L-茶氨酸延緩應激條件下秀麗隱桿線蟲的衰老

杜召鳳，李怡霏，賈 茹，屈長青,2*

（1.阜陽師范大學 生物與食品工程學院，安徽 阜陽 236037；2.阜陽師范大學 抗衰老中草藥安徽省工程技術研究中心，安徽阜陽 236037；3.安徽農業大學 茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥 230036）

衰老是自然界中的一種由不同器官和系統一系列特定變化所產生的復雜的生命現象，它是生命運動的自然過程[1]。生命體生存周期的延長通常是與機體對外界的抗脅迫能力相關。常見的脅迫環境有熱應激、氧化應激、紫外應激等。衰老是每一個生命體都不可避免的自然現象，但是隨著對生命科學探索的逐漸深入，以及現代醫學的發展，一些抗衰老藥物可以做到一定程度地延緩衰老[2]。古往今來，人們對于延緩衰老延長壽命的探尋從未停止，隨著我國社會人口老齡化的嚴重，對于抗衰老機制及抗衰老藥物的研發已成為當前生命科學研究的重要課題[3]。

茶氨酸是茶葉中特有的氨基酸[4],其主要分布在茶葉的嫩枝、子葉和根中，存在兩種同分異構體，分別為L 型和D 型茶氨酸，研究中所用到的L型茶氨酸為游離形式天然氨基酸，具有抗氧化、抗炎、神經保護、抗癌、抗焦慮、代謝調節、心血管保護、肝和腎保護以及免疫調節等作用[5-8]，是我國批準的新食品原料[9]。目前有關茶氨酸抗衰老研究的模型動物有小鼠、家禽，但是以線蟲為模型研究應激條件下的茶氨酸抗衰老功效較少。本實驗以秀麗隱桿線蟲為模式生物，采用熱應激與氧化應激兩種脅迫條件，研究L-茶氨酸對于改善各種應激引起的秀麗隱桿線蟲抗氧化逆境的作用，為L-茶氨酸抗逆境、抗衰老產品的開發應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設備

1.1.1 材料

L-茶氨酸（純度≥98%），購于上海源葉生物科技有限公司；秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans,C.elegans），包括野生型秀麗隱桿線蟲（Bristol strain N2）以及轉基因品系TJ375[hsp-16:GFP]，由阜陽師范大學抗衰老中草藥安徽省工程技術研究中心提供；大腸桿菌E.coli0P 50由阜陽師范大學抗衰老中草藥安徽省工程技術研究中心提供。

1.1.2 主要試劑及配制

谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase,CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。

M9 緩沖液(1L)：稱取3.0 g 磷酸二氫鉀，6.0 g磷酸氫二鈉，5.0 g 氯化鈉，0.25 g 七水硫酸鎂，加入去離子水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌20 min，4 ℃冰箱保存[10]。

裂解液(100 ml):取5 mol·L-1氫氧化鉀溶液和10%次氯酸鈉溶液各10 mL，定容至100 mL[11]。

NGM-OP50 培養基[12]（1 L）：稱取3.0 g 氯化鈉，17.0 g 瓊脂，2.5 g 蛋白胨，975 mL 蒸餾水，25 mL 磷酸鹽緩沖溶液，121 ℃高壓滅菌20 min 后，再加入硫酸鎂、氯化鈣以及膽固醇溶液。待冷卻后，涂布100μLE.coliOP50于平板上。

1.1.3 儀器設備

培養箱（上海一恒科技儀器有限公司）；普通冰箱（中國海爾集團有限公司）；倒置光學顯微鏡（日本Olympus 有限公司）；超凈工作臺（中國ESCO 公司）；恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；TDL80-2B 臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；高壓滅菌鍋（日本HIRAYAMA 公司）；振蕩培養箱（金壇市白新寶儀器廠）；紫外分光光度計（上海滬西分析儀器廠有限公司）；超純水儀（美國Millipore 有限公司）；酶標儀（美國BioTek 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 線蟲的培養及實驗分組

將5 d 齡體內帶卵的線蟲用M9 緩沖液沖下，進行同期化處理，20 ℃培養12 h，得到L1 期線蟲，將其接種到NGM-OP50 培養基上，20℃培養48～54 h，即得到用于實驗的L4 期線蟲，將其分為對照組和處理組，處理組用L-茶氨酸進行干預，同時根據Zarse K 等人[13]的研究，設置濃度分別為0.1、1、10μmol·L-1。分別用CD、LD、MD、HD 表示對照組、L-茶氨酸低劑量組、L-茶氨酸中劑量組、L-茶氨酸高劑量組。

1.2.2 移動力測定

建筑面積的大小是影響造價成本波動的根本因素。對于建筑面積較小的工程，工程造價成本的預估難度相對來說就小很多，且預估造價與最終決算費用的誤差也較小。而對于建筑面積較大的工程，受建筑材料、人工費用等因素價格波動影響，其最終的造價成本預估也較難控制。

收集同期化野生型N2 線蟲培養8 d，各組隨機選取100 條，記錄線蟲的移動能力。線蟲的移動力測定方法參考劉星雨[14]等人的方法，具體標準為：①秀麗隱桿線蟲自發運動，不需要觸碰刺激，記為A；②秀麗隱桿線蟲必須受到觸碰刺激才運動，記為B；③秀麗隱桿線蟲受到觸碰刺激后只擺動頭或尾，記為C。每組實驗重復三次。

1.2.3 急性熱應激實驗

本方法基于龔雨順[15]等人實驗改進，同期化野生型N2 線蟲培養3 d，隨機挑取20 條轉移至加有M9 溶液的EP 管中，在37 ℃的水浴條件下分別應激10、15、20、25 分鐘后觀察并記錄其存活率。每組實驗重復三次。

1.2.4 TJ375 型線蟲的熒光可視化

收集同期化轉基因品系TJ375 型線蟲培養3天，在35 ℃恒溫培養箱中進行熱環境脅迫處理。熱應激1 h 后，轉移至20 ℃下恢復24 h。滴加10μL 左旋咪銼溶液（1 mmol·L-1）麻醉，倒置熒光顯微鏡下觀察線蟲體內相對熒光強度，拍攝熒光圖片，利用Image J 軟件分析處理。每組實驗重復三次。

1.2.5 H202誘導的急性氧化應激實驗

收集同期化野生型N2 線蟲培養3 d，將線蟲暴露于10μL 30%的H202中，每隔5 min 觀察并記錄線蟲的存活率，直至線蟲全部死亡。每組實驗重復三次。

1.2.6 氧化應激后脂褐素水平的測定

按照1.2.6 的方法處理線蟲，在對照組的秀麗隱桿線蟲半致死時，即在30%的H202作用10 min時，挑取存活的線蟲進行熒光觀察。熒光觀察方法參照王慧[16]等實驗方法改進。配制1%濃度的瓊脂糖凝膠，每個組挑取4～5 條線蟲，滴加10 uL左旋咪銼溶液（1 mmol·L-1）麻醉，倒置熒光顯微鏡下，激發340～380 nm，發射430 nm，觀察線蟲體內脂褐素水平，拍攝熒光圖片，利用Image J 軟件分析處理[17]。每組實驗重復三次。

1.2.7 線蟲抗氧化酶活力的測定

收集同期化野生型N2 線蟲培養8 d，轉移至EP 管中，將秀麗隱桿線蟲用生理鹽水制備成冰浴勻漿，液氮速凍后解凍，重復兩次，超聲震碎，4 ℃、8000 r·min-1離心，收集上清液[18]。采用試劑盒測定線蟲體內超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT）活力。每組實驗重復三次。

1.3 數據處理

數據使用GraphPad Prism 5.0 軟件進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析，用平均值±標準差（x±s）表示?！?”表示P＜0.05，差異具有統計學意義，“**”表示P＜0.01，存在顯著性差異；“***”表示P＜0.001，存在極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 對野生型N2 線蟲移動力的影響

有研究表明，移動能力及對外界機械刺激反應的退化是測定秀麗隱桿線蟲衰老的一種指標[19]。如圖1 所示，線蟲培養至第8 天時，L-茶氨酸可以提高秀麗隱桿線蟲的移動力，說明L-茶氨酸具有提高野生型秀麗隱桿線蟲抗衰老的潛力。

圖1 L-茶氨酸對線蟲移動力的影響

2.2 熱應激下野生型N2 線蟲的壽命

在37 ℃急性熱應激情況下，不同濃度茶氨酸對野生型秀麗隱桿線蟲在10、15、20、25 分鐘時壽命的影響如圖2 所示，與CD 組相比，HD 組在10、15、20、25 分鐘時均能提升線蟲的存活率（P＜0.05），說明10μmol·L-1的L-茶氨酸能夠有效延長野生型秀麗隱桿線蟲急性熱應激下的壽命。

圖2 L-茶氨酸對熱應激下線蟲壽命的影響

2.3 熱應激下TJ375 型線蟲的相對熒光檢測

轉基因品系TJ375 型線蟲受到外界熱應激刺激后，會表達hsp：gfp 融合蛋白發揮抗逆性作用[20]，由圖3 可以得出與CD 組相比，HD 組可極顯著降低線蟲體內的相對熒光強度，降低比例為46.1%。說明L-茶氨酸對線蟲的熱應激損傷具有修復作用。

注：相對熒光強度即線蟲體內熱休克蛋白自發熒光面積與蟲體面積之比。*：與對照組相比，P＜0.05。**：與對照組相比，P＜0.01。***：與對照組相比，P＜0.001。##：與L-茶氨酸高劑量組相比，P＜0.01。

圖3 L-茶氨酸對熱應激下TJ375 線蟲熒光強度的影響

2.4 L-茶氨酸對氧化應激損傷線蟲的影響

如表1 所示，CD 組的最大壽命為17.0 ± 1.7 min，LD 組的最大壽命為22.0±1.7 min，MD 組的最大壽命為25.0 ± 1.7 min，HD 組的最大壽命為31.0±1.7 min。MD 組相對于CD 組有顯著性差異（P＜0.05），HD 組相對于CD 組有極顯著差異（P＜0.001）。說明L-茶氨酸能夠延長秀麗隱桿線蟲在氧化應激下的最大壽命。

表1 L-茶氨酸對氧化應激下線蟲最大壽命的影響

2.5 茶氨酸對氧化應激損傷線蟲脂褐素含量的影響

線蟲體內的脂褐素會隨著年齡增長而增多，可作為線蟲機體衰老的生物標志。由圖4 可知，HD 組秀麗隱桿線蟲體內的脂褐素熒光值較CD組相比顯著降低(P＜0.05)。由此說明，茶氨酸能夠有效降低氧化應激損傷引起的線蟲體內脂褐素水平，減緩線蟲機體的衰老。

圖4 L-茶氨酸對氧化應激下線蟲脂褐素含量的影響

2.6 L-茶氨酸對線蟲體內抗氧化酶活力的影響

SOD 和CAT 是線蟲體內兩種重要的抗氧化酶[21]，GSH-Px 也具有抗氧化作用，是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶。L-茶氨酸不僅可以通過非酶促抗氧化，還能夠以SOD、GSHPx 抗氧化作為防線抑制過氧化物與過氧化氫等產生的雙重抗氧化作用[22]。由圖5 可知，給予一定劑量的茶氨酸后，秀麗隱桿線蟲體內抗氧化酶活力與對照組相比顯著升高，其中，與CD 組相比，LD、MD、HD 組線蟲體內的SOD 活力分別提升了56.8%(P＜0.001)、70.8%(P＜0.001)、80.4%(P＜0.001)，均達到極顯著差異水平；CAT 活力分別提升 了25.5%、52.9%(P＜0.05)、164.7%(P＜0.001)；GSH-PX 活力分別提升了7.2%、18.6%(P＜0.05)、51.0%(P＜0.001)。說明L-茶氨酸能夠有效增強線蟲的抗氧化性，這可能是其發揮抗衰老作用的機制之一。

3 討論

本實驗從線蟲運動力測定、熱應激下壽命和相對熒光檢測、氧化應激下的壽命和脂褐素水平以及體內抗氧化酶活力測定等方面結果表明，10μmol·L-1的L-茶氨酸能夠延長秀麗隱桿線蟲在熱應激條件下的壽命以及在氧化應激的條件下的最大壽命，極顯著地降低熱應激后的相對熒光強度，提高它的抗脅迫能力。茶氨酸的合成還受到諸多生物和非生物因素的調控[23]，其啟動子區含多個響應逆境脅迫的順式作用元件，郭晨[24]等人也證明L-茶氨酸具有改善熱處理引起的小鼠組織損傷和氧化逆境的效果。L-茶氨酸可以降低氧化應激后線蟲體內脂褐素水平，減緩衰老。同時10μmol·L-1劑量組氧化損傷線蟲體內SOD、CAT 和GSH-Px 活力極顯著增加(P＜0.001)。因此我們認為這兩個方面可能與茶氨酸提高線蟲的抗衰老能力有關。已有研究表明，L-茶氨酸可通過下調小鼠體內炎癥因子的表達,減少氧化應激損傷，調控線粒體凋亡通路以減少細胞凋亡，抑制MAPK 信號通路降低促凋亡信號引起的凋亡[25-32]。本實驗結果為相關茶氨酸抗氧化保健產品開發應用提供了科學依據，但本次研究只局限于生理表型方面，后期我們將通過基因表達檢測、組學等實驗技術，系統探究其分子機制，為茶氨酸在食品工業或者制藥工程中的開發提供理論幫助。