維生素C對禁食黃顙魚抗氧化能力和肌肉品質的影響

汪 蘭，夏雨婷，胡 澳，陳 朗，郭曉嘉，喬 宇，吳文錦，石 柳，黃 云，彭條鳳，熊光權，陳 勝

（1.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，農業農村部農產品冷鏈物流技術重點實驗室，湖北 武漢 430064；2.湖北省農業科技創新中心農產品加工研究分中心，湖北 武漢 430064；3.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068；4.湖北華醇食品有限公司，湖北 荊門 420800）

黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）隸屬于鲇形目（Silurformes）鲿科（Bagride）黃顙魚屬（Pelteobagrus），其肉質鮮甜美味，是近些年我國大范圍推廣養殖的淡水經濟魚類。黃顙魚主要以鮮活品暢銷于國內，在東南亞國家也擁有巨大的市場潛力[1]。然而，鮮活水產品在運輸環節不可避免會產生應激，目前水產養殖行業普遍采用的緩解運輸應激的技術包括增強魚體營養物質供應、避免高溫養殖以及禁食暫養等[2]，其中禁食暫養是最普遍的緩解手段[3]。禁食暫養目的是維持魚類在生存環境條件下的能量代謝，減少捕撈或者運輸導致的應激反應，使腸道分泌物排空，降低耗氧量，提高魚體的抗逆能力以及肌肉品質[4]。

前人研究發現維生素C（VC）因其抗氧化作用能夠有效緩解治療家禽、牲畜運輸過程中應激帶來的不利影響[5-6]。另外，VC同樣常被用作飼料添加劑激活生物體內相關酶活，能夠防治魚類貧血癥和出血癥，促進魚類快速生長，增強機體抵抗性并提升特異性免疫功能[7-9]。本研究團隊之前發現運輸水體中添加VC能夠緩解運輸熱應激引起的虹鱒（Oncorhynchus mykiss）應激反應以及改善肌肉品質[10]。但目前尚缺乏關于VC用于黃顙魚禁食暫養改善其肌肉品質的研究報道。本研究通過探究不同添加濃度VC對禁食暫養的黃顙魚血清和肌肉抗氧化特性及肌肉品質的影響，以期探索更為有效的魚類暫養手段，為鮮活黃顙魚的耐運性及品質提升提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料和試劑

鮮活黃顙魚，（130 ± 20）g，購于湖北省武漢市白沙洲生鮮市場。

維生素C（VC）購于國藥集團化學試劑有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、總蛋白（TP）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器

便攜式pH 計、電子分析天平、TGL-24MC 臺式高速冷凍離心機，購于長沙平凡儀器儀表有限公司；CR-400 色差計，購于日本Konica-Minolta 公司；TA-XT Plus 質構儀，購于英國Stable Micro Systems公司；UV-2550 分光光度計，購于日本島津公司；HH-6數顯式恒溫水浴鍋，購于常州國華電器有限公司；NMI20-025V-I成像系統，購于日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 暫養處理 選取200 尾健康黃顙魚，以40 尾為一組分別放置于5 個30 L 的專用運輸尼龍袋中，每個運輸袋中裝有20 L 曝氣水，運輸水溫為15.6 ℃，溶氧量8.7 mg/L。運輸30 min 放到湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所室內循環水養殖系統，將200 尾黃顙魚平均放置在4 個不同的水箱里（1.12 m× 0.70 m × 0.32 m），分為4 組：T0-0組（0 mg/L VC，暫養0 d）、T0-5組（0 mg/L VC，暫養5 d）、T10-5 組（10 mg/L VC，暫養5 d）、T30-5 組（30 mg/L VC，暫養5 d），水中添加VC含量參考文獻[11]并略微修改。以50 尾為一組進行暫養，然后用200 mg/L 的MS-222 麻醉進行麻醉，取新鮮背部肌肉測定肌肉品質部分指標，另取血清和背部肌肉，液氮速凍后放入-80 ℃冰箱待測。

1.3.2 抗氧化物質測定 將-80 ℃存放的血清和魚肉放在4 ℃冰箱解凍3 h，準確稱取組織質量，按照質量：體積=1 g∶9 mL 的比例加入4 ℃質量分數0.86%生理鹽水，在冰水浴的條件下進行均質，制成質量分數20%的組織勻漿，將制備的組織勻漿在4 ℃下以3 500 r/min離心10 min，取其上清液測定蛋白質量，采用鉬酸銨法測定CAT，采用比色法測定GSH，采用TBA 法測定MDA，采用WST-1 法測定SOD，均使用酶標儀并嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.3 離心損失率的測定 稱取2 g 魚肉樣品，并裁剪紗布，稱量紗布的質量記為m1（g）；用紗布包裹魚肉后，稱取紗布和魚肉總質量，記為m2（g）。用兩張大濾紙包裹紗布和魚肉，將其置于離心管中，以3 500 r/min常溫離心10 min，再次稱其質量，記為m3（g）。離心損失率（%）按下列公式計算：

1.3.4 色澤測定 將經過處理的黃顙魚背部肌肉取出，使用色差儀測定樣品剖面的亮度L*、紅綠度a*、黃藍度b*值。a*值正值表示紅色，負值表示綠色；b*值正值表示黃色，負值表示藍色。先對儀器進行校準，在對其所需部位進行測量，每組樣品測5 次，取平均值按下列公式計算：

1.3.5 質構特性測定 取黃顙魚背部肌肉，采用質構儀測定彈性和黏性。將樣品置于P/36R 探頭下，測試條件為：測前速率2 mm/s、測中速率0.5 mm/s、測后速率2 mm/s、測試深度5 mm、觸發力為49 N、計算閾值為20 g。每組樣品每個平行重復測定9次，結果取平均值。

1.3.6 剪切力測定 將魚肉修剪為魚塊后，將其置于質構儀A/CKB 探頭下，剪切力測定參數為：力臂25 kg、壓縮變形50%、測前速率5.0 mm/s、測中速率1.0 mm/s、測后速率5.0 mm/s。

1.3.7 pH 值測定 將魚肉剁碎，稱取1.0 g 的魚肉裝入15 mL 離心管，加入9 mL 蒸餾水，置于4 ℃冰箱靜置30 min，用精密pH 計測定上層澄清液pH 值并記錄。每個樣品做3次平行實驗，結果取平均值。

1.3.8 組織微觀結構觀察 沿著垂直于魚肉肌纖維方向進行取樣（1 cm×2 cm×6 mm），將其置于質量分數4%的多聚甲醛固定液中固定24 h 以上。固定完成后取出進行修整，依次放入質量分數15%、30%蔗糖溶液中脫水。脫水完成后吸干表面水分，置于包埋臺上，組織周圍滴加冷凍切片包埋劑，然后將其放在冰凍切片機上速凍包埋，切片，厚度為8～10 μm，蘇木素-伊紅染液染色，然后置于光學顯微鏡下觀察組織微觀結構，利用Case Viewer 和Image J軟件處理圖像。

1.4 數據處理

數據使用Excel 軟件進行處理，采用SPSS 27.0軟件中的Duncan 法進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，用GraphPad Prism 5.0軟件作圖。

2 結果

2.1 維生素C對禁食黃顙魚血清抗氧化體系的影響

如圖1所示，經過5 d禁食暫養，相比于T0-0組，T0-5 組的黃顙魚血清中CAT、GSH、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性和脂質過氧化產物MDA 含量均顯著下降（P＜0.05），而超氧化酶歧化酶（SOD）活性無顯著變化（P＞0.05）。暫養5 d 后，隨著維生素C 添加量的增加，黃顙魚血清中抗氧化物質的活性呈現先上升后下降的趨勢，脂質過氧化產物MDA 的含量呈現先下降后上升的趨勢。其中，相比于T0-5 組，添加10 mg/L VC的禁食暫養組（T10-5）血清中抗氧化物質SOD、CAT、GSH、GSH-PX 活性均顯著增強（P＜0.05），而添加30 mg/L VC的禁食暫養組（T30-5）的血清中除GSH 活性顯著升高（P＜0.05），其他抗氧化物質活性未有顯著變化（P＞0.05）。

圖1 維生素C對禁食黃顙魚血清中抗氧化體系的影響Fig.1 Effects of temporary VC supplementation on antioxidant system in the serum of yellow catfish after fasting

2.2 維生素C對禁食黃顙魚肌肉抗氧化體系的影響

如圖2所示，經過5 d暫養，相比于T0-0組，T0-5組黃顙魚肌肉中SOD 活性顯著較高（P＜0.05），CAT、GSH 活性和MDA 含量顯著較低（P＜0.05）。T10-5組肌肉中SOD 和GSH 活性顯著高于T0-5組，而T30-5 組肌肉中SOD 和GSH 活性顯著低于T0-5組，這兩組CAT 活性和MDA 含量未有顯著變化（α=0.05）。

圖2 維生素C對禁食黃顙魚肌肉中抗氧化體系的影響Fig.2 Effects of temporary vitamin C supplementation on antioxidant system in the muscle of yellow catfish after fasting

2.3 維生素C對禁食黃顙魚肌肉組織結構的影響

如圖3 所示，相比于T0-0 組，T0-5 和T10-5 組的黃顙魚肌肉組織結構有明顯的改變，表現為肌肉間隙逐漸縮小，肌肉組織逐漸變緊，纖維變得結構更加致密均勻。而T30-5 組的肌肉組織則又表現為相對松散的結構，且肌肉間隙變大。

圖3 維生素C對禁食黃顙魚肌肉組織結構的影響Fig.3 Effects of temporary vitamin C supplementation on histology of muscle in yellow catfish after fasting

2.4 維生素C對禁食黃顙魚肌肉品質的影響

如圖4 所示，相比于T0-0 組，暫養5 d 能顯著改變黃顙魚肌肉的白度值和離心失水率（P＜0.05），對pH 值影響不大。隨著維生素C 添加量的增加，黃顙魚肌肉pH 值顯著降低（P＜0.05），白度值先增加后下降，離心失水率先降低后升高。暫養5 d 能顯著降低黃顙魚肌肉的剪切力、硬度、咀嚼性、黏性（P＜0.05）。隨著維生素C 的添加，黃顙魚肌肉的剪切力、硬度、咀嚼性、黏性、彈性均呈現先上升后下降的變化。相比于T0-5組，T10-5組肌肉的剪切力、硬度、咀嚼性和黏性顯著升高（P＜0.05），彈性有所升高但不顯著（P＞0.05），T30-5 組肌肉的硬度顯著升高（P＜0.05），但剪切力、咀嚼性、黏性和彈性未有顯著變化（P＞0.05）。T30-5 組相比于T10-5 組的肌肉剪切力、咀嚼性、黏性均顯著下降（P＜0.05），硬度和彈性有所下降但不顯著（P＞0.05）（表1）。

表1 維生素C對禁食黃顙魚肌肉質構特性的影響Table 1 Effects of temporary vitamin C supplementation on muscle texture characteristics of yellow catfish after fasting

圖4 維生素C對禁食黃顙魚肌肉品質的影響Fig.4 Effects of temporary vitamin C supplementation on muscle qualities of yellow catfish after fasting

3 討論

魚類在過程中普遍存在著應激反應，表現為魚體代謝過程顯著加強，大量氧自由基生成引起氧化應激，進一步導致機體細胞、組織損傷，引發生理紊亂和嚴重的經濟損失[11]。VC具有促進魚類生長、減少組織氧化損傷、提高抗應激能力及免疫力、促進機體代謝和緩解重金屬對機體的危害等作用[12-16]。本研究在黃顙魚禁食暫養條件下進一步探究不同VC含量添加對黃顙魚抗氧化能力和肌肉品質的影響。

魚類表現的抗氧化應激能力主要依靠抗氧化系統起作用，分為酶促抗氧化系統和非酶促抗氧化系統，酶促抗氧化系統中有包括SOD、CAT、GSHPX，非酶類抗氧化物質系統有GSH[17]。本研究發現，相比于T0-0 組，T0-5 組血清和肌肉中的抗氧化物質活性顯著下降，這可能是因為魚體應激產生大量的自由基，導致抗氧化系統被激活，抗氧化酶活性增強，以更好清除所產生的自由基。而禁食暫養有助于魚體恢復生理穩態，抗氧化物質活性隨之減弱。類似的研究發現運輸應激會引起黃顙魚SOD活性顯著升高，麻醉劑的添加會降低魚體活動，改善應激反應，降低SOD的活性[18]，而氨氮脅迫會導致虹鱒（Oncorhynchus mykiss）肌肉中SOD、CAT 活性顯著增強[19]，也會導致紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）血清中SOD、CAT、GSH-PX 和GSH 活性顯著增強[20]。本研究也發現10 mg/L VC禁食暫養5 d能顯著提高黃顙魚血清和肌肉中抗氧化物質的活性，這與VC作為飼料添加劑能增強黃顙魚幼魚血清中抗氧化物質活性和增強草魚（Ctenopharyngodon idella）SOD、GSH 活性以應對重金屬誘導的氧化應激的結果一致[1,21]。此外，添加10 mg/L VC組血清和肌肉中GSH 酶活性均高于其他三組，說明濃度為10 mg/L 的VC能夠增強黃顙魚的非酶促抗氧化系統，增強清除自由基的能力[22]。而在血清中，GSH-PX 的酶活性最高，這是由于GSH-PX 能夠催化GSH 將H2O2分解為水，添加10 mg/L的VC能夠促進GSH-PX酶活性增加，從而加速GSH 對H2O2的分解，達到清除自由基的目的。30 mg/L VC禁食暫養組相比于10 mg/L VC禁食暫養組的黃顙魚抗氧化能力顯著下降，這可能是因為較高濃度VC會損壞黃顙魚抗氧化系統，導致抗氧化物質的活性下降。與劉漢鵬等[23]關于盤麗魚（Symphysodon aequifasciata）幼魚VC最適添加量以及Xu 等[24]關于VC對銀鮭（Oncorhynchus kisutch）抗氧化能力的研究結果一致，本研究也發現黃顙魚抗氧化能力隨著VC的濃度先上升后下降，10 mg/L低質量濃度VC能促進黃顙魚抗氧化能力。MDA 作為脂質氧化的主要產物，具有非常強的生物毒性[25-26]，常常作為評價水產品肌肉品質劣變的關鍵指示物[10,27-28]。本研究中MDA 的含量與抗氧化物質活性的變化呈現相反變化特征，這也與周傳朋等[29]對魚類抗氧化體系的研究結果一致。

黃顙魚作為重要的淡水經濟魚類，其消費狀況與肌肉品質密切相關。禁食暫養作為水產品上市前的重要環節能夠有效改善魚類品質[2]，本研究中T0-0 組的肌纖維間隙明顯增大，樣品組織結構較為松散，這說明黃顙魚在經過運輸后氧化應激增強，導致品質劣化。而禁食暫養組肌纖維間隙減小，且T10-5組纖維間隙較緊密，說明添加10 mg/L VC能夠維持肌肉組織的完整性。此外，添加30 mg/L VC的肌肉纖維組織結構完整性被破壞，導致細胞發生破裂。VC添加的量不同對禁食暫養黃顙魚的肌肉品質會有不同程度的影響。pH 值雖能一定程度上反映魚肉的新鮮度[30]，但由于VCpH 呈酸性，這導致魚肉的pH 隨著維生素的添加顯著降低。添加10 mg/L的VC白度值最高，說明通過向水體添加適當濃度的VC，能夠使黃顙魚色澤更鮮亮。通過禁食暫養后，離心損失率均較T0-0 組有所降低，說明黃顙魚經過禁食暫養后能夠提高肌肉的保水性。T10-5 組離心損失率最低，說明添加10 mg/L 的VC能夠進一步增強肌肉的保水，而添加30 mg/L VC又會導致肌肉水分的流失，持水力降低。質構能夠評價肌肉組織的物理特性，分別從剪切力、硬度、彈性、咀嚼性等指標來評價肌肉的品質的好壞[31]。研究結果發現隨著VC添加量的增加，黃顙魚肌肉的剪切力、硬度、咀嚼性、黏性、彈性均呈現先上升后下降的變化狀態，這表明10 mg/L 的VC能顯著提高黃顙魚肌肉的質構特性，使魚肉更加緊致且富有彈性，增強魚肉的口感，而30 mg/L 的VC對肌肉品質沒有顯著的影響，與前文抗氧化能力的結果以及組織結構的結果一致，也與前人報道的飼料添加VC提高草魚[32]、大菱鲆（Scophthalmus maximus）[33]肌肉品質的研究結果一致。

4 結論

禁食暫養5 d 能有效緩解因運輸導致的黃顙魚應激反應，相較于T0-0 組，其抗氧化物質活性下降，肌肉品質提升。而10 mg/L 的維生素C 禁食暫養能顯著提高黃顙魚抗氧化能力和肌肉品質，但較高質量濃度（30 mg/L）維生素C 對黃顙魚的提升效果并不明顯，甚至產生負面影響。