之后的胚胎孵化率大大提高，達到80%以上。并且不同步發育的胚胎一般也停滯在原腸期，而且流產卵離體培養的胚胎死亡通常大量出現在原腸期[22]。推測原腸期是整個胚胎發育過程中的關鍵時期，其間眾多細胞有規律地遷移、排列和分化而形成胚層，各胚層細胞開始分化形成各種組織和器官。此外，原腸期胚胎內基因組也由最初的母型調控進入胚胎自身合子型調控[23]。所以，原腸期之前，胚胎比較脆弱，發育處于相對不穩定時期。一旦過了原腸期，胚胎就比較容易脫離母體而獨立生存。本研究結果充分證實了這一點，并且經過分離液處理后的受精卵，由于減少了受精卵膜的厚度和黏連帶來的污染，孵化率在原腸期之前就突破了50%。由此可見，盡管原腸期的受精卵容易大量死亡，但是將受精卵塊分離之后就可以有效地避免離體孵化在原腸期的大量死亡，提高孵化率。

3.4 離體孵化對幼體活力的影響

離體培養可以解決許多生產問題，例如孵化率低、孵化不同步、抱卵蟹死亡連帶造成受精卵的浪費[24]等。離體孵化還可以更精確地控制環境條件，可以減少由于母體的侵略性接觸、疾病或死亡而造成的損失[25]，此外，離體孵化節省空間和成本，可以提高生產效益。但是可能會產生一個問題，離體條件下孵化的幼體與母體孵化的幼體質量有無差異。脅迫實驗發現，經過分離液處理后，離體孵化的幼體與母體孵化的幼體沒有顯著差異。陸家平等[26]認為蝦苗包埋于擰干的濕毛巾中5 min，取出放回原育苗池水中，成活率無影響的即為優質蝦苗。在本研究中，剛孵化的幼體在干露5 min時死亡率在10%以下，隨著干露時間的增加，死亡率逐漸上升，以15 min為節點，死亡率達50%以上，這與斑節對蝦的實驗結果基本一致[27]。Quinitio等[28]把福爾馬林的耐受性作為一種評判擬穴青蟹(S. serrata)幼體活力的指標，在40 mg/L的福爾馬林中脅迫暴露3 h，如果Z1在3 h內的死亡率僅在0%～8%，則該批幼體質量較好，如果死亡率為＞38%，則其質量較差，育苗可在Z1時期終止。本研究中，離體孵化與親體抱卵孵化幼體的福爾馬林耐受性無顯著差異，初步說明離體孵化不影響幼體質量。

另外，對于水產動物的生存(生活)狀態，能夠從行為學和生理學兩個方面進行評估、監測和衡量，相比利用生理學的方法，使用行為學方法的實用性和可操作性更強，并且行為學的方法作為一種非侵入性的技術手段，幾乎不會對水產動物造成傷害，同時更為直觀，能在較短的時間內作出定性和定量的判斷[29]。在動物的各種行為活動中，運動作為水產動物最基本的行為，是其他行為發生的基礎[30]。所以為進一步比較離體和親體抱卵條件下幼體活力的差異，本研究選取響應時間、運動速度和運動距離3個參數對離體孵化幼體的行為進行了分析，結果顯示離體和親體抱卵條件下孵化的幼體運動能力差異不顯著，再次證明離體培養是可行的。

綜上，本研究確定了三疣梭子蟹受精卵塊合適的分離液配方及處理方法，即0.09 g/mL的木瓜蛋白酶，分離時間30 min，明確了三疣梭子蟹各階段胚胎均能夠離體孵化出幼體，并且其與親體孵化方式所孵出幼體活力無顯著差異，表明本研究所采用的胚胎離體孵化方法對幼體質量無負面影響。因此，該受精卵酶法分離與離體培養技術可進一步開發完善，作為三疣梭子蟹受精卵培養和幼體孵化的全新技術方法，為三疣梭子蟹及其他甲殼動物受精卵的離體孵化提供參考。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）