越橘原花青素的提取及其體外抗氧化活性研究

周春暉，龔麗妍，丘智聰，王偉廷，范 瑞

（廣東輕工職業技術學院食品與生物技術學院，廣東 廣州 510030）

越橘（Vɑccinium vitis-idɑeɑLinn.）原產于歐洲大陸北部和北美洲北部森林，在我國的吉林、內蒙古、新疆、黑龍江等地區也有分布。越橘中含有原花青素、花青素、有機酸及多酚類、黃酮醇類物質等多種營養成分[1-4]，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、改善肝功能和降血糖等功能[5-9]。原花青素作為越橘的主要功效成分，是一種具有獨特分子結構的生物類黃酮物質[10]，在抗氧化、降血脂、降血壓、抗糖尿病及促進和活化視網膜的視紅素再合成等功能上均具有顯著作用[11-15]。

原花青素的提取方法有溶劑提取法[16]、酶解提取法[17]、超臨界CO2提取法[18-19]、超聲波輔助提取法[20]、微波輔助提取法[21]等。酶解提取法可以更好地溶出生物活性物質，提高得率[22]。王海波等[23]使用雙酶（纖維素酶-果膠酶）提取葡萄皮渣中的原花青素，經過優化工藝條件后提取的原花青素含量達22.914 mg/g。超聲波輔助提取法可加速破壞植物細胞壁，迅速溶出細胞內容物，能大幅縮短提取時間，提高提取率。邢穎等[24]以板栗為原材料，采用超聲波輔助纖維素酶法提取原花青素，提取量為21.03 mg/g，高于單獨用酶解法的提取量（10.12 mg/g）。本文以越橘為原料，采用超聲波輔助雙酶酶解法提取越橘中原花青素，響應面優化試驗獲得原花青素的最佳提取條件，同時對提取物的體外抗氧化活性進行研究，以期為越橘功效成分的提取及后續功能性食品的開發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

越橘干果：由烏魯木齊新邊界貿易有限公司提供。

鹽酸、正丁醇、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、抗壞血酸、硫酸亞鐵、水楊酸、氫氧化鈉（粒）、無水乙醇、硫酸鐵銨（NH4Fe(SO4)2·12H2O）：均為分析純，廣州市海珠化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：合肥巴斯夫生物科技有限公司；原花青素標準品（UV＞98%）：安徽酷爾生物工程有限公司；纖維素酶（10 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；果膠酶（10 000 U/g）：寧夏和氏壁生物技術有限公司。

1.1.2 儀器與設備

pH-100 型筆式酸度計：上海力辰邦西儀器科技有限公司；101-3AB型電熱鼓風干燥箱、FW177型中草藥粉碎機、DK-98-IIA 型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；JY96-IIN 型超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；SC-3610型高容量低速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；UV-5200型紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 越橘的預處理及原花青素的提取

越橘預處理：將越橘干果置于60 ℃的電熱鼓風干燥箱中處理4 h，然后進行粉碎并過80 目篩，越橘粉置于干燥器中密封備用。

原花青素提?。悍Q量越橘粉1.00 g，加入一定比例的纖維素酶和果膠酶，加去離子水，調節pH，置于55 ℃恒溫水浴鍋中酶解，滅酶，加入體積分數60%乙醇溶液進行超聲波提?。üβ?20 W，提取2 s，間歇4 s，60 ℃），然后以5 000 r/min 離心20 min，取上清液，干燥，得到越橘原花青素粗提物。

1.2.2 越橘原花青素提取的單因素試驗設計

選擇料液比、酶解pH、酶解時間、纖維素酶與果膠酶的質量比（酶的總添加量保持質量分數0.2%不變）、超聲時間為影響因素，以越橘原花青素得率為考察指標設計單因素試驗，研究其對越橘原花青素提取得率的影響。各單因素的條件和范圍設置如下：酶解pH 5.0，酶解時間90 min，纖維素酶與果膠酶的質量比1∶1，超聲波時間30 min，液料比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）；酶解pH 5.0，料液比1∶25（g/mL），酶解時間90 min，超聲時間30 min，纖維素酶與果膠酶的質量比分別為1.0∶0.6、1.0∶0.8、1.0∶1.0、1.0∶1.2、1.0∶1.4；料液比1∶25（g/mL），酶解時間90 min，纖維素酶與果膠酶的質量比1∶1.2，超聲時間30 min，酶解pH 分別為3.0、4.0、5.0、6.0 和7.0；酶解pH 5.0，料液比1∶25（g/mL），纖維素酶與果膠酶的質量比1∶1.2，超聲時間30 min，酶解時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h；酶解pH 5，料液比1∶25（g/mL），酶解時間90 min，纖維素酶與果膠酶的質量比為1∶1.2，超聲時間分別為20、30、40、50、60 min。

1.2.3 越橘原花青素提取的響應面優化試驗設計

基于響應面中心組合試驗的設計原則和單因素試驗結果的方差分析，挑選出影響越橘原花青得率的顯著因素，分別為料液比、酶解pH值和超聲波提取時間，以這3 個顯著因素為響應面優化因素，以越橘原花青素得率為響應值，采用Design-Expert 10 軟件設計響應面試驗的因素和水平，具體見表1。

表1 越橘原花青素提取工藝響應面優化試驗因素水平設計Table 1 Response surface optimization experimental factor level design for bilberry proanthocyanidin extraction technique

1.2.4 越橘原花青素提取得率的測定

1.2.4.1 原花青素標準曲線的繪制

準確稱量原花青素標準品10.0 mg，用無水乙醇溶解并定容至10 mL，分別吸取0、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50 mL 該溶液于10 mL 容量瓶中，加入乙醇至刻度線，搖勻，分別移取1 mL 不同濃度溶液至10 mL容量瓶中，并加入6 mL 鹽酸-正丁醇（5∶95）溶液、0.2 mL硫酸鐵銨溶液，混合均勻，置于沸水中40 min，然后立即在冰水中冷卻至常溫，于546 nm處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標，原花青素質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程。

1.2.4.2 越橘原花青素的測定

取越橘原花青素提取液移至具塞容量瓶中，60%乙醇定容至刻度線，吸取1 mL 樣液于10 mL 具塞比色管中，精密加入鹽酸-正丁醇（5∶95）溶液6 mL，硫酸鐵銨溶液0.2 mL，混合均勻并密封，置沸水中加熱40 min 后取出，立即置冰水中冷卻至室溫，測定其吸光度，根據標準曲線計算原花青素質量濃度。越橘原花青素得率的計算公式如下：

式中：c為越橘原花青素的質量濃度，μg/mL；V為提取越橘原花青素的上清液體積，mL；n為提取液稀釋倍數；m為越橘粉的質量，g。

1.2.5 越橘原花青素提取液體外抗氧化活性的測定

1.2.5.1 羥基自由基（·OH）清除能力

參考宋昱等[25]和張鏡等[26]的方法，并加以改進。向5 支比色管中依次加入1 mL 質量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L 的越橘原花青素粗提物溶液，然后分別加入1.0 mL 9 mmol/L 的硫酸亞鐵、1.0 mL 9 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液、1.0 mL 8.8 mmol/L 的過氧化氫溶液，37 ℃恒溫水浴30 min，510 nm測定其吸光度，同時以同質量濃度的VC為對照?！H清除率的計算公式如下：

式中：A1為加入蒸餾水代替越橘原花青素粗提物溶液的空白對照液的吸光度；A2為加入越橘原花青素粗提物溶液的吸光度；A3為用蒸餾水代替顯色劑（過氧化氫）的吸光度。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力

參照王晗等[27]的方法并加以改進。稱取0.05 g的DPPH，用500 mL 無水乙醇溶解，定容于棕色容量瓶中，配成0.1 mmol/L 的DPPH 溶液，為防止紫外線照射，放置陰暗處備用。另取抗壞血酸，用無水乙醇進行溶解，配制成質量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L的溶液，分別取配制好的不同質量濃度的樣品溶液1 mL，置于10 mL 試管中，加入3 mL DPPH 溶液，30 ℃條件下避光反應30 min，于517 nm處測其吸光度，同樣方法測抗壞血酸梯度溶液的吸光度，同時以同質量濃度的VC為對照。DPPH自由基清除率的計算公式如下：

式中：As′為1.0 mL 樣品溶液+3.0 mL 無水乙醇的吸光度；As為1.0 mL 無水乙醇+3.0 mL DPPH 溶液的吸光度；A′為1.0 mL 樣品溶液+3.0 mL DPPH 溶液的吸光度。

1.2.5.3 超氧陰離子自由基（O-2·）清除能力

參照金寧等[28]的方法并加以改進。向20 mL 試管中添加9 mL pH 8.2 的Tris-HCl 緩沖液，于25 ℃下恒溫水浴20 min，向試管中加入40 mL鄰苯三酚溶液（45 mmol/L 鄰苯三酚，10 mmol/L HCl），25 ℃中預熱后立即混合并倒入1 cm的比色皿中，添加9 mL Tris-HCl緩沖液作為對照，在25 ℃下每隔30 s測定325 nm處的吸光度，自氧化速率控制在0.06/min，鄰苯三酚自氧化3 min后，迅速加入1滴VC，立即混合，室溫靜置5 min后，測定吸光度，即A0。在上述Tris-HCl緩沖液中，預先分別加入質量濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L的原花青素粗提物溶液1.0 mL，再按上述方法測定鄰苯三酚自氧化體系的吸光度As和空白試劑吸光度As′，同時以同質量濃度的VC 為對照。O-2·清除率的計算公式如下：

式中：A0為加入原花青素樣品后的鄰苯三酚自氧化速率吸光度；As為鄰苯三酚自氧化速率吸光度；As′為蒸餾水作為空白試劑的吸光度。

1.2.6 數據處理

響應面試驗數據使用Design-Expert 10 軟件處理，其他數據使用Excel 2019軟件處理。

2 結果與分析

2.1 原花青素標準曲線的繪制

以原花青素標準溶液的吸光度值為縱坐標，原花青素標準溶液的質量濃度為橫坐標，繪制準曲線，結果如圖1所示。原花青素標準曲線回歸方程為：y=0.002 5x+0.004 6，R2=0.998 9。

圖1 原花青素溶液的標準曲線Fig.1 Standard curve of proanthocyanidin solution

2.2 越橘原花青素提取單因素試驗結果

2.2.1 料液比對越橘原花青素得率的影響

如圖2 所示，隨著溶劑的增多，越橘原花青素得率呈先升高后降低的趨勢。當料液比為1∶25（g/mL）時，原花青素得率達到最高；當料液比為1∶30（g/mL）時，得率反而降低，可能是因為料液比為1∶25（g/mL）時，越橘粉中的原花青素已經全部溶出，繼續增加提取溶劑的用量，使超聲波破碎細胞的程度下降，提取的有效成分減少，得率也隨之降低。

圖2 料液比對越橘原花青素得率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on the yield of bilberry proanthocyanidins

2.2.2 纖維素酶與果膠酶的質量比對越橘原花青素得率的影響

如圖3所示，纖維素酶與果膠酶的質量比在1.0∶0.6～1.0∶1.2 范圍內得率呈緩慢上升趨勢，且變化較小。原因可能是，當酶的總用量不變時，隨著果膠酶占比的增加，酶對越橘粉細胞壁的降解作用增加，將更多的原花青素釋放到溶劑中[29]，從而使得原花青素得率逐漸提高。當纖維素酶與果膠酶的質量比為1.0∶1.2時，得率達到最大值；當纖維素酶與果膠酶的質量比為1.0∶1.4時，得率緩慢下降，可能是因為在纖維素酶與果膠酶的質量比為1.0∶1.2時，纖維素酶和果膠酶已使越橘粉中的原花青素最大限度地溶出，該條件下兩種酶發揮的作用最大，達到比較高的得率，若果膠酶占比再增大，兩種酶的復合作用會減弱，得率隨之下降。由此可得，纖維素酶與果膠酶的最佳質量比為1.0∶1.2。

圖3 纖維素酶與果膠酶的質量比對越橘原花青素得率的影響Fig.3 Effect of mass ratio of cellulase to pectinase on the yield of bilberry proanthocyanidins

2.2.3 酶解pH對越橘原花青素得率的影響

如圖4所示，酶解pH為3.0、4.0、5.0時，隨著酶解pH的升高，越橘原花青素得率大幅提高，當pH為5.0時，得率達到最大，可能是因為少量酸可以打開氫鍵和疏水鍵，以及蛋白質多糖和原花青素相互連接，以形成更多的游離多酚類物質和原花青素；酸可以抑制酚類物質與金屬離子之間的沉淀反應，從而提高原花青素得率。pH太低，原花青素的溶解度會降低，得率降低，可能是因為原花青素含有多個羥基，一般呈弱酸性，易溶于堿性溶液，酸度過低會降低其溶解度[30]。當酶解pH大于5.0時，越橘原花青素得率呈下降趨勢，可能是pH過高時會造成酶失活，使得越橘粉細胞壁酶解不夠完全，造成得率下降。因此，確定酶解的適宜pH為5.0。

圖4 酶解pH對越橘原花青素得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis pH on the yield of bilberry proanthocyanidins

2.2.4 酶解時間對越橘原花青素得率的影響

如圖5 所示，酶解時間在0.5～1.5 h 時，越橘原花青素得率一直在升高，當酶解時間達到1.5 h時，得率達到最大值。原因可能是：酶解時間為0.5 h時，還有較多的底物未被酶解，酶與底物反應不完全，溶出的原花青素不多，因此得率較低；酶解時間為1.0 h 時，隨著酶解時間的延長，酶與底物接觸機會越大，溶出的原花青素逐漸變多，故得率升高，此時酶與底物的反應還不夠完全；酶解時間繼續延長至1.5 h時，酶與底物反應完全，基本溶出了底物的全部原花青素，所以得率達到最大值。當酶解時間大于1.5 h 時，得率開始下降，可能是因為隨著酶解時間的延長，原花青素的穩定性不斷下降，導致了得率逐漸降低。綜合考慮時間成本與能源消耗，確定酶解的適宜時間為1.5 h。

圖5 酶解時間對越橘原花青素得率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on the yield of bilberry proanthocyanidins

2.2.5 超聲時間對越橘原花青素得率的影響

如圖6 所示，超聲時間為20～50 min 時，越橘原花青素的得率隨著超聲時間的延長而逐漸升高；超聲時間為50 min 時，原花青素得率達到最大值，可能是隨著超聲時間的延長，超聲波對越橘細胞組織不斷地破壞，使原花青素不斷溶出，得率不斷升高，此時原花青素基本上已經提取完全，得率也達到了最大值9.27%；當超聲時間大于50 min 時，得率反而下降，可能是繼續延長超聲時間，原花青素的結構被破壞導致。由此可得，超聲波處理的適宜時間為50 min。

圖6 超聲時間對越橘原花青素得率的影響Fig.6 Effect of ultrasound time on the yield of bilberry proanthocyanidins

2.3 越橘原花青素提取響應面優化試驗結果

2.3.1 響應面優化試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上進行響應面優化試驗，試驗結果見表2，方差分析見表3。對表2中的數據進行多元回歸分析，得到各因素與越橘原花青素得率（Y）的二次多項式方程為：Y＝9.29＋0.26A－0.082B-0.21C＋0.13AB＋0.27AC－0.22BC－0.29A2-0.36B2-0.47C2。

表2 響應面優化試驗設計和結果Table 2 Response surface optimization experimental design and results

由表3可知，各因素對越橘原花青素得率的影響大小排序為：A（料液比）＞C（超聲時間）＞B（酶解pH）。其中，一次項A和二次項B2、C2對越橘原花青素得率的影響均達極顯著水平（P＜0.01），一次項C、交互項AC、二次項A2對越橘原花青素得率的影響均達顯著水平（P＜0.05）?；貧w模型的P值為0.002 9，失擬項不顯著（P=0.1710＞0.05），表明擬合獲得的模型方程極顯著，回歸模型與試驗擬合良好，得出的越橘原花青素得率是可靠、有意義的。

2.3.2 各因素交互作用分析

利用Design-Expert 10軟件繪制了各因素之間兩兩交互作用的響應面圖和等高線圖，具體見圖7。料液比與超聲時間的交互作用響應面圖陡峭，且等高線圖呈橢圓形，說明因素A與因素C的交互作用對越橘原花青素得率的影響顯著，這與方差分析的結果一致。

圖7 各因素交互作用對越橘原花青素得率影響的響應面圖及等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of the effect of interaction of the various factors on the yield of bilberry proanthocyanidins

對回歸模型進行分析，得到越橘原花青素提取的最佳條件：料液比為1∶29.186（g/mL），酶解pH 為4.882，超聲時間為51.563 min，在此條件下，越橘原花青素得率最高，為9.36%。為了方便操作，將提取條件調整為：料液比1∶30（g/mL），酶解pH為5.0，超聲時間50 min。經驗證試驗得出，越橘原花青素的得率平均值為9.38%，與預測值偏差較小，說明此工藝優化具有一定的可靠性。

2.4 越橘原花青素體外抗氧化活性測定結果

2.4.1 羥基自由基清除能力

如圖8 所示，隨著質量濃度的增大，越橘原花青素粗提物溶液和抗壞血酸對·OH清除率均呈不斷上升趨勢。越橘原花青素質量濃度高于0.8 mg/L 時，其對·OH 的清除能力趨于平緩，清除率最高達97.84%，而抗壞血酸最高僅81.49%，明顯低于越橘原花青素，二者的半數抑制濃度IC50分別為0.354 mg/L和0.642 mg/L，抗壞血酸高于越橘原花青素。因此，越橘原花青素和抗壞血酸對羥基自由基都有較強的清除能力，且與質量濃度有一定的量效關系，前者的清除能力強于后者。

圖8 越橘原花青素和抗壞血酸對羥基自由基的清除能力Fig.8 Scavenging capacity of bilberry proanthocyanidins and ascorbic acid against hydroxyl radicals

2.4.2 DPPH自由基清除能力

如圖9 所示，隨著質量濃度的增大，越橘原花青素粗提物溶液和抗壞血酸對DPPH 自由基的清除率均不斷上升。越橘原花青素和抗壞血酸對DPPH 自由基都有較強的清除能力，與質量濃度有一定的量效關系。越橘原花青素提取液質量濃度高于0.8 mg/L后，對DPPH 自由基清除能力上升緩慢，清除率最高達到96.47%，而抗壞血酸最高只有82.06%，明顯高于抗壞血酸，半數抑制濃度IC50分別為0.394 mg/L 和0.705 mg/L。因此，越橘原花青素有很強的DPPH 自由基清除能力。

圖9 越橘原花青素和抗壞血酸對DPPH自由基的清除能力Fig.9 Scavenging capacity of bilberry proanthocyanidins and ascorbic acid against DPPH free radicals

2.4.3 超氧陰離子自由基清除能力

如圖10所示，隨著質量濃度的增大，越橘原花青素粗提物溶液和抗壞血酸對O-2·的清除率均不斷上升，且與質量濃度有一定的量效關系。二者對O-2·的清除率最高分別為94.47%和87.06%，半數抑制濃度IC50分別為0.387 mg/L和0.720 mg/L。因此，越橘原花青素有較強的O-2·清除能力。

圖10 越橘原花青素提取液和抗壞血酸對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.10 Scavenging capacity of bilberry proanthocyanidin and ascorbic acid against superoxide anion free radicals

3 結論

本研究對越橘原花青素的提取工藝進行了優化，并對其體外抗氧化活性進行了研究。結果表明：以越橘干果為原料，經60 ℃干燥4 h 后粉碎過篩（80目）得越橘粉，在料液比1∶30（g/mL），纖維素酶與果膠酶質量比為1∶1.2，酶解pH 5.0，酶解時間90 min，超聲時間50 min條件下，越橘原花青素得率最高，達9.38%。越橘原花青素對羥基自由基、DPPH 自由基和超氧陰離子自由基的清除率最高分別為97.84%、96.47%和94.47%，半數抑制濃度IC50分別為0.354、0.394、0.387 mg/L。這表明本試驗制備的越橘原花青素具有較好的抗氧化活性。該研究為越橘的精深加工和以原花青素為功效成分在醫學、食品等領域的產品開發提供了理論依據和技術參數，具有一定的參考價值，后期可對以越橘為主要原料的功能性食品的創新開發進行更深入的研究與探討。