脂肪間充質干細胞外泌體對腦創傷記憶障礙作用及機制研究

郭玲玲, 韓 曉, 陳哲遠, 程 鳳, 王卓君, 田孝野, 金紅旭

北部戰區總醫院 急診醫學科,遼寧 沈陽 110016

腦創傷是由突然的外力作用導致的急性神經損傷性疾病,其病死率和致殘率位居創傷首位[1]。盡管臨床診療水平在不斷提高,但部分腦創傷患者常表現出神經功能障礙,導致患者勞動能力喪失,生活質量下降,嚴重危害患者的身心健康。有研究報道,腦創傷導致的死亡患者占所有外傷致死性患者的30%～40%,且是導致認知功能障礙最重要的原因之一。但臨床上仍缺少創傷后記憶障礙便捷有效的治療方法[2-3]。外泌體是由細胞分泌的直徑為30～100 nm的微粒,具有磷脂包膜且富含蛋白質、磷脂、mRNAs和miRNAs等生物活性分子[4-6]。有研究報道,脂肪間充質干細胞來源的外泌體可用于腦創傷,其優勢在于取材方便、體積微小、低免疫原性,具有跨血腦屏障和有效轉運生物分子及與靶細胞相互作用的能力[7-9]。外泌體可以經過尾靜脈輸送至大腦,對腦創傷后的病理生理過程發揮調控作用[10-11]。但脂肪間充質干細胞來源的外泌體通過改善神經營養因子水平減輕腦創傷認知障礙的機制仍未明確。本研究旨在探討脂肪間充質干細胞外泌體對腦創傷記憶障礙的作用及機制?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 脂肪間充質干細胞外泌體提取及鑒定 脂肪間充質干細胞購自賽業生物科技有限公司,待細胞密度約80%時,采用無外泌體培養基繼續培養48 h后收集細胞上清。通過差速離心法分離外泌體,透射電鏡觀察、NTA檢測和蛋白免疫印跡法檢測CD63、TSG101表達進行外泌體鑒定。

1.2 實驗動物 選取24只雄性健康SD大鼠,體質量180～220 g,購自遼寧長生生物科技有限公司。大鼠均飼養于SPF級實驗室,溫度維持(22±3)℃,濕度維持45%～65%,自由飲食飲水。適應性飼養7 d后,將大鼠隨機分為對照組、腦創傷組、外泌體組,每組各8只。對照組大鼠不作處理,腦創傷組、外泌體大鼠采用落體撞擊法建立腦創傷模型。對照組和腦創傷組分別靜脈給予等體積生理鹽水,外泌體組靜脈給予脂肪間充質干細胞外泌體300 μg。

1.3 水迷宮實驗 7 d后采用水迷宮實驗評價大鼠記憶能力。實驗開始后第1～5天,將各組大鼠頭朝向水池壁的方向放入水中,通過分析跟蹤系統記錄大鼠找到平臺的時間。在訓練過程中,若在1 min后大鼠仍未尋找到站臺,則人為引導大鼠到平臺停留10 s;記錄不同訓練時間逃避潛伏期。實驗開始后第6天,開始隱蔽站臺測試,記錄穿越平臺次數和目標象限時間。

1.4 濕干重檢測 通過10%水合氯醛麻醉大鼠,快速取得腦組織,使用濾紙擦去表面水分,置于已烤干并稱重(重量為W)的載玻片上稱重并記錄(W1),然后置于60℃烘箱內烘烤24 h,間隔15 min重復稱重以取得恒重并記錄(W2)。

組織含水量=(W1-W)/(W2-W)×100%

1.5 酶聯免疫吸附法 采用酶聯免疫吸附法檢測大鼠腦組織神經生長因子(nerve growth factor,NGF)、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factors,BDNF)表達。將組織標本進行蛋白提取后,從已平衡至室溫的密封袋中取出板條和試劑。標準品孔和加樣孔均按照說明書操作。按順序加入工作液并孵育,顯色并終止后450 nm下測量吸光度。

1.6 蛋白免疫印跡法 采用蛋白免疫印跡法檢測Tau、S100β、TrkA、TrkB蛋白表達情況。進行組織蛋白的提取和總蛋白測定后,將蛋白樣品經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉移至PVDF膜上,室溫封閉1 h,分別用一抗4℃孵育過夜。TBST漂洗3次,加入對應二抗室溫孵育1 h。TBST漂洗3次,采用ECL Western印跡試劑盒進行化學發光檢測。

2 結果

2.1 脂肪間充質干細胞外泌體提取結果 NTA檢測結果顯示,外泌體基本處于30～200 nm的分布范圍(圖1a);透射電子顯微鏡結果顯示,能夠觀察到nm級膜泡形態外泌體的典型結構(圖1b);蛋白免疫印跡法結果顯示,在脂肪間充質干細胞上清液中提取的外泌體存在特異性蛋白-膜蛋白CD63和膜結合蛋白TSG101表達(圖1c)。本研究采用差速離心法成功提取脂肪間充質干細胞外泌體。

2.2 脂肪間充質干細胞外泌體改善腦損傷程度 腦創傷組大鼠濕干比、Tau和S100β蛋白表達水平高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05);外泌體組大鼠濕干比、Tau和S100β蛋白表達水平低于腦創傷組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 脂肪間充質干細胞外泌體改善腦損傷程度(a.濕干重檢測結果;b.腦損傷相關蛋白檢測代表圖;c.腦損傷相關蛋白相對灰度值)

2.3 脂肪間充質干細胞外泌體改善腦創傷后遠期認知功能損傷 與對照組比較,腦創傷組大鼠第2～5天逃避潛伏期明顯延長,穿越平臺次數明顯減少,目標象限時間明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。與腦創傷組比較,外泌體組大鼠第2～5天逃避潛伏期縮短,穿越平臺次數增加,目標象限時間延長,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠水迷宮檢測結果

2.4 脂肪間充質干細胞外泌體增加腦內神經營養因子水平 與對照組比較,腦創組大鼠腦組織NGF、BDNF表達下降,差異均有統計學意義(P<0.05);與腦創傷組比較,外泌體組大鼠腦組織NGF、BDNF表達水平升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腦內神經營養因子水平比較

2.5 脂肪間充質干細胞外泌體調節TrkA/TrkB受體蛋白表達 與對照組比較,腦創傷組大鼠腦組織TrkA和TrkB蛋白表達下降,差異均有統計學意義(P<0.05);與腦創傷組比較,外泌體組大鼠腦組織TrkA和TrkB蛋白表達提高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 脂肪間充質干細胞外泌體調節通路蛋白表達

3 討論

腦創傷會導致腦細胞及腦組織變形、丟失,導致殘疾,其臨床表現個體差異性較大,一方面因為大腦結構與功能比較復雜,另一方面因為致傷原因、致傷程度和致傷病理機制復雜多變[12]。盡管腦創傷的治療取得了明顯進步,但腦創傷后記憶障礙仍經常發生,治療手段需進一步探索。本研究發現,早期靜脈注射脂肪間充質干細胞外泌體能夠有效減輕腦創傷大鼠記憶損傷,其作用與降低腦水腫和損傷相關蛋白表達水平有關;此外,機制研究發現,脂肪間充質干細胞外泌體能夠促進神經營養因子和其受體蛋白的表達水平。

神經營養因子是腦內合成的一種蛋白質,廣泛分布于中樞神經系統,對神經元的存活、分化、生長發育起重要作用,且能防止神經元受損傷后死亡,改善神經元的病理狀態,促進受損傷神經元再生及分化等,在大腦學習認知能力、記憶功能中具有重要作用,是影響突觸可塑性的蛋白質[13-15]。神經營養因子家族包括NGF、BDNF等。有研究報道,缺乏NGF對學習、記憶、思維、感知覺等認知功能有顯著影響,血管性癡呆大鼠空間學習記憶能力下降可能與NGF和BDNF減少有關[16-17],與本研究結果一致。腦創傷大鼠發生記憶障礙、神經營養因子和相應受體表達降低,可能與腦水腫導致的細胞功能異常等腦組織損傷有關。NGF通過與效應神經元細胞上的TrkA受體結合,促進感覺和交感神經元的存活和分化,加速損傷神經元細胞修復[18]。BDNF與TrkB結合后,可同時激活細胞外與細胞內的激酶瀑布效應,其對神經元細胞的保護作用涉及抗細胞凋亡,拮抗自由基及興奮性氨基酸,穩定細胞內鈣離子水平,調節基因表達及信號傳遞等機制[19]。脂肪間充質干細胞外泌體中富含NGF、BDNF和血管內皮生長因子等多種細胞因子。此外,外泌體中miRNA等成分還能夠促進組織中NGF和BDNF的表達[20]。本研究發現,脂肪間充質干細胞外泌體可改善大鼠記憶障礙,其可能是通過外源性補充及促進內源性神經營養因子分泌而發揮作用。

綜上所述,早期靜脈給予脂肪間充質干細胞外泌體可調節腦創傷大鼠神經營養因子分泌及TrkA/TrkB受體,減輕大腦損傷,促進認知障礙恢復。