高通量測序技術在海關監管中的應用概述

陳莉 鄭耿東 周廣彪 周連柱 張崢嶸 溫爾英 利光輝*

（1.汕頭海關技術中心 廣東汕頭 515041；2.中國農業科學院植物保護研究所）

0 引言

近年來，高通量測序技術的質量不斷提高，速度不斷加快，成本不斷降低，被廣泛應用于許多生態位中的整個原核生物群落。 第一代測序技術是由Frederick Sanger 于1977 年在選擇性加入鏈端雙脫氧核苷酸的基礎上開發的[1]。 Sanger 測序采用DNA復制原理，由于缺少羥基基團，不具有與另一個脫氧三磷酸核苷酸連接形成磷酸二酯鍵的能力， 這些雙脫氧三磷酸核苷酸可用來終止DNA 鏈的延伸。 此外， 這些雙脫氧三磷酸核苷酸上連接有放射性同位素或熒光標記基團， 因此可以被自動化儀器或凝膠成像系統所檢測到[2]。

一代測序是一種經過驗證的測序技術， 具有高準確性和可靠性。相比其他測序技術，一代測序可以直接測序較長的DNA 片段，有利于研究基因組結構和功能的重要區域。一代測序的準確性較高，適用于研究較小的DNA 片段以及研究基因組結構和功能的重要區域，如尋找個體間遺傳差異、鑒定個體間的核苷酸突變等。盡管如此，一代測序技術相對于后續代的測序技術，需要更長的時間來完成測序過程，成本較高，不適用于大規模測序項目。雖然目前一代測序在市場占有較大比重，但其存在測序通量低、維護成本高等難以避免的缺陷， 已無法滿足日益增長的測序需求，隨著科學技術的飛速發展，新一代測序技術應運而生。

二代測序技術相較于一代測序而言準確率稍有降低，但通量和產出大大增加，可以同時針對多個樣本進行測序，較一代測序實現了數量級增長[3]。 二代測序技術是基于PCR 和基因芯片發展而來的DNA測序技術，引入可逆終止末端，從而實現邊合成邊測序。二代測序在DNA 復制過程中通過捕捉新添加的堿基所攜帶的特殊熒光分子標記來確定DNA 的序列。 由于在二代測序中，單個DNA 分子必須擴增成由相同DNA 組成的基因簇， 然后進行同步復制，來增強熒光信號強度從而讀出DNA 序列[4]。 二代測序相比于一代測序方法具有許多優勢。 二代測序可以同時解讀數百萬到數十億個DNA 片段，大大提高了測序速度和效率。 通過多次重復測序和專業的分析算法，可以減少測序誤差，提高結果的準確性。 由于高通量的特點，每個樣本的測序成本大幅降低，使得研究人員可以更容易地開展大規模測序項目。 二代測序可用于不同大小和類型的DNA 或RNA 樣品，適用于基因組測序、 轉錄組測序、 外顯子組測序、ChIP-Seq 等多種應用場景。 其可以提供豐富的信息，包括序列、甲基化狀態、染色質亞型等，為深入理解基因組功能提供了更多的維度。 由于二代測序產生的數據量大， 需要消耗大量的計算資源和存儲空間，并需要復雜的數據處理和分析流程。二代測序在單次測序長度上存在一定限制， 尤其是短讀長測序技術， 對結構復雜的基因組部分需要進行拼接和重組，可能會引入一定的誤差。對于高度重復性較高的基因組區域（如全基因組DNA 甲基化測序），二代測序可能面臨難以解決的挑戰。 目前二代測序主要應用于基因組學、 轉錄組學、 微生物學等相關方面研究。其高通量、低成本和豐富的信息輸出為深入理解基因組功能和疾病機制提供了強大的工具。

目前二代測序平臺主要由羅氏454 焦磷酸平臺、Illumina 測序平臺、SOLiD 高通量測序儀[4]和Ion Torrent 和華大智造。 羅氏454 測序平臺，是基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統， 通過合成反應而測序的原理進行測序，其具有分析結果快速、準確、高靈敏度和高自動化的特點，主要應用于物種基因文庫構建、 分子進化研究領域的應用和功能驗證等領域的應用。 Illumina 測序儀通常也被稱為Solexa分析儀，基于可逆終止的、熒光標記dNTP，實現邊合成、邊測序的化學反應，測序精準度高等優點，相較于Roche454 測序平臺，其讀長在100～150 bp 之間，主要適用于甲基化和表觀遺傳學研究[5]。SOLiD 高通量測序技術是四種熒光標記寡核苷酸的連接反應測序，由于其讀長序列為50～75 bp，具有較高的精確度，主要應用于基因重測序和SNP 檢測。Ion Torrent是一種基于離子探測技術的二代測序方法。 其原理基于DNA 聚合酶催化單核苷酸加入模板DNA 鏈，并通過監測釋放的氫離子來測量DNA 合成過程。Ion Torrent 測序通過離子探測技術實現高通量、快速且相對低成本的二代測序。然而，由于其特殊的原理和技術限制， 其在一些應用場景中可能存在一些劣勢。華大智造的二代測序平臺，基于Illumina 測序技術進行數據獲取和分析。具有高通量、高準確性和多樣性及應用廣泛等方面的優勢， 但在數據處理和微少突變檢測方面仍存在一些劣勢。

顯然一代測序和二代測序仍然具有一定的局限性，現代科技的迅速發展，生物測序技術也已發展到了三代測序，即指單分子測序技術。DNA 測序時，不需要經過PCR 擴增， 實現了每一條DNA 分子的單獨測序。同時可實現DNA 或RNA 的直接測序，減少前期樣本的逆轉錄和擴增步驟，實現高通量，長讀長的全長測序[6]。

三代測序技術能夠實現更高的測序產量， 可以同時測序多個樣本，提高測序效率。相較于二代測序技術，三代測序技術可以產生更長的讀長，從而提供更多的堿基信息， 有助于解決基因組重復序列和結構變異等難以分析的問題。 三代測序技術能夠實時監測DNA 合成的過程，不需要后續測序操作，可以提高測序速度。與二代測序技術相比，三代測序技術在讀取過程中存在較高的錯誤率， 可能需要額外的校正和糾錯步驟，在數據質量較低的情況下，分析和組裝基因組或轉錄組等可能存在一定的困難。 目前三代測序技術可以提供更長的讀長， 有助于研究古生物學中的基因組變化和進化。 適用于涉及基因組結構變異和重復序列的問題， 以及需要更全面的遺傳信息分析的研究領域。

在新冠疫情流行防控中， 三代測序技術對病毒的基因組進行全面、快速的測序分析。這種高通量的測序技術可以大大縮短病毒序列的獲取時間， 從而提供了更及時的疫情監測和溯源能力。 通過對新冠病毒基因組的深入研究， 可以幫助人們更好地了解病毒的傳播特征、變異規律等重要信息，為抗擊疫情提供科學依據。以新冠疫情為例，通過對入境人員的呼吸道樣本進行三代測序， 可以快速準確地檢測出是否感染新冠病毒，并判斷其感染的病毒株。這對于早期發現病毒輸入， 及時采取相應的防控措施具有重要意義，有效遏制疫情傳播。

綜上所述，高通量測序技術因其具有通量高，檢測基因數目多，可以進行全基因組測序；靈敏度高，可檢測低至1%甚至0.01%的突變，還可以一次性檢測多種不同類型的突變等突出優勢， 已逐漸應用到我國各個行業領域，尤其在海關應用，不僅加快通關速度/縮短通關時間， 加深了國門生物安全技術儲備，展現了出入境檢驗檢疫工作的新局面，更有效提升了海關的社會公信力。

1 高通量測序技術在動物檢疫中的應用

動物檢疫是對可以或已證實的疫病對象實行強制隔離，或作出適當處理，目的是防止動物傳染病的傳播，保障畜牧業生產和人民健康[10]，其包括動物疫?。懮退?、病原微生物等。當前動物疫病檢測主要從病理學、血清學和分子生物學等角度出發，一般傳統檢測方法居多[11]，由于樣品信息有限，傳統檢測方法周期較長，或依據經驗，形態特征，電鏡等很難區分非典型性狀。動物疫情發展與變化的多樣性，疫情呈現出預測難度大、爆發突然、傳播速度快、范圍廣等的特點，如何獲取病原信息，真實反映病原樣本數據是各地衛生部門工作的重點。 有最新研究表明生物傳感器較傳統方法，更具有智能化、微型化和功能多樣化等優勢， 但由于生物傳感器在操作過程中容易出現假陽性，檢測率不準等問題，仍然有待進一步提高[12]。目前，高通量測序技術的發展已經十分成熟，水生動物疫病種類多樣，病原體都有其基本的基因特征，結合高通量測序的數據信息分析方法，得到分析結果，對動物疫病的防治起到積極作用[13]。高通量測序綜合其特有的信息量全， 高效準確等特點為動物檢疫工作帶來利用價值， 并通過對原有技術的比較，重點探究了高通量技術的實際應用。

蔣立立[14]研究報告指出，高通量測序技術可以對待測病原微生物的完整基因組進行測序和分析，獲得DNA 序列， 從而快速精準鑒定出未知病原體，揭示其變異和進化規律，為提高通關爭取時間效率，同時提高技術水平， 打造一支高精尖技術團隊；URABAN 等[15]采用宏基因組測序技術對本地微生物群落進行調查，了解病原微生物組成和水體污染情況；張浩博等[16]研究顯示傳統的水生動物疫病鑒定，不能很好的滿足海關的檢測需求， 而高通量測序技術適用于海水魚類生物量評估研究， 被廣泛應用于水生生物的鑒定和多樣性評估； 高通量測序技術不僅在物種多樣性和生物量評估的研究上提供了明確的方向及有力的工具， 而且也更有利于檢疫結果的準確性與可靠性，從而提高檢疫技術水平，加強檢疫工作。當前動物檢疫設備性能不佳，不利于開展動物檢疫工作，難以保障動物檢疫工作結果的真實性。孫濤等[17]研究表明，高通量測序以宏基因組學的數據解析可有效獲知病原信息， 能有效監控復雜病毒樣品并協助尋找傳染溯源的有效手段， 因此高通量測序在動物檢疫中的應用是我們未來研究方向重點。

近幾年高通量測序技術的應用拓展深化了科學研究領域的視野， 高通量測序技術的應用對物種的分類學鑒定，未知物種的鑒定，促進對病原群落中生物多樣性的研究，高通量測序的靈敏性、可操作性方面的優勢不僅會拓寬動物檢疫研究領域的發展，也會加快數據的處理， 為預防動物疫病傳播可行性提供重要方向。

2 高通量測序在植物檢疫中的應用

高通量測序技術在植物病毒學領域的應用開始于2009 年，并已被證明在病毒的發現和檢測方面非常成功，病毒已在大多數植物中被鑒定出來[18]，應用高通量測序技術可快速獲得植物病毒的基因組序列，現已成為檢測植物病毒的主要手段，為植物病毒的防治提供依據[19]。 檢疫性病菌一直是國門生物安全的重點，胡佳續等[20]首次利用高通量測序技術，并結合對大豆中真菌多樣性觀察研究， 為截獲重要病原真菌和評估美國大豆輸華有害生物風險提供重要參考。 高通量測序技術對進境澳大利亞小麥上病原真菌檢測研究分析得到可分類OTU 共622，基于不同分類水平分屬于5 個門，64 個目，201 個屬， 該技術將成為一項常規分析技術， 為檢疫性病原微生物的多樣性研究發揮重要作用[21]。 周密密等[22]研究表明通過高通量測序技術全面篩查進境高粱攜帶的病原真菌種類，能夠檢測出多種高粱病原真菌，快速篩查高粱病原真菌提供技術指導， 為口岸風險評估技術支持。

為防止植物危險性病、蟲、雜草等有害生物由國外傳入和國內傳播蔓延，維護對內、對外貿易信譽，履行國際間或國內地區間的義務， 同時對維持生態系統平衡和生物多樣性起到重要作用。 經濟社會的發展必然伴隨著國際間頻繁的農業交流， 如種子和苗木調運，水果蔬菜貿易等，一些新的或者外來入侵物種、植物病毒等傳入我國的風險加大。高通量測序技術主要進行測序分析， 并且可在一天內得到病毒的樣品信息，加快病蟲害防治，不僅可以豐富植物病毒公共數據庫資源， 而且為植物檢疫病毒的積累提供支持[19]。

王雪蔚等[23]研究表明外來病原生物的入侵是全球經濟一體化后我國所面臨的主要生物風險之一。由于傳統的形態學檢測高度依賴研究人員經驗積累，已不能滿足當下社會快速發展的需求， 貿易量不斷加大， 我們需求的是能快速準確有效的鑒定出有害生物或病毒，為守護國門提供保障。其中松材線蟲屬于我國重大外來入侵種并造成嚴重的經濟和生態損失，已被我國列入對內、對外的森林植物檢疫對象。不同于傳統的形態學鑒定，對常規物種描述的評估，高通量測序克服形態學鑒定和經驗的限制， 已快速被應用于松材線蟲的研究[24]，越來越多的松材線蟲的信息被報道， 高通量測序加深了我們對松材線蟲的理解。 丁曉磊等[25]研究表明高通連測序技術對松材線蟲關鍵致病基因的研究，為松材線蟲的分子生物學研究提供了重要的基礎數據，為疫病的防治提供了方向。 應用高通量測序技術篩查進口植物攜帶的檢疫性病毒，不僅能快速鑒定出已知病毒，對于樣品中攜帶的多個或未知病毒也能一次性鑒定出，有效避免一些病毒的漏檢或錯檢，降低病毒傳入的風險，能精準有效防控外來植物病毒的傳入，保護國門生物安全[26]。植物檢疫檢測的種類繁多， 高通量測序技術的不斷完善，有助于建立有效的防疫機制，提高預警能力。

高通量測序能以相對較低的成本在短時間內完成樣品中所有物種轉錄組或基因組的測定， 該技術被廣泛的應用到植物病毒的診斷中，但檢疫性病毒、松材線蟲及真菌的分類學研究等方面涉及較少仍有待進一步分析[27]。

3 高通量測序在衛生檢疫中的應用

在衛生檢疫領域中， 高通量測序可以用于檢測和監測病原體，包括病毒、細菌、真菌和寄生蟲等。通過測序病原體的基因組， 可以準確地鑒定病原體的種類、亞型和變異情況，有助于及時發現新型病毒或傳播途徑，提供有效的指導和決策依據。 此外，高通量測序還可以對病原體的耐藥性進行分析， 幫助選擇合適的治療方案。 還可以應用于傳染病的流行病學調查和溯源研究。 通過測定感染者和潛在傳播者的基因組序列，可以追蹤病原體的傳播路徑和來源，為防控措施的制定和實施提供科學依據。近年來，高通量測序還可以用于快速篩查和檢測入境動植物及其產品中的有害生物。通過對基因組的測序和比對，可以準確鑒定是否存在具有經濟、 生態或健康風險的病原體和有害生物。綜上所述，高通量測序在衛生檢疫中的應用為疫情監測、 傳播控制和衛生安全提供了重要的技術支持， 有助于提高對疾病的早期預警和快速響應能力。

4 高通量測序在食品微生物檢疫中的應用

食品安全問題一直是影響我國人民的生命安全和社會穩定的重要因素，因此，進出口食品的檢疫工作對我國食品安全有著十分重要的意義， 能夠規范我國進口食品行業的發展， 對整個食品檢疫工作具有重要意義[28]。食品微生物與人類生活息息相關，由病原體引起各種傳染病明顯危害到人類健康。 我國食品微生物檢疫研究與國際先進水平還存在著明顯差距， 食品微生物檢疫作為海關進出口中一項重要的食品安全保障技術， 對推動食品產業健康發展具有重要意義[29]。近年來，實現對未知病原微生物的快速準確檢測是重大疫情疾控和日常生物安全監督的基本要求， 傳統的病原微生物檢測一般有顯色培養基、ATP 生物發光檢測及免疫層析等方法，基于在培養基上有不明顯的特征， 采用傳統方法很難完全準確鑒定微生物， 這時高通量測序就體現出獨特的優勢[30-31]。 傳統的培養技術只能檢測到食品中的優勢菌群，但并不能全面的分析菌群群落。高通量測序對食品微生物發酵過程和機制研究主要體現在微生物生理功能、代謝能力和進化。吳林寰等[32]總結了高通量測序技術對基因組合元基因組測序研究及對微生物的發展趨勢。一般采用形態學觀察，細胞生理生化特征，細胞培養等方法。高通量測序的出現，無需在實驗室培養即可全面分析食品微生物；利用16S rRNA基因的高通量測序及傳統的微生物學方法來評估細菌多樣性， 其次高通量測序直接從食品中提取微生物基因組，并進行基因測序[33]。高通量測序具備傳統微生物檢測所不具備的優勢， 在食品微生物中的檢測重要性日益凸顯。 楊光萍研究表明高通量測序食品微生物多利用16S rDNA/rRNA，其在微生物菌屬的基因結構、功能上高度保守，同時具有長度適中、拷貝量大、易擴增等優點[34-35]。 李桂瀾等[36]研究表明16S rDNA/rRNA 高通量測序仍然是用于鑒定食品微生物菌群最常用的技術，與Rajendhran 等[37]研究基本保持一致，但基于技術的優勢于缺陷，通常結合傳統檢測技術手段聯合分析病原微生物。 米其利等[38]的研究表明，高通量測序能準確、快速得到微生物中有效信息，極大的縮短了分析時間，并減少傳統檢測結果的不準確性，在食品微生物多樣性，病原菌特征等方面發揮重要作用，且在后期基于數據的研究，更加簡便，大大優化傳統檢測方法。

5 總結與展望

高通量測序作為一種快速、高效、準確的基因測序技術，具備快速、準確、高通量的特點。對潛在的疾病源進行有效檢測， 幫助海關篩查和控制潛在的危害；對植物病原微生物、昆蟲害蟲等進行基因序列分析，實現快速鑒定和分類，提高檢疫效率；對食品中的微生物、 源自轉基因植物的DNA 等進行準確檢測，幫助海關加強對進出口食品的檢測和監管；高通量測序技術對病毒、細菌等微生物進行基因組分析，幫助海關識別和追蹤疫情的來源和傳播路徑， 以及設計有效的防控措施； 通過對食品中的基因序列進行分析， 可以及時發現食品中存在的可能對人體健康有害的成分，提高食品安全水平。

高通量測序豐富了檢測方法， 為海關明確和分析致病原展現了新途徑， 開拓了新型測序技術在海關檢驗檢疫業務的應用場景， 逐步完善病原菌的基因組數據庫， 進一步開發高通測序大數據的智能應用，能更好服務海關保國門、促發展的主要職能。