阿司匹林抑制胃癌干細胞的機制研究*

王子昂,馬洪杰,王騰飛,武 倩,周 紅,寧志豐,沈 昕,吳 喆,

(1.湖北科技學院醫學部臨床醫學院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學院醫學部公共衛生及健康學院;3.湖北科技學院醫學部基礎醫學院;4.湖北科技學院醫學部口腔與眼視光學院)

胃癌(gastric cancer,GC)是全球常見的惡性腫瘤疾病,據國際癌癥研究機構報告的全球癌癥患病現狀調查顯示,2012年中國GC發病數占全球GC發病數的42.6%,其死亡率45.0%居第六位[1]。近年來研究表明[2-3],非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)可以有效干預腫瘤細胞信號轉導、誘導腫瘤細胞凋亡,對胃癌具有潛在的預防和治療效果。阿司匹林是非甾體抗炎藥的代表性藥物,幾十年來臨床上廣泛用于治療風濕和類風濕、心血管等疾病。阿司匹林有抗腫瘤增殖和誘導腫瘤細胞凋亡的作用[4],長期服用阿司匹林可以顯著降低胃癌的死亡率[5]。本研究以人胃癌細胞株SGC7901為研究對象,探討阿司匹林對胃癌干細胞有無抑制作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人胃癌細胞株SGC7901購自中國典型培養物保藏中心,RPMI1640培養基、DMEM/F12培養基、胎牛血清購自Gibco公司,雙抗購買自碧云天生物技術公司,Transwell小室購買自Costar公司,低黏附6孔板以及96孔板購自Corning公司,Matrigel基質膠購買自BD公司。人表皮生長因子EGF、人堿性成纖維細胞生長因子bFGF、神經生長因子B27、阿司匹林(批號:A2093)、MTT(批號:M2128)、二甲基亞砜(DMSO)(批號:472301)購自SIGMA公司。天逸510S-07ICB型酶標儀購自美國Bio-Tek公司、BCA蛋白定量檢測試劑盒(批號:KGPBCA)、蛋白提取試劑盒(批號:KGP1050)和SDS-PAGE凝膠試劑盒(批號:KGP113K)均購自南京凱基生物。EPS600型電泳儀購自美國Bio-Rad公司,TH4-200型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。其他試劑為生化分析純。

A.不同濃度阿司匹林對胃癌SGC7901細胞48h增殖的影響;B.不同時間段阿司匹林(0.4mmol/L)對胃癌SGC7901細胞增殖影響(與空白對照相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)。

A.不同濃度的阿司匹林對胃癌SGC7901細胞的克隆形成圖;B.不同濃度阿司匹林對胃癌SGC7901細胞的克隆數統計圖(與空白對照組比較,**P<0.01,n=3)。

A.不同濃度的阿司匹林對胃癌SGC7901細胞縱向遷移情況與縱向遷移能力統計圖;B.不同濃度的阿司匹林對胃癌SGC7901細胞侵襲能力與侵襲能力統計圖(與空白對照組比,***P<0.001,n=3)。

A.經不同濃度阿司匹林干預24h后相關蛋白的表達情況;B.E2F1灰度值統計結果;C.Sox2灰度值統計結果(與對照組比較,***P<0.001,n=3)。

1.2 實驗方法

將胃癌細胞株SGC7901細胞在普通完全培養基(10%的FBS、90% RPMI-1640、1%的青霉素鏈霉素雙抗)于37℃、5% CO2培養箱內培養,待培養約48h后換液1次;待貼壁細胞鋪滿培養瓶約80%時,以0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化,將細胞吹打分離,離心重懸后以1∶2比例進行傳代。

1.2.2 阿司匹林藥物濃度的配制

稱取1800mg阿司匹林溶于2.5mL DMSO,制成4mol/L的阿司匹林原液,按照實驗要求用培養基稀釋成實驗所需的濃度梯度:0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mmol/L。

1.2.3 微球體的培養

取處于對數生長期的SGC7901細胞,用PBS洗掉殘留的血清。用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化,1000轉5min離心、計數、懸浮培養基重懸、取10 000個細胞接種于Poly-hema包被的25cm的2個培養瓶中,放于37℃、5% CO2、恒溫恒濕的細胞培養箱內培養,24h后加入懸浮培養基2mL。懸浮培養基的組成為:無血清DMEM/F12(1∶1)中添加20ng/mL EGF、10ng/mL bFGF、2% B27,2d半左右培養液顏色變為微黃時半量換液。取生長至10d左右的微球體開展后續試驗。

1.2.4 MTT法

取懸浮培養的微球體,離心,經胰酶消化吹打成單細胞,細胞計數,放入普通培養基重懸,調整細胞密度至1×106/mL。將微球體細胞接種于96孔板中,培養24h,將96孔板中的原培養液棄去,用PBS洗兩遍,每個濃度設3個復孔,邊緣孔用無菌PBS充填即(空白對照)和只加入普通完全培養基不加藥(調零孔)以及(實驗組)即各孔以0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mmol/L阿司匹林填充,定容至200μL,放于培養箱中培養,在終止培養前4h,每孔加入20μL MTT,3～4h后,小心吸去原培養液,每孔加入150μL DMSO,37℃溫箱孵育10min,隨后用酶標儀檢測490nm處各孔的吸光度(A)值。藥物抑制率為(1-實驗組OD/對照組OD)×100%。

1.2.5 平板克隆形成實驗

第四，加強水利財務工作，是深化水利重點領域改革、創新水利科學發展體制機制的迫切需要。改革創新是水利事業發展的引擎和動力。當前，水利改革已經進入攻堅階段，深層次矛盾日益顯現，推進難度不斷加大。必須從水利改革發展全局出發，抓住重點，突破難點，力求在建立水利投入穩定增長機制、推進水價綜合改革上取得新進展，同時，積極協調落實好現有政策，著力穩定管理經費渠道和規模，為水資源管理、水利工程管理、基層水利服務體系建設等提供強有力的資金保障。

取處于懸浮培養的微球體,胰酶消化后,離心重懸,細胞計數,加入6孔板中,每孔約接種1000個微球體細胞,隔天換液,加入阿司匹林濃度梯度為0、0.2、0.8mmol/L的完全培養基,每個濃度設3個復孔,3～4d換液一次,10～14d鏡下觀察,克隆形成后終止培養,將原培養液棄去,PBS洗2遍,1mL甲醇室溫固定30min,每孔1mL 0.1%結晶紫染色30min,細流水沖洗,干燥后拍照,計算陽性克隆數?？寺÷蕿榭寺?接種細胞數×100%。

1.2.6 Transwell小室侵襲實驗

將保存于-20℃的matrgel基質膠預先4℃環境下解凍,成液態后與無血清培養基按1∶5的比例混勻,每小室加入100μL放于37℃、5% CO2培養箱,3～4h后至其完全凝固備用,使用前用無血清培養基潤濕。取微球體,胰酶消化、離心、吹打其至均勻,用無血清培養基將其重懸、計數,每小室接種20 000個微球體細胞,加入阿司匹林(濃度為0、0.2、0.8mmol/L),下室加入500μL含20%FBS的普通培養基,每一濃度梯度設3個復孔。24h后在37℃、5% CO2培養箱內取出小室,PBS洗3遍,每孔加入4℃預冷的甲醇固定30min,用0.1%結晶紫染色,吸出結晶紫并用超純水清洗2遍,室溫風干,拍照。每小室取3個角度進行拍攝,計數。

1.2.7 Transwell小室遷移實驗

收集懸浮培養的微球體細胞,胰酶消化,離心,將其吹打均勻,計數,無血清培養基重懸,每一小室加入20 000個細胞,阿司匹林濃度梯度為0、0.2、0.4、0.8mmol/L,且上室每孔最終總體積為200μL,設3個復孔,放置細胞孵箱培養17h取出小室,PBS洗兩遍,用0.1%結晶紫染色20min,清洗風干,于鏡下觀察記錄膜背面遷移的細胞數,每小室取3個角度進行拍攝計數。

1.2.8 Western blot法檢測Sox2和E2F1的蛋白表達情況

RIPA強裂解液提取微球體細胞總蛋白。BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度,以每孔15μg蛋白量上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳。將凝膠中蛋白轉移到PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2h,PBS-T將兔抗人E2F1單克隆抗體(1∶1000,Abclonal,產品編號:A19579)、兔抗人Sox2單克隆抗體(1∶1000,Abclonal,產品編號:A19118)進行稀釋,4℃孵育PVDF膜過夜,次日PBS-T洗膜,用抗體稀釋液(碧云天)稀釋相應的HRP標記二抗(1∶10 000),37℃搖床孵育1h。用TBST充分洗滌PVDF膜4～5次,每次5min,滴加ECL工作液于PVDF膜上,充分反應數分鐘待熒光條帶明顯后,沖洗膠片,顯影。重復實驗3次。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0統計軟件進行分析,計量資料以卡方檢驗表示,多組間比較采用單因素方差分析,檢驗水準α=0.05(雙側),當P<0.05則認為具有統計學差異。

2 結 果

2.1 阿司匹林抑制了胃癌SGC7901微球體細胞的增殖

阿司匹林作用48h后對人胃癌細胞株SGC7901的增殖具有抑制作用,其抑制程度隨阿司匹林濃度的增加而增強,呈現劑量依賴性(圖1A)。隨著時間的推移,0.4mmol/L阿司匹林呈時間依賴性抑制人胃癌細胞株SGC7901的增殖(圖1B)。

2.2 阿司匹林抑制了胃癌SGC7901微球體細胞的克隆形成能力

與一定濃度梯度的阿司匹林(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mmol/L)孵育后,抑制了SGC7901微球體細胞的克隆形成能力呈劑量依賴性(P=0.0035),如圖2。

2.3 阿司匹林抑制了胃癌SGC7901微球體細胞的遷移和侵襲能力

我們發現,與一定濃度梯度的阿司匹林(0、0.2、0.8mmol/L)孵育后,抑制了SGC7901微球體細胞的縱向遷移和侵襲能力,呈濃度依賴性(P均<0.001)。如圖3。

2.4 阿司匹林抑制了胃癌SGC7901微球體細胞E2F1和Sox2的蛋白表達

為了驗證阿司匹林對E2F1和Sox2蛋白表達的影響,我們從經阿司匹林孵育后的微球體中提取總蛋白,實施了western blot,發現阿司匹林劑量依賴性(0、0.2、0.8mmol/L)下調了胃癌SGC7901微球體細胞E2F1和Sox2的蛋白表達,說明阿司匹林通過下調干性相關基因抑制了胃癌干細胞(P<0.001),如圖4。

3 討 論

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一,也是導致惡性腫瘤患者死亡的第三大原因[6]。據資料顯示[7],胃癌的發生、發展、轉移、擴散與胃癌干細胞有較為密切的關系,而干細胞是一類具有自我更新和增殖分化能力的細胞。Okumura等[8]研究表明,在人胃癌細胞株中存在具有干細胞特性的胃癌細胞,且這些細胞在體外無血清培養基中培養,可形成球形的細胞集落,該集落具有干細胞樣特性。阿司匹林即NSAIDs類藥物,具有解熱、鎮痛、抗炎、抗血栓等藥理作用。阿司匹林作為老藥新用的代表,是應用最為廣泛的藥物之一。近年來,根據流行病學調查顯示[9],常規服用非甾體抗炎藥(NSAIDS)可降低結腸癌發病風險。即非甾體抗炎藥對胃腸道類的腫瘤疾病具有潛在的防治效果。Moon等[10]研究表明,阿司匹林可通過抑制Cox-2/PTGS2信號通路,激活體內r受體(r-PPAR)的表達,改善抗腫瘤藥物的耐藥性,對結腸癌干細胞的自我更新起抑制作用。Sox2基因是最基本的干細胞基因之一,其編碼的Sox2蛋白具有維系胚胎干細胞的重要作用以及調節細胞自我更新能力[11]。E2F1即腫瘤相關因子,轉錄因子E2F1是E2F家族重要成員之一,它為細胞周期的重要調控因子,可使G1期向S期轉變[12]。有資料表明[13],E2F1基因在胃部組織中的表達可能與胃癌的發生、發展有關,但其蛋白表達與各類臨床病理變化間不存在必要聯系[14]。本實驗通過采用人胃癌細胞株SGC7901在僅含上皮生長因子(EGF)和基本成纖維細胞生長因子(bFGF)的無血清培養基中培養為具有胃癌干細胞特性的微球體,探討不同濃度阿司匹林對人胃癌細胞株SGC7901微球體的細胞侵襲及遷移的影響。結果表明,高濃度阿司匹林對腫瘤細胞遷移和侵襲具有抑制作用,且呈劑量相關性?？瞻捉M與對照組相比,人胃癌細胞株SGC7901細胞微球體采用阿司匹林作用后,E2F1和Sox2蛋白的表達量均有下降,并且E2F1和Sox2基因均作為腫瘤組織中促腫瘤組織發生、增長的一小部分。由此,可以將E2F1和Sox2蛋白作為胃癌治療中的靶點。