香蕉枯萎病菌候選效應蛋白FoSSP20 的鑒定和功能初探

王 田，符俐盈，趙 陽，劉 爽，張玉芳，陳代朋，鄭 麗

（海南大學 植物保護學院/熱帶農林生物災害綠色防控教育部重點實驗室，?？?570228）

香蕉（Musaspp.）在亞非拉等不發達地區不僅是主要食物來源，而且是重要的經濟支柱[1]。據聯合國糧農組織統計，我國香蕉產量占全球總產量的10%左右，僅次于印度[2]。由香蕉枯萎病菌（Fusariumoxysporumf. sp.cubense,Foc）引起的香蕉枯萎病是一種嚴重危害香蕉生產的土傳病害。根據Foc菌株對宿主的毒力差異，Foc可分為4 個生理小種，Focrace1、Focrace2、Focrace3 和Focrace4（Foc1,Foc2,Foc3andFoc4），其中Foc4可細分為FocTR4（tropical race 4）和FocSTR4（subtropical race 4）[3]。Foc1能侵染大多數三倍體香蕉（Musaspp., AAA 和Musaspp., AAB），如栽培品種“Gros Michel”等[4]。20 世紀50 年代，由Foc1引起的香蕉枯萎病大面積爆發，使“Cros Michel”香蕉（Musaspp., AAA）大量死亡，種植園絕收，對當時的香蕉產業造成了毀滅性的打擊[5]?！癈avendish”香蕉開始替代“Cros Michel”香蕉，貢獻了50%全球產量和99%的出口市場，而毒性更強的FocTR4 能侵染“Cavendish”香蕉和大多數重要的栽培品種，并在世界各地廣泛傳播，對現在的香蕉產業造成嚴重破壞[6]。

在植物與病原菌長期的協同進化過程中，植物建立起了能有效抵御病原微生物的先天免疫系統（innate immune system），當植物遭受病原菌侵染時，免疫系統能特異識別信號分子從而激活植物自身免疫應答[7]。先天免疫系統包括2 個不同的層面。第1 層免疫系統是由位于植物細胞表面的模式識別受體（pattern recognition receptors, PRRs）識別并結合病原微生物的病原或微生物相關分子模式（pathogen or microbial-associated molecular patterns, PAMPs or MAMPs）誘導的免疫反應，稱為PTI（PAMP-triggered immunity）[8 - 9]。第二層免疫系統中，一些病原微生物分泌的效應蛋白直接或間接被植物中的抗?。╮esistance, R）蛋白識別，如核苷酸結合富亮氨酸重復序列（nucleotidebinding leucine-rich repeat, NLR）蛋白，隨后誘導的免疫反應，稱為ETI（effector-triggered immunity）[10]。在免疫反應中，ETI 相比PTI 免疫反應更劇烈，通常會導致植物局部細胞死亡，稱為過敏性壞死反應（hypersensitive response, HR）[11]。病原微生物為了更好地侵染寄主植物會分泌效應蛋白干擾PTI[12]。研究結果表明，香蕉中過表達細胞凋亡基因或PCD 相關基因可以提高香蕉對Foc的抗病性，說明香蕉細胞HR 反應也是香蕉抗枯萎病的重要抗病機制[13 - 14]。

效應蛋白被證明在Foc的侵染過程中發揮作用。Foc的全基因組測序已經完成，利用基因組測序技術和生物信息學分析在FocTR4 中預測了大量的候選效應蛋白[15-16]。然而，許多候選效應蛋白的毒力功能并不清楚。因此，Foc中的候選效應蛋白的鑒定和毒力分析對于研究Foc的致病機制和其與宿主間相互作用至關重要。

煙草瞬時表達系統被廣泛應用于鑒定各種病原菌候選效應蛋白的功能[17]。BAX 蛋白是Bcl-2 蛋白家族中的一種能誘導細胞壞死的蛋白，將其構建在煙草花葉病毒載體（tobacco mosaic virus vector）中在本氏煙（Nicotiana benthamiana）中瞬時表達時，可以作為陽性對照誘導本氏煙葉片的細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）[18-19]。蘋果炭疽菌（Colletotrichum fructicola）中的候選效應蛋白CfEC92 被驗證可以抑制由BAX 誘導的PCD[20]。激發子INF1 是一種毒力因子，可以誘導本氏煙葉片的過敏性壞死（hypersensitive response,HR）反應[21]。另外，17 種葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）PvRXLR 候選效應蛋白可以完全抑制由BAX 和INF1 誘導的PCD，并且PvRXLR159 在本氏煙中的瞬時表達可以抑制本氏煙對葡萄霜霉菌的抗性[22-23]。本研究從課題組前期在Foc4基因組中篩選出的80 個候選效應蛋白（FoSSP1-FoSSP80）中選取FoSSP20 為研究對象，通過生物信息學分析其結構，并通過信號肽分泌實驗、亞細胞定位實驗、煙草瞬時表達實驗和qRT-PCR 初步分析其功能，以鑒定FoSSP20 的毒力功能，從而為研究FoSSP20 在Foc4與香蕉的相互作用中的分子機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和植物真菌菌株：尖孢鐮刀菌古巴?；? 號生理小種（Fusarium oxysporumf. sp.cubenserace 4,Foc4）；根瘤農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101；大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α；酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株YTK12。以上菌株由海南大學植物保護學院真菌病毒與植物免疫實驗室保存并提供，感受態購自Takara 生物公司.

本試驗接種香蕉品種為巴西蕉（MusaAAACavendishvar.Brazilian），購自海南熱作兩院種業科技有限公司。本氏煙（Nicotiana benthamiana）由海南大學植物保護學院真菌病毒與植物免疫實驗室保存。

1.2 試驗試劑DNA 聚合酶：TaKaRaTaqTM（Takara Biotech）； 2×TaqPCR Mix（TianGen Biotech）；Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（Thermo Fisher Scientific）； Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme Biotech）； 2 ×KeyPo Master Mix（Vazyme Biotech）；2 × Phanta Max Master Mix（Vazyme Biotech）。限制性內切酶：Restriction Endonucleases（New England Biolabs,NEB）。試劑盒：Cycle Pure Kit 純化試劑盒與 Gel Extraction Kit 純化試劑盒（Omega Biotech）；Hi-DNAsecure Plant Kit 高效植物基因組DNA 提取試劑盒（TianGen Biotech）；Eastep R Super Total RNA Extraction Kit 總RNA 提取試劑盒（Promega Biotech）； RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit 反轉錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；SuperReal PreMix Plus 熒光定量試劑盒（TianGen Biotech）； ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit（Vazyme Biotech）；經典酵母轉化試劑盒（Coolaber Biotech）；12.5% SDS-PAGE 變性丙烯酰胺彩色凝膠快速制備試劑盒（Sangon Biotech）。PDA/PDB、LB/LBA、YPDA、CMD-W 以及YPRAA培養基均參考常規方法配制。

1.3 試驗引物本研究所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 本研究所用引物

1.4 菌株及植物培養WT-Foc4在PDA 或PDB培養基中28 ℃恒溫黑暗培養。DH5a 和GV3101分別于37 ℃和28 ℃的條件下在LB 培養基中恒溫黑暗培養。YTK12 在YPDA 培養基中30 ℃恒溫暗培養。本氏煙在培養箱中24 ℃晝夜（16 h/8 h）交替培養。選取5～6 片葉的巴西蕉苗在（28±2） ℃的溫室中晝夜交替培養。

1.5 生物信息學分析FoSSP20（FOIG_10940；Genomic Sequence: NW_022158703.1）的序列信息從NCBI 數據庫下載。將FoSSP20 的氨基酸序列通過BlastP 在線比對NCBI NR 和Ensemble Fungi數據庫獲得同源蛋白的序列。利用MEGA11軟件采用最大似然法構建系統發育樹[24]。利用Clustal W 軟件進行氨基酸序列比對，GeneDoc 軟件對結果進行分析[25]。利用在線軟件SignalP 5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?Sig nalP-5.0）和TMHMM 2.0 （https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）對FoSSP20 的氨基酸序列進行分析[26 - 27]。

1.6 酵母表達載體構建pSUC2、pSUC2-Avr1b和pSUC2-Mg87載體由筆者所在實驗室保存。將pSUC2 載體用EcoRI 和XhoI 限制性內切酶酶切，用Cycle Pure Kit 純化試劑盒純化回收。用FoSSP20SP-F/FoSSP20SP-R 引物KeyPo Master Mix聚合酶擴增FoSSP20 的信號肽全長，Gel Extraction Kit 純化試劑盒純化回收。用ClonExpress ⅡOne Step Cloning Kit 將純化后的SP 片段克隆到pSUC2 載體中得到pSUC2-FoSSP20SP酵母分泌載體。操作方法和反應體系均參考產品使用說明書。所有載體均通過PCR 檢測和上海生工測序驗證其準確性。

1.7 植物表達載體構建用Eastep R Super total RNA Extraction Kit 總RNA 提取試劑盒（Promega Biotech）提取Foc4的總RNA。用RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit 反轉錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific）將總RNA 反轉錄為cDNA。將pGR107-GFP載體用ClaⅠ限制性內切酶酶切，用Cycle Pure Kit 純化試劑盒純化回收。以Foc4的cDNA 為模板，用pGR107-GFP-FoSSP20-F、 pGR107-GFP-FoSSP20ΔSP-F 分別與 pGR107-GFP-FoSSP20-R 引物擴增FoSSP20 全長、FoSSP-20ΔSP片段。用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit 將純化后的片段分別克隆到pGR107-GFP載體中得到pGR107-FoSSP20-GFP、 pGR107-Fo-SSP20ΔSP-GFP植物表達載體。將pBin-eGFP載體用KpnⅠ限制性內切酶酶切，用Cycle Pure Kit 純化試劑盒純化回收。用pBin-FoSSP20-F、pBin-FoSSP20ΔSP-F 分別與pBin-FoSSP20-R 引物擴增FoSSP20 全長、FoSSP20ΔSP片段。用ClonExpress ⅡOne Step Cloning Kit 將純化后的片段分別克隆到pBin-eGFP載體中得到 pBin-FoSSP20-eGFP、pBin-FoSSP20ΔSP-eGFP植物表達載體。pGR107-GFP、pBin-eGFP載體由筆者所在實驗室保存并提供。用Phanta Max Super- Fidelity DNA 聚合酶擴增目的基因。操作方法和反應體系均參考產品使用說明書。所有載體均通過PCR 檢測和上海生工測序驗證其準確性。

1.8 酵母分泌實驗用酵母分泌系統對FoSSP-20 的信號肽功能進行驗證[28]。將YTK12 菌株接種在YPDA 平板上劃線培養，挑取單菌落接種到YPDA 液體培養基中30 ℃培養過夜。取適當菌液接種于新的YPDA 液體培養基中培養至OD600=0.4～0.5。將菌液3 000 r·min-1離心5 min 去除上清，并用滅菌的ddH2O 重新懸浮后用3 000 r·min-1離心5 min 去上清。將菌體用1.5 mL 1 mol·L-1LiAc 重新懸浮后用3 000 r·min-1離心5 min 去上清，最后用1 mL 1 mol·L -1 LiAc 懸浮得到YTK12 感受態。將pSUC2、pSUC2-Avr1b、pSUC2-Mg87和pSUC2-FoSSP20SP載體用經典酵母轉化試劑盒進行轉化得到含有相應載體的酵母菌株，操作步驟參考使用說明書。將含有不同載體的酵母菌株分別接種在CMD-W 和YPRAA 培養基的平板上，以驗證YTK12 是否含有轉化酶的活性。轉化酶可將TTC（2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride）還原為TPF（1,3,5-Triphenylformazan）形成不可溶性紅色沉淀，可以進一步驗證信號肽的功能。含有pSUC2-Avr1b、pSUC2-Mg87和pSUC2的YTK12分別作為陽性對照、陰性對照和空白對照，實驗設3 個生物學重復和3 個機械重復。

1.9 農桿菌介導的煙草的瞬時表達將構建好的植物表達載體通過電擊法轉入農桿菌GV3101 的感受態中。在含有50 μg·mg-1卡那霉素（kanamycin）和25 μg·mg-1利福平（rifampicnic）的LB 培養基中28 ℃振蕩培養。反復離心（5000 r·min-1,5 min）懸浮菌液，待培養基洗凈后用接種緩沖液重新懸浮，并將OD600調至0.6，室溫靜止2 h 后用注射器將菌液接種在4～6 周的本氏煙葉片背部。實驗設3 個生物學重復和3 個機械重復，pGR107-BAX和pGR107-GFP分別作為陽性對照和陰性對照，注射后5 d 用UV 燈觀察并拍照記錄。注射緩沖液配方：10 mmol·L-1MgCl2、5 mmol·L-1MES（pH 5.6）和150 μmol·L-1AS（acetosyringone）。

1.10 共聚焦顯微鏡觀察利用共聚焦顯微鏡對FoSSP20 的亞細胞定位進行測定，在5 周大的本氏煙中分別注射含有pBin-eGFP、pBin-FoSSP20-eGFP、pBin-FoSSP20ΔSP-eGFP的農桿菌，OD600=0.01。在注射后36 h 利用激光共聚焦顯微鏡（Olympus microscope TH4-200, Tokyo, Japan）觀察融合蛋白的綠色熒光并拍照記錄，激發波長為488 nm，接受波長為505～530 nm。

1.11 FoSSP20 的亞細胞定位(western blot)收集本氏煙葉片樣品，液氮速凍，用研磨儀研磨后加入植物總蛋白裂解緩沖液（Sangon Biotech），按說明書操作提取本氏煙葉片的總蛋白。將與蛋白loading buffer 混合的蛋白樣品煮沸5 min 后加入用12.5% SDS-PAGE 變性丙烯酰胺彩色凝膠快速制備試劑盒制備12.5% SDS-PAGE 蛋白膠中，電泳完成后用轉膜儀轉移到0.22 μm 的PVDF 膜中。用一抗Rabbit anti-GFP pAb 和二抗HRP Goat anti-rabbit IgG （Abclonal, Biotech）對蛋白進行雜交，用ECL 檢測試劑盒（KeyGEN Biotech）進行檢測。操作步驟參考使用說明書。

1.12 FoSSP20 的表達模式用PDB 培養基振蕩培養Foc45 d，過濾菌絲得到孢子懸浮液，將孢子懸浮液調到1 × 107個·mL-1。選取長勢良好根系發達的水培香蕉，對根系進行傷根處理后浸泡于Foc4的孢子懸浮液中2 h，清洗根部后重新移栽到花盆中，在溫室中進行培養。收集Foc4接種后12、24、48 和72 h 的香蕉苗根部和Foc4 的菌絲和分生孢子，用Eastep R Super total RNA Extraction Kit 總RNA 提取試劑盒（Promega Biotech）提取所有樣品的總RNA。用RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit 反轉錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific）將總RNA 反轉錄為cDNA。香蕉的Actin 基因作為內參，使用QuantStudioTM5 Real-Time PCR 儀器（Thermo Fisher Scientific）和Super-Real PreMix Plus 熒光定量試劑盒（TianGen Biotech）進行qRT-PCR 檢測，利用QuantStudioTMDesign&Analysis Software v1.5.2 軟件對基因表達量進行分析。操作方法參考使用說明書。

2 結果與分析

2.1 FoSSP20 蛋白結構分析FoSSP20（FOIG_10940）基因全長1 086 bp，編碼1 個含82 個氨基酸的假定蛋白，序列登錄號：NW_022158705.1。生物信息學軟件預測FoSSP20 的N 端含有1 個19 個氨基酸的信號肽（Signal peptide, SP），無跨膜結構域。將FoSSP20 的氨基酸序列通過BlastP對NCBI 和Ensemble Fungi 數據庫進行比對。分析結果發現FoSSP20 在其他鐮刀菌屬（Fusarium）的真菌中比對出大量同源蛋白（圖1-a），這些蛋白的氨基酸序列具有高度相似性（圖1-b）。

圖1 FoSSP20 及其同源物的系統發育樹和氨基酸比對

2.2 FoSSP20 信號肽功能驗證生物信息學分析表明，FoSSP20 可能是N 端具有SP 的經典分泌蛋白。為了驗證其SP 具有分泌活性，我們利用酵母分泌系統來驗證FoSSP20 的SP 功能。FoSSP20的SP 全長含有19 個氨基酸，我們將SP 的全長克隆到pSUC2 載體中，得到信號肽分泌載體pSUC2-FoSSP20SP，并將pSUC2-FoSSP20SP轉入釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YTK12 中，Mg87 作為陰性對照為含有稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）Mg87 蛋白的SP 的pSUC2 載體的YTK12；Avr1b作為陽性對照為含有大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）Avr1b 蛋白的SP 的pSUC2 載體的YTK12。實驗結果表明，FoSSP20 的SP 可以使YTK12 分泌轉化酶使得酵母菌株在YPRAA 平板上生長，并可以將TTC（2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride）還原為TPF（1,3,5-Triphenylformazan）形成不可溶解的紅色沉淀（圖2）。綜上所述，FoSSP20 是一種經典分泌蛋白，其SP 具有分泌功能。

圖2 通過酵母分泌系統驗證FoSSP20 的分泌功能

2.3 FoSSP20 的亞細胞定位為了驗證FoSSP20在植物細胞內的定位，對FoSSP20 進行亞細胞定位實驗。將FoSSP20 和FoSSP20ΔSP克隆到pBineGFP 植物表達載體中，成功構建pBin-FoSSP20-eGFP 和pBin-FoSSP20ΔSP-eGFP 綠色熒光表達載體并將其轉入農桿菌中，并將攜帶載體的農桿菌注射到煙草葉片中（GFP 作為對照）。注射2 d 后，用激光共聚焦顯微鏡觀察eGFP 融合蛋白的定位情況，結果表明FoSSP20:eGFP 和 FoSSP20ΔSP:eGFP 均定位于煙草細胞的細胞核和質膜上（圖3-a）。為了驗證煙草葉片中蛋白的表達情況，提取了葉片的總蛋白，利用Western blot 免疫雜交檢測到FoSSP20: eGFP 、 FoSSP20ΔSP: eGFP 蛋白的表達（圖3-b）。

圖3 FoSSP20 和FoSSP20ΔSP 的亞細胞定位

2.4 FoSSP20 抑制BAX 在本氏煙草葉片上誘導的細胞壞死利用煙草瞬時表達系統對FoSSP20 的功能進行驗證，由于FoSSP20 為經典分泌蛋白，其SP 具有分泌活性，進一步驗證SP 的缺失是否會影響FoSSP20 的細胞死亡抑制活性。擴增FoSSP20 的全長和缺失SP 的FoSSP20 （FoSSP20ΔSP），將2 個片段分別克隆到pGR107-GFP載體中，并成功轉入根瘤農桿菌中。利用煙草瞬時表達系統，分別在本氏煙中瞬時表達FoSSP20 和FoSSP20ΔSP的GFP 融合蛋白（OD600= 0.6），并在24 h 后在相同位置注射含有pGR107-BAX的農桿菌。注射5 d 后，BAX、BAX 與GFP共注射部位開始出現細胞壞死，而FoSSP20、FoSSP20ΔSP與BAX 共注射部位沒有出現細胞壞死，當用UV 燈照射葉片時，壞死部位產生黑色病斑，而未壞死部位出現綠色熒光（圖4-a）。為了驗證煙草葉片中蛋白的表達情況，提取了葉片的總蛋白，利用Western blot 免疫雜交對GFP 融合蛋白進行檢測，雜交結果表明共注射不影響蛋白的表達（圖4-b）。實驗結果表明， FoSSP20 和FoSSP20ΔSP都可以完全抑制BAX 誘導的PCD。

圖4 FoSSP20 和FoSSP 在煙草中瞬時表達

2.5 FoSSP20基因表達模式為了確定FoSSP-20基因在Foc4侵染時的表達變化，通過qRTPCR 檢測FoSSP20的表達模式。以Foc4的分生孢子（conidia, CON）作為侵染后0 h 的樣本，以FoSSP20在Foc4 的分生孢子時期的表達量作為對照。與CON 樣品相比，Foc4 的菌絲（hyphae,HYP）樣品中FoSSP20 基因表達無顯著差異，而FoSSP20基因在侵染后12 h 表達量開始出現顯著差異，在侵染后24 h 達到峰值（25.8 倍）（圖5）。隨后FoSSP20 的表達量開始逐漸降低。qRT-PCR 結果表明，候選效應蛋白FoSSP20 可能在病原菌的侵染階段發揮作用。

圖5 不同侵染時間的香蕉根部候選效應蛋白FoSSP20 的基因表達量

3 討 論

目前對鐮刀菌（Fusarium oxysporum,Fo）效應蛋白研究較少，研究主要集中在一類會分泌進入寄主植物的木質部中發揮作用幫助病原菌侵染的效應蛋白中，這一類效應蛋白稱之為SIX（secretedin-xylem）蛋白。 在番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp.lycopersici,Fol）中共鑒定出14 個SIX 蛋白（SIX1～SIX14）。在所有SIX 蛋白中，SIX1 是番茄（Lycopersicon esculentum）中I-3 介導的抗性所必需的，因此也被稱為Avr3，并且FocTR4 中SIX1同源基因的缺失會導致FocTR4 對香蕉致病力降低[29-30]。SIX3 蛋白也作為一種無毒基因（Avr2）能被植物的I-2 介導的抗性識別[31]。FocSge1基因可以調控Foc4中效應蛋白基因的表達，而SIX8 被證明對Foc TR4 的毒力有貢獻[32]。除了已被研究的SIX 蛋白外，Foc4中還有很多其他類型的效應蛋白仍功能未知未被報道。FocM35_1 是一種金屬蛋白酶類效應蛋白有助于FocTR4 毒性在病原菌侵染早期表達量上調[16]。FoSSP1 是本課題組前期研究的一個候選效應蛋白，能激發植物免疫并負調控Foc4的侵染[33]。分泌蛋白根據其分泌途徑的不同可以分為經典分泌蛋白和非經典分泌蛋白。其中，經典分泌蛋白依靠N 端的信號肽引導蛋白合成分泌[34]，而非經典分泌蛋白通過胞吞胞吐或其他方式分泌到細胞外，是病原菌對分泌途徑進行有益的補充和替代[35]。在本研究中，鑒定了一種非SIX 蛋白的新蛋白FoSSP20，該蛋白的信號肽具有分泌功能，但信號肽的有無不影響該蛋白抑制BAX 誘導本氏煙的PCD。通過亞細胞定位實驗，發現FoSSP20定位于植物細胞的細胞核和細胞膜中，并且該蛋白在Foc4侵染過程中表達量顯著上調。這些結果都表明FoSSP20 可能作為Foc4的一個新的毒力因子在侵染過程中發揮作用。

通過對數據庫中的序列進行比對，篩選FoSSP20 的同源蛋白并構建系統發育樹。分析結果表明FoSSP20 在整個鐮刀菌屬中保守，并且不同物種之間FoSSP20 的同源物的序列存在差異。因此，猜測FoSSP20 蛋白及其同源物可能與Fo的進化相關。在后續的研究中，將會克隆不同種的FoSSP20 蛋白的同源蛋白，構建煙草瞬時表達載體，將FoSSP20 的同源蛋白在煙草中進行瞬時表達，驗證其功能與FoSSP20 的異同。在亞細胞定位實驗中，發現SP 的缺失對FoSSP20 的定位沒有影響，可能是由于真菌的SP 不能在植物中發揮作用，后續會進一步構建含植物信號肽的FoSSP-20 表達載體對該蛋白的定位。此外，全長的FoSSP20 熒光強度明顯弱于FoSSP20ΔSP，也可能是由于FoSSP20 的SP 發揮了功能，導致FoSSP20被分泌至植物細胞外使得熒光強度降低。在未來的研究中，將會對FoSSP20基因進行敲除回補實驗，驗證FoSSP20 蛋白是否是Foc4毒力所必需的，并且驗證其對Foc4生長發育的影響。FoSSP-20 可以抑制本氏煙中由BAX 誘導的PCD，說明該蛋白可能會通過調控植物免疫來幫助Foc4侵染香蕉；驗證FoSSP20 是否能抑制本氏煙中活性氧和胼胝質的積累，及其對植物信號通路相關基因的影響，從而明確該蛋白在Foc4調控寄主免疫反應中的作用。