金剛藤多糖的微波輔助提取及體外抗氧化、降血糖活性分析*

汪文麗,曲曉營,朱曉明,劉小玲

(1.湖北科技學院醫學部藥學院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學院核技術與化學生物學院;3.輻射化學與功能材料湖北省重點實驗室)

金剛藤,別名菝葜,廣泛分布于陜西、湖北、四川等多個省份。多糖是其主要成分之一,被證實具有抗氧化、抗炎等作用,目前,主要以熱水提取法進行提取,該方法具有簡單、安全等優點,但也存在提取率低,耗時長的缺點[1-2]。微波輔助提取法可以加速植物細胞的破裂,更有利于成分的溶出。微波輔助提取法已廣泛應用于皂苷[3]、酚類[4]等多種天然小分子物質的提取,也應用于多糖等大分子物質的提取[5-6]。有學者[7-8]證實微波法提取的木棉花多糖和喜樹多糖具有較強的抗氧化、抑菌、抗腫瘤、免疫調節等活性。我們對金剛藤多糖的微波輔助提取工藝進行優化,分析其結構和體外抗氧化、降血糖活性,并與傳統的熱水法進行對比,以促進金剛藤多糖提取工藝技術的進步。

1 材料與方法

1.1 試驗原料、試劑及儀器

切片狀金剛藤(湖北咸寧);2,2-聯苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、抗壞血酸、α-葡萄糖苷酶(33U/mg)、阿卡波糖(含量≥98%)、PANG(阿拉丁試劑有限公司);DNS(索萊寶科技有限公司);無水乙醇、三氯乙酸、硫酸、苯酚、葡萄糖(國藥集團化學試劑有限公司);溴化鉀(阿拉丁試劑有限公司);剛果紅(永華化學股份有限公司)。

KWF-300分級超細連續式粉碎機粉碎(溫州頂歷醫療器械有限公司);MKJ-J1-8型微波實驗爐(青島邁可威微波應用技術有限公司);DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、RF-2000A旋轉蒸發儀(鞏義市予華儀器有限責任公司);TDL-5A臺式低速離心機(常州崢嶸儀器有限公司);UV-1901型紫外可見分光光度計(上海奧析科學儀器有限公司);Specrtum Two FT-IR光譜儀(英國PerkinElmer公司)。

1.2 方法

1.2.1 金剛藤藥材的預處理

將切片狀的金剛藤于50℃烘干,約48h,粉碎,過80目篩,得到金剛藤原粉。將80%乙醇(mL)和金剛藤原粉(g)按照5∶1的比例混合,80℃回流3h,過濾,將濾渣用80%的乙醇洗滌3遍,50℃烘干,得到脫除脂類、色素和小分子物質的金剛藤,簡稱脫脂金剛藤。

1.2.2 金剛藤多糖的熱水提取方法

(1)粗多糖的提取。稱取一定量的脫脂金剛藤,按水料比12∶1(mL/g)混合,80℃熱水提取2h。3800r/min離心10min,取上清液,50℃旋轉蒸發,濃縮,加入4倍體積的無水乙醇,4℃靜置12h。3800r/min離心5min,沉淀部分于50℃烘干,即為粗多糖。按公式①計算粗多糖得率。

①

(2)粗多糖除蛋白。取一定量的粗多糖用蒸餾水溶解,與5%的三氯乙酸等體積混合,振蕩,于4℃冰箱中靜置14h。3800r/min離心5min,取上清液,同1.2.2(1)的方法濃縮、醇沉、烘干,得除蛋白的多糖,即熱水提取的金剛藤多糖(SCP-W)。

1.2.3 金剛藤多糖的微波輔助提取方法

稱取一定量的脫脂金剛藤,按實驗設定的微波功率、水料比、時間和溫度提取粗多糖。同1.2.2(1)中公式的方法計算粗多糖得率,同1.2.2(2)的方法除蛋白,得微波輔助提取的金剛藤多糖(SCP-M)。

1.2.4 單因素試驗

(1)水料比對粗多糖及多糖得率的影響。按不同的水料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL/g)加入原料,設置溫度80℃,微波功率480W,提取時間18min,計算金剛藤粗多糖及多糖得率。

(2)微波功率對粗多糖及多糖得率的影響。按水料比30∶1(mL/g)加入原料,設置溫度80℃,不同的微波功率(320、440、560、680、800W),提取時間18min,計算金剛藤粗多糖及多糖得率。

(3)溫度對粗多糖及多糖得率的影響。按水料比30∶1(mL/g)加入原料,設置不同的溫度(60、70、80、90、100℃),微波功率440W,提取時間18min,計算金剛藤粗多糖及多糖得率。

(4)時間對粗多糖及多糖得率的影響。按水料比30∶1(mL/g)加入原料,設置溫度80℃、微波功率440W,不同的提取時間(9、18、27、36、45min),計算金剛藤粗多糖及多糖得率。

1.2.5 正交試驗

根據單因素試驗結果,以微波功率(W)、水料比(mL/g)、溫度(℃)和時間(min)為研究對象,以金剛藤粗多糖和多糖得率為評價指標,設計四因素三水平正交試驗,確定金剛藤粗多糖及多糖的最佳提取條件。

1.2.6 微波、熱水提取多糖的含量測定

分別稱取等量熱水和微波提取的粗多糖,加蒸餾水溶解,配成0.5mg/mL的溶液,去除不溶物質。取100μL,加蒸餾水至1mL,加入6%苯酚0.5mL、濃硫酸2.5mL,在485nm處測定吸光度值,按公式②計算單位重量粗多糖提取物中的總糖含量。參考余麗梅等[9]的方法測定還原糖含量。根據公式③測定多糖得率。

②

多糖得率(%)=CP×(TS-RS)

③

式②中:c表示根據吸光度值計算的溶液質量濃度,mg/mL;D表示溶液稀釋倍數;V表示樣品溶液體積,mL;m表示粗多糖取樣量,mg。

式③中:CP表示粗多糖得率(%);TS表示總糖含量(%);RS表示還原糖含量(%)。

1.3 結構分析

1.3.1 傅里葉紅外光譜表征

分別取少量熱水和微波提取的金剛藤多糖,按照與溴化鉀1∶100(g/g)的比例混合,研磨、壓片,在4000cm-1～400cm-1進行紅外光譜掃描分析。

1.3.2 三螺旋結構表征

分別取熱水和微波提取的金剛藤多糖,配成1mg/mL的溶液,測定混合溶液隨NaOH溶液濃度的增加,樣品最大吸收波長的變化[10]。

1.4 體外抗氧化活性試驗

1.4.1 DPPH自由基清除實驗

分別取熱水和微波提取的金剛藤多糖,配成0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL的溶液,參考Hu等[8]的方法,測定樣品溶液對DPPH自由基的清除率。

1.4.2 ABTS自由基清除實驗

同1.4.1的方法配制金剛藤多糖溶液,參考胡玲玲等[11]的方法,測定樣品溶液對ABTS自由基的清除率。

1.5 體外降血糖活性試驗

同1.4.1的方法配制金剛藤多糖溶液,參考王春霞[12]的方法,測定樣品溶液對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.6 統計學方法

各組試驗均重復3次,通過Origin 2021軟件繪制紅外光譜圖,通過WPS Office表格繪制折線圖并分析數據,結果以(均數±標準差)表示。

2 結 果

2.1 單因素試驗

2.1.1 微波功率對金剛藤粗多糖及多糖得率的影響

微波可以促進植物細胞壁的破碎,使其溶出增加。由圖1可知,微波功率對金剛藤粗多糖及多糖得率的影響趨勢基本一致。隨功率的增加,粗多糖及多糖得率均增加,當功率達到560W時,粗多糖、多糖的得率最大,當功率繼續增大時,兩者均有下降趨勢,可能與過大的功率會使有效成分降解有關。因此,選擇微波功率440、560、680W作為正交試驗設計的因素水平。

圖1 微波功率對粗多糖及多糖得率的影響

2.1.2 水料比對金剛藤粗多糖及多糖得率的影響

由圖2可知,金剛藤粗多糖及多糖得率隨水料比的變化較為一致,當水料比從10mL/g增加到30mL/g時,粗多糖及多糖得率迅速增加,但水料比超過30mL/g時,粗多糖及多糖得率開始下降。因此,提取溶劑不宜過多,選擇水料比20、30、40mL/g作為正交試驗設計的因素水平。

圖2 水料比對粗多糖及多糖得率的影響

2.1.3 溫度對金剛藤粗多糖及多糖得率的影響

由圖3可以看出,在試驗溫度范圍內,粗多糖及多糖得率隨反應體系溫度的升高而增加。溫度在70℃～80℃時,兩者的增加幅度最大,且粗多糖的增加更明顯,80℃以后兩者的增加幅度趨于平緩。因此選取80、90、100℃進行正交試驗。

圖3 溫度對金剛藤粗多糖及多糖得率的影響

2.1.4 微波時間對金剛藤粗多糖及多糖得率的影響

由圖4可知,金剛藤粗多糖及多糖的得率隨提取時間的延長而增加,36min時達到最大,繼續延長提取時間,兩者的得率均下降,且提取時間對多糖得率的影響更為明顯。選擇微波時間為27、36、45min作為正交試驗設計的因素水平。

圖4 時間對金剛藤粗多糖及多糖得率的影響

2.2 正交試驗

正交試驗設計及結果如表1所示。各因素對粗多糖得率影響的主次順序為溫度>時間>水料比>微波功率,對多糖得率影響的主次順序為溫度>時間>微波功率>水料比,即微波處理對粗多糖和多糖得率的影響并不一致。最佳提取工藝組合均為A3B1C3D2,即微波功率680W,水料比20∶1,溫度100℃,時間36min。該條件下金剛藤粗多糖和多糖的得率最高,與正交試驗表中的結果相符合。由表2可知,微波功率、水料比、溫度和時間對粗多糖及多糖得率的影響均達到極顯著水平(P<0.01)。

表1 正交試驗設計及結果

表2 正交試驗方差分析結果

2.3 微波、熱水提取多糖的含量測定

經測定,樣品質量濃度與吸光度值之間的關系函數為:y=15.52x-0.1209,R2=0.9978。如表3所示,微波輔助提取的金剛藤粗多糖、多糖得率分別是熱水提取粗多糖、多糖得率的1.48倍和1.36倍,但提取時間從120min縮短為36min,熱水提取粗多糖的糖含量更高。

表3 微波、熱水提取多糖的含量

2.4 多糖的結構測定

2.4.1 傅里葉紅外光譜結構測定

由圖5可以看出,熱水、微波提取的多糖SCP-W和SCP-M在紅外光譜結構上并沒有明顯的區別。3430cm-1、2930cm-1、1640cm-1附近是O-H、C-H、C=O的伸縮振動峰,是糖類的三個特征吸收峰,1157cm-1、1085cm-1和1015cm-1為吡喃糖環的特征吸收峰,854cm-1處的吸收峰說明具有α-型糖苷鍵。推測金剛藤多糖為α型吡喃糖,微波提取沒有對金剛藤多糖的初級結構造成影響。

圖5 SCP-M和SCP-W的紅外光譜圖

2.4.2 三螺旋結構測定

由圖6可知,在NaOH溶液濃度從0到0.5mol/L逐漸增加時,陰性對照蒸餾水和熱水提取的金剛藤多糖與剛果紅形成絡合物的λmax逐漸下降,而微波提取的金剛藤多糖與剛果紅形成絡合物的λmax先增加后下降。說明熱水提取的金剛藤多糖沒有三螺旋結構,但微波提取的金剛藤多糖具有三螺旋結構。推測微波可能會促進多糖高級結構的改變或者增加三螺旋結構多糖的溶出。

圖6 SCP-M和SCP-W的三螺旋結構測定結果

2.5 金剛藤多糖的體外抗氧化活性活性測定

由圖7a可知,SCP-M、SCP-W對DPPH自由基的清除率隨多糖溶液濃度的增加,呈先增加后降低的趨勢,在1.5mg/mL時分別為50.48%、57.47%,而在多糖濃度超過1.5mg/mL時測量DPPH自由基清除率,反應液變渾濁,有部分白色析出物,清除率降低。由圖7b可知,SCP-M、SCP-W對ABTS自由基的清除率隨多糖溶液濃度的增加而增加,且增加趨勢先快后慢,在1.5mg/mL時分別達到87.52%、93.39%,之后趨于平穩,接近陽性對照Vc對ABTS自由基的清除率。

圖7 SCP-M和SCP-W的體外抗氧化活性

2.6 體外降血糖活性

由圖8可知,SCP-M、SCP-W對α-葡萄糖苷酶均具有較高的抑制作用,在1.5mg/mL時分別達到77.85%、86.48%,且隨多糖溶液濃度的增加,抑制率亦呈逐漸增加的趨勢,之后趨于平穩。SCP-M的抑制效果略低于SCP-W,且都低于陽性對照組阿卡波糖。即兩種方式提取的多糖均有明顯的體外降血糖功效,SCP-M的降血糖活性略低。

圖8 SCP-M和SCP-W對α-葡萄糖苷酶抑制率測定

3 討 論

多糖作為一種具有多種生物活性的高分子化合物,近年來受到了廣泛關注。本研究采用正交試驗考察了金剛藤多糖的微波輔助提取工藝。通過對粗多糖及多糖得率的對比分析,進一步了解了微波提取多糖的作用機制。微波處理的溫度、時間、水料比、微波功率對粗多糖及多糖得率均有極顯著的影響,且影響的主次順序存在差異。隨水料比的增加,溶劑與原料的反應更加充分,使多糖溶出增加,但過多的溶劑會吸收部分微波能量,使得作用于實際反應體系的能量相對降低,因而兩者的得率呈現出先增加后減少的趨勢,且過多的溶劑會增加后期濃縮的困難[11]。提取溫度達到80℃時,微波釋放的能量達到了裂解植物細胞壁所需的能量,對植物細胞壁的破壞作用越明顯,多糖的溶出越多,但高溫對多糖以外其他雜質溶出的效果可能更好,使得粗多糖的增加高于多糖的增加;提取時間過長時,提取液黏度增大,多糖溶出速度減慢,但部分已溶出的多糖發生了降解,且有其他水溶性雜質的溶出,導致多糖的相對得率降低[12]。Han等[5]、黃群惠等[13]的研究表明,長時間的微波處理會破壞糖鏈的網絡結構,導致多糖抗氧化活性的下降。因此,微波提取時間不宜過長。最終選擇,在微波功率680W,水料比20∶1(mL/g),溫度100℃,提取時間36min時,粗多糖得率為(14.63±0.05)%,多糖得率為(8.11±0.19)%,分別是熱水提取法的1.48倍和1.36倍,提取時間縮短了70%,具有得率高、耗時短的優點,證實了微波輔助提取工藝的優勢。在本實驗中,相較于熱水提取的粗多糖,微波提取的粗多糖顏色較深,但因前期預實驗發現除蛋白過程會影響多糖的生物活性,使后續活性探討實驗增加了變量,因此,控制兩種粗多糖的除蛋白方法一致,計算微波輔助法提取多糖的糖含量略低,與Zhao等[14]的研究結果一致。

多糖的三螺旋結構分析表明,微波輔助提取的金剛藤多糖具有三螺旋結構,可能會在抗腫瘤等特定的生物活性方面具有一定的研究價值[15],目前尚未檢索到微波處理與多糖三螺旋結構之間相關性的研究報道,其機理還有待探討。

本實驗中,SCP-M、SCP-W對DPPH和ABTS自由基在0.2～2.5mg/mL的濃度范圍內,均有清除作用,且都低于陽性對照組Vc。同一濃度的兩種多糖對ABTS自由基的清除效果均大于對DPPH自由基的清除效果,SCP-M對DPPH、ABTS自由基的清除效果略低于SCP-W。因此,微波提取的金剛藤多糖具有較好的抗氧化活性,略低于熱水提取多糖的抗氧化活性?？赡芘c其純度有關,也可能與微波處理的效果過于劇烈[16],破壞了部分多糖的活性結構。楊梅酒渣多糖在0～10mg/mL范圍內對ABTS和DPPH自由基的清除率呈濃度依賴式增加[17]?？赡芘c金剛藤多糖的相對分子質量大于楊梅酒渣多糖,較高濃度的金剛藤大分子多糖在含乙醇的DPPH反應液中易于析出有關,所得試驗結果低于實際數值。

綜上所述,微波輔助提取工藝可應用于金剛藤多糖的提取,具有得率高、耗時短、生物活性顯著的優點。研究可為多糖及金剛藤產業的發展提供參考。但對于微波輔助提取多糖的復雜結構分析及提取過程中各因素變化對多糖生物活性的影響沒有做深入的探討,還需要進一步的研究。