復合酶法提取黃秋葵籽油的工藝優化及抗氧化性能研究

李雙芳，夏 琳，劉雨辰，吳博雄，劉生杰,2*，季春艷

（1.阜陽師范大學信息工程學院，安徽阜陽 236041；2.阜陽師范大學 生物與食品工程學院，安徽阜陽 236037）

黃秋葵亦稱咖啡秋葵，羊豆角等，是錦葵科草本植物，素有“綠色人參”之稱[1]。黃秋葵嫩果莢中含有許多的生物活性物質，如黃酮、低聚原花青素和多糖等，可以促進腸胃的消化與蠕動、改善便秘、滋陰補陽等功能[2-4]。但黃秋葵的莢果成熟期比較短，若不及時采收，果肉的質量會發生改變，纖維物質變多，使其食用價值降低，造成資源浪費，同時制約黃秋葵產業的健康可持續發展。因此，針對老熟黃秋葵果實的開發利用尤為必要。研究表明，在老熟黃秋葵中，籽的含量約占秋葵總重的50%。秋葵籽中油脂含量約18%-20%，與大豆中含油量相當，是一種優質功能性油脂[5-6]。其中富含豐富的必須脂肪酸，且飽和脂肪酸（SFA）、單不飽和脂肪酸（MUFA）和多不飽和脂肪酸（PUFA）比例接近1∶1∶1 的理想模式[7]，因此深入研究和開發黃秋葵籽油加工產業具有重要的研究意義。

目前，油脂的萃取工藝主要有：傳統壓榨法、浸提法、超臨界CO2萃取法和水酶法[8-10]。傳統壓榨法工藝簡單，無溶劑污染，但出油率低，耗能較高，不易在油脂工業中應用；浸提法制油出油率相對較高，有利于大規模生產等優點，但制得毛油雜質較多，且易有溶劑殘留，且浸提用溶劑均屬易燃易爆試劑，存在一定的安全隱患[11-13]。與傳統工藝相比，水酶法呈現出其“安全、高效、綠色”等特點，成為當下油脂提取方法的研究熱點[14]。陳選等[15]采用堿性內切蛋白酶制備秋葵籽油，但油脂得率相對較低。因單一酶對油料細胞分解不夠徹底，很多油脂仍以復合物的形式與其他成分結合，影響油脂提取率。采用多種酶復配提取能使油料細胞中多種復合物結構破裂，油脂分子從中溶出。目前，尚未有復合酶法對黃秋葵籽油脂提取的相關報道。

本研究以黃秋葵籽為研究對象，采用復合酶法提取黃秋葵籽油，擬考察酶制劑種類、復合酶添加量、料液比、酶解溫度、酶解時間等因素對黃秋葵籽油提取率的影響，結合響應面試驗設計對水酶法提取黃秋葵籽油工藝進行優化，擬在綠色、安全、環保的基礎上，為黃秋葵籽油的提取工藝提供理論依據，以期推動黃秋葵資源的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 實驗原料與試劑

黃秋葵籽（市場銷售）；纖維素酶（1 萬U/g）、β-葡聚糖酶（1 000 U/g）、中性蛋白酶（5 萬U/g）、木聚糖酶（10 萬U/g）、果膠酶（3 萬U/g）、酸性蛋白酶（5 萬U/g）、過硫酸鉀（AR）、ABTS、DPPH 均為上海麥克林生化科技有限公司；石油醚（60-90℃）（AR）、無水乙醇（AR）為國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗主要儀器

脂肪測定儀（Sox406）：山東海能科學儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DGT-G 系列）：合肥華德利科學器材有限公司；恒溫水浴鍋（HH-4J）：金壇市杰瑞爾電器有限公司；離心機（H5-25KR）：湖南可成儀器設備有限公司；粉碎機（BJ-800A）：德清拜杰電器有限公司；搖床（ZWYR-211D）：上海智城分析儀器制造有限公司；紫外-可見分光光度計（UV-1950）：北京普析通用儀器有限責任公司

1.3 實驗方法

1.3.1 黃秋葵籽油提取工藝流程

黃秋葵籽→粉碎過篩（60 目）→加蒸餾水→滅酶（90℃，10 min）→冷卻后調pH→加酶于搖床中酶解→冷卻后加石油醚→離心（5 500 r/min，30 min）→分離→蒸發石油醚→清油

1.3.2 黃秋葵籽油提取率的計算

（1）式中：W 為黃秋葵籽油提取率（%）；m1為清油質量，g；m2為黃秋葵籽粉質量，g；m3為黃秋葵籽中粗脂肪含量，g。

1.3.3 黃秋葵籽中粗脂肪含量測定

參照GB 5009.6-2016《食品中脂肪的測定》中索氏提取法對黃秋葵籽中粗脂肪含量進行測定。

1.3.4 酶種類的篩選

在料液比1∶5、酶解時間3 h、酶添加量3%下，考察纖維素酶、β-葡聚糖酶、中性蛋白酶、木聚糖酶、果膠酶、酸性蛋白酶在最適溫度與pH 下，對黃秋葵籽油提取率的影響。在單一酶制劑篩選的基礎上，選擇酶解最適條件接近且提取率較高的兩種酶復配。

1.3.5 單因素試驗

以黃秋葵籽油提取率為評價指標，確定最佳復合酶種類后，在其他條件不變的情況下，分別考察料液比、復合酶的添加量、酶解時間、酶解溫度、pH 對秋葵籽油提取率的影響。

1.3.6 響應面法優化試驗

在單因素試驗的基礎上，固定復合酶為酸性蛋白酶＋纖維素酶（1∶1），酶解溫度55 ℃，酶解pH 為4.0，選取對黃秋葵籽油提取率影響較大的三個主要影響因素，以黃秋葵籽的提油率為響應值，采用Box-Behnken 中心組合法設計響應面試驗，試驗因素水平表見表2。

1.3.7 抗氧化活性的測定

（1）DPPH 自由基清除能力測定[16]

取1.00 g 秋葵籽油，用無水乙醇分別稀釋至20 倍，40 倍，80 倍，120 倍，160 倍，200 倍，得到不同濃度梯度的秋葵籽油-乙醇溶液，再分別取5 mL秋葵籽油-乙醇溶液(空白組用無水乙醇代替)加入已經配置好的等體積的0.2 mmol/L DPPH 溶液，充分混合后，在室溫下避光反應30 min，后用無水乙醇進行調零，于517 nm 波長下來測定樣品的吸光度，各秋葵籽油做3 組平行測定，取均值。以相同濃度VC 作為對照組。

式中：A 為秋葵籽油樣品吸光度;A0為秋葵籽油樣品本底吸光度;A1為空白樣品吸光度。

（2）ABTS 自由基清除能力的測定[16]

ABTS 工作液的制備：取5 mLABTS 儲備液(7 mmol/L)與88 μL 過硫酸鉀溶液(140 mmol/L)充分混合，在25 ℃下避光反應14 h。將反應液用無水乙醇稀釋，使其在734 nm 波長下的吸光度為0.70±0.02，得到ABTS 工作液。

取4mLABTS 工作液，分別加入0.50 mL 不同濃度（取1.000 g 秋葵籽油，用無水乙醇分別稀釋20，40，80，120，160，200 倍）秋葵籽油乙醇溶液(空白試驗用等量無水乙醇代替)，混勻后于25 ℃下避光反應30 min，在734 nn 波長下測定吸光度，各試樣做3 組平行。以相同濃度VC 作為對照組。

式中：A 為秋葵籽油樣品吸光度；A0為秋葵籽油樣品本底吸光度；A1為空白樣品吸光度。

1.3.8 數據處理

單因素試驗結果分析圖用Origin 2019b 軟件繪制，顯著性分析采用SPSS 2021 軟件分析；響應面試驗設計及分析采用Design Expert 8.0.6 軟件。

2 實驗結果與分析

2.1 酶制劑的篩選

2.1.1 單一酶種類的篩選

稱取10 g 黃秋葵籽粉，按照料液比1∶5 添加去離子水，調節提取溫度和pH 至各酶的最適條件（參照表1），分別加入3%的酶，混勻后放入搖床，在6 種酶最適條件下提取3 h，考察6 種酶對黃秋葵籽油提取率的影響，結果如圖1 所示。添加酶制劑后，均能顯著提高黃秋葵籽油的提取率（P＜0.05），其中提油效果最好的為中性蛋白酶（19.69% ± 1.22%）和酸性蛋白酶（19.28% ±0.12%），纖維素酶（13.6%±1.4%）提取效果次之，其次是β-葡聚糖酶（11.4% ± 0.37%）和果膠酶（11.18%±0.9%），木聚糖酶提油率較低（7.08%±0.32%），后續復配試驗舍棄該酶。這是因為植物種子細胞壁中主要成分為纖維素、木質素、果膠等，油脂通常與其他大分子物質結合構成脂多糖、脂蛋白等復合物，加酶后，可有效瓦解細胞壁結構，破壞脂蛋白、脂多糖復合物結構，使油脂有效地釋放出來，從而提高了提油率[17]。但由于酶具有專一性，單一酶提油效果仍較差，為進一步提高油脂提取率，發揮復合酶的協同作用，選用提油率較高、提取條件接近的酶復配進行酶解。

圖1 酶種類對黃秋葵籽油提取率的影響

表1 各種酶的最適溫度與最適pH

表2 響應面設計試驗因素水平表

2.1.2 復合酶種類的篩選

將空白對照作為組1，因酸性蛋白酶和果膠酶的最適溫度（50℃）和pH（3.5）相同，設為組2；同理，設中性蛋白酶＋β-葡聚糖酶為組3（提取溫度50℃，pH 為6.0）、酸性蛋白酶＋纖維素酶為組4（提取溫度50℃，pH 為4.0）、纖維素酶＋果膠酶為組5（提取溫度50℃，pH 為4.0）、纖維素酶+β-葡聚糖酶為組6（提取溫度50℃，pH 為5.0），各組酶添加比例均為1∶1，酶添加總量為3%，料液比1∶5 條件下提取3 h，考查不同酶復合對黃秋葵籽油提取率的影響，結果如圖2 所示。酸性蛋白酶+纖維素酶復配時，黃秋葵籽油提取率最高（44.6%±1.09%），顯著高于其他復合酶提油效果（P＜0.05）。這是因為纖維素酶的存在，能有效破壞黃秋葵籽的細胞壁結構，使酸性蛋白酶能充分接觸并分解包埋在細胞壁內的脂蛋白，兩者發揮協同作用，將包埋在細胞壁內的油脂盡可能多的釋放出來[18]。因此后續試驗選用酸性蛋白酶＋纖維素酶（1∶1）作為油脂提取的復合酶。

圖2 不同復合酶對黃秋葵籽油提取率的影響

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 復合酶添加量的確定

固定料液比為1∶5、酶解溫度為50℃、酶解pH 為4、酶解時間為3 h 的條件下，考察復合酶（酸性蛋白酶＋纖維素酶，1∶1）添加量對黃秋葵籽油提取率的影響，結果見圖3。隨著復合酶添加量增加，酶與黃秋葵籽粉更充分接觸，使得黃秋葵籽油提取率不斷上升，當酶添加量為4%時，黃秋葵籽油提取率最高（47.55%±0.65%），顯著高于其他組（P＜0.05）。當酶添加量繼續增加時，提取率反而下降，可能是由于過多的酶會對油脂產生吸附作用，使提油率略有下降[19]。因此，后續試驗將復合酶添加量固定為4%。

圖3 復合酶添加量對黃秋葵籽油提取率的影響

2.2.2 料水比對黃秋葵籽油的提取率影響

在纖維素酶+酸性蛋白酶復合酶（1∶1，酶添加總量為4 %）、酶解溫度為50℃、酶解pH 為4.0、酶解時間3 h 條件下，考察不同料水比對黃秋葵籽油提取率的影響，結果如圖4 所示。提油率隨著料水比增加，呈先上升后下降趨勢，當料水比為1∶4 時，提油率最高（50.27% ± 0.008%）。料液比過高或過低時，均不利于秋葵籽油提取，分析原因是由于加水量較低時，提取液相對黏稠，不利于酶與大分子物質充分接觸，加水量過高時，提取液太稀，也減少了酶與油料分子的接觸機會，降低了酶解速率[20]。因此，將料水比1∶4 作為復合酶提取黃秋葵籽油的最佳比例。

圖4 料水比對提取黃秋葵籽油的影響

2.2.3 酶解pH 對黃秋葵籽油的提取率影響

在纖維素酶+酸性蛋白酶復合酶（1∶1，酶添加總量為4%）、酶解溫度50℃、酶解時間3 h、料水比1∶4 條件下，考察pH 在3.0～5.0 范圍內對秋葵籽油提取率的影響。如圖5 所示，在此范圍內，提油率隨著pH 增加，呈先上升后下降趨勢。當pH為4.5 時，提油率為43.55%±1.46%，顯著高于其他pH（P＜0.05），說明此條件下復合酶的活力較高。因此，確定pH 4.5 為復合酶提取黃秋葵籽油提取的最佳pH。

圖5 酶解pH 對提取黃秋葵籽油的影響

2.2.4 酶解溫度對黃秋葵籽油的提取率影響

在纖維素酶+酸性蛋白酶復合酶（1∶1，酶添加總量為4%）、料水比1∶4、酶解pH 4.0、酶解時間3 h 的條件下，考察酶解溫度對黃秋葵籽油提取率的影響，結果如圖6 所示。黃秋葵籽油提取率隨著酶解溫度升高，上升后下降，在酶解溫度為55℃時的提油率最高，達到52.1%±0.09%，溫度繼續升高時，提取率反而下降，分析原因為溫度升高會使復合酶的活性受到影響，進而影響破壁程度，減緩油脂提取速率。因此，確定酶解溫度55℃為復合酶提取黃秋葵籽油最適酶解溫度。

圖6 酶解溫度對黃秋葵籽油提取率的影響

2.2.5 酶解時間對黃秋葵籽油的提取率影響

在纖維素酶+酸性蛋白酶復合酶（1∶1，酶添加總量為4%）、料水比1∶4、酶解pH 4.0、酶解溫度55℃條件下，考察酶解時間對黃秋葵籽油提取率的影響，結果如圖7 所示。酶解時間從1 h 到3 h時，提油率逐步上升，當酶解時間為3 h 時，提油率為52.29%±0.01%，3 h 之后提油率逐漸下降。這是因為在合適的酶解時間內，酶可以完全作用破壞細胞壁結構，提取率相對較高。當酶解時間不足時，酶解不完全，提油率較低；當酶解時間較長時，會增加蛋白質與油脂發生乳化反應，降低游離油含量[21]。因此，確定酶解時間3 h 為復合酶提取黃秋葵籽油的最佳酶解時間。

圖7 酶解時間對黃秋葵籽油提取率的影響

2.3 響應面分析法優化黃秋葵籽油提取工藝

2.3.1 響應面試驗設計結果分析

在單因素試驗基礎上，固定水酶法提取油脂的復合酶為纖維素酶＋酸性蛋白酶（1∶1）、酶解pH 為4.5，酶解溫度為55℃。以黃秋葵籽提油率（Y）為響應值，選取料水比（A）、酶添加量（B）、酶解時間（C）三個因素作為自變量，結合Box-Behnken 中心組合設計三因素三水平優化試驗，具體結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果

2.3.2 響應面回歸模型及方差分析

對表3 試驗數據進行回歸擬合，得到二次多項回歸方程為：

對模型進行方差分析，結果如表4 所示?；貧w模型（P＜0.0 001）顯著，且失擬項（P＞0.05）不顯著，說明可用此模型具有可信性，可以用來對試驗結果進行分析和預測。模型回歸系數R2為0.9 985，R2pred為0.9 817，表明模型預測值與實驗結果之間有良好的擬合性，校正后模型的回歸系數R2Adj為0.9 966，表明測試值與校正值之間較接近，有良好的擬合性。

表4 響應面回歸模型方差與顯著性分析

由F 值可知，三個因素對黃秋葵籽油提取率影響次序分別為B（酶添加量）＞A（料水比）＞C（酶解時間）。另外，由P 值可知，A、B、C 及AB、A2、B2、C2對黃秋葵籽油的提取率均有極顯著影響（P＜0.01）。

2.3.3 響應面交互作用分析及最優條件的確定

響應面的坡度反映了各因素之間的相互作用與其對應響應值的敏感程度，坡度越陡峭表明2個因素之間的交互作用對其響應值的影響越顯著。以黃秋葵籽油提取率為響應值，分析3 個因素之間的兩兩交互作用，由圖8 中三組響應面圖及等高線圖可以看出，A（料液比）和B（酶添加量）兩兩交互作用時得到的響應面坡度較為陡峭，等高線圖接近橢圓形，AC、BC 兩兩交互作用時，響應面坡度較平緩。因此判斷因素A（料液比）和因素B（酶添加量）之間交互作用更強。

圖8 各因素交互作用對黃秋葵籽油提取率的影響

通過Design Expert 8.0.6 軟件對秋葵籽油最佳提取工藝預測分析，并考慮到實際的操作，最終得到水酶法提取黃秋葵籽油的最佳工藝條件為：料液比1∶4（g/mL）、酶添加量為4.25%、酶解時間為3.25 h，在此條件下提取率為54.93%。為進一步驗證模型的可靠性，在此條件下進行3 次平行試驗驗證，得出黃秋葵籽油的提取率為（56.56 ±0.58）%，與預測值接近，表明優化后得出的參數條件是可靠的，所建響應面模型有效。

2.4 黃秋葵籽油抗氧化能力

2.4.1 黃秋葵籽油對DPPH 自由基的清除能力

DPPH 自由基為一種相對穩定的自由基，在波長517 nm 處有最大吸收，當自由基清除劑存在時，DPPH 自由基中單電子被捕獲，在最大吸收波長處吸光值減小，且減小程度呈線性關系[22]。

由圖9 可知，隨著黃秋葵籽油濃度的不斷增加，對DPPH 自由基的清除能力不斷升高。在濃度為5 mg/mL 時，VC 的自由基清除能力更強，對DPPH 自由基清除能力就大于90%，遠高于秋葵籽油的清除能力（58.32% ± 0.13%）。但在5～25 mg/mL 范圍內，隨著黃秋葵籽油濃度增加，其清除DPPH 自由基能力逐漸加快，之后趨勢趨于平緩。當秋葵籽油濃度為50 mg/mL 時，對DPPH 自由基的清除能力最高可達95.25% ± 0.32%，與相同濃度下，VC 對DPPH 自由基清除能力較接近，分析可能與秋葵籽油中含有一定量的不飽和脂肪酸及維生素E 有關。

圖9 黃秋葵籽油對DPPH 自由基的清除能力

2.4.2 黃秋葵籽油對ABTS 自由基的清除能力

ABTS 自由基儲備液為深藍色，在734 nm 處有吸收，當加入具有自由基清除劑的物質后，儲備液顏色變淺，吸收強度會減少，減少幅度也呈線性關系[22]。ABTS 自由基是如圖10 可知，黃秋葵籽油對ABTS 自由基清除能力隨著其濃度增加不斷升高，說明秋葵籽油在清除自由基能力方面具有一定作用。當秋葵籽油濃度為5 mg/mL 時，其清除ABTS 自由基的能力僅有15.26% ± 0.23%，相同濃度下的VC 對ABTS 自由基的清除能力達到95.3%±0.22%；當秋葵籽油濃度上升到50 mg/mL時，其對自由基清除能力可提升到76.46% ±0.88%，與VC 對ABTS 自由基清除能力逐漸接近。表明秋葵籽油具備抗氧化能力，且與其中含有不飽和脂肪酸及維生素E 有一定關系。

圖10 黃秋葵籽油對ABTS 自由基清除能力

3 結論

復合酶作用于黃秋葵籽粉，可使油料細胞破裂更充分，更徹底，從而提高油脂提取率。本研究首先通過單因素試驗篩選出纖維素酶+酸性蛋白酶(1∶1)作為水酶法提取黃秋葵籽油的復合酶。再通過單因素試驗及響應面優化分析法對水酶法制取黃秋葵籽油工藝進行探索，得出水酶法萃取黃秋葵籽油的最優條件為：酶解溫度55℃、酶解pH 為4.0、料液比1∶4、酶添加量為4.25%、酶解時間為3.25 h。在此條件下，黃秋葵籽油的提取率為（56.56±0.58）%，與陳選[15]通過單一堿性蛋白酶提取秋葵籽油（提取率14.25%±0.06%）及姚宏亮[23]通過溶劑法萃取秋葵籽油（24.88%±0.12%）相比提取率較高。秋葵籽油對DPPH 自由基和ABTS自由基均有一定的的清除能力，其中當秋葵籽油濃度為50 mg/mL 時，對DPPH 自由基的清除能力可達到95.25%，與相同濃度下，VC 對DPPH 自由基清除能力接近。該研究為黃秋葵籽油的水酶法提取工藝提供了理論支持和技術依據，為黃秋葵籽資源的綜合利用提供參考。