凈化柱結合超高效液相色譜—串聯質譜檢測動物源性食品中16種喹諾酮藥物

余婷婷 梁 松 黃文慧 何 潔,2 嚴義勇

(1. 深圳市易瑞生物技術股份有限公司,廣東 深圳 518101;2. 深圳職業技術學院集成電路關鍵材料研究院,廣東 深圳 518055)

喹諾酮藥物因其成本低、抗菌譜廣、見效快等特點[1-2],在畜禽養殖過程中常被“超劑量”使用,導致動物源性食品內藥物殘留。此外,因其代謝緩慢,會隨食用動物源性食品的攝入在人體內蓄積,具有潛在的致癌風險。目前,喹諾酮藥物檢測的方法主要有薄層色譜法[3]、微生物法[4]、酶聯免疫吸附法[5]、高效液相色譜法[6]、高效液相色譜—串聯質譜法[7]等。薄層色譜法用于定性分析[8]、微生物法和酶聯免疫法因其檢測藥物種類單一導致應用受限[9]。利用高效液相色譜法對喹諾酮藥物進行定性和定量分析,其原理是通過保留時間對物質進行定性,其色譜出峰受雜質干擾較大,會出現雜質與目標化合物保留時間重疊的情況導致結果出現假陽性,此外,該方法對樣品中藥物殘留的提取方式要求較高,無法實現痕量檢測[10]。液相色譜-串聯質譜法是根據質荷比對每個化合物進行獨立檢測,分離能力較高、靈敏度高、可實現痕量分析,是目前認可度高的定性定量檢測方法,但依然會受雜質干擾[11]。

喹諾酮藥物的樣品前處理凈化方法主要有分子印跡固相萃取[12]、固相萃取[13]、固相微萃取[14]、磁性固相萃取[15]、分散固相萃取[16]、分散液液微萃取[17]、液液微萃取[18]、液液萃取[19]、攪拌棒吸附萃取[20]等。目前使用較為廣泛的前處理方式是固相萃取柱,使用時需要對小柱進行填料活化、吸附上樣、雜質淋洗、目標洗脫等過程,該方法耗時長,試劑需求量較大。目前使用凈化柱對動物源性食品進行凈化的研究較少。因此,研究擬采用濾過型凈化柱作為前處理凈化材料,無需經過上述繁雜步驟,減少溶劑使用量,也可避免由于基質復雜而導致的篩板堵塞[21]等問題,結合過柱儀進行自動化過柱,可在20 s內一次性完成12管樣品的凈化,可提高大批量樣品前處理凈化效率,增加檢測通量。通過對前處理條件、色譜、質譜分析條件的優化,以基質效應、回收率與精密度作為評價指標,確定16種喹諾酮藥物最優的檢測方法,建立過柱儀輔助凈化柱結合超高效液相色譜—串聯質譜檢測動物源性食品中16種喹諾酮藥物殘留的方法,以期為動物源性食品的市場監管中食品安全檢測提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

羊肉、鴨肉、牛肉、魚肉、雞蛋、豬腰、鴨皮等基質樣品:樣品經高通量組織研磨儀研磨后,于-20 ℃保存備用,市售;

16種喹諾酮藥物標準品[噁喹酸(OXO)、氟甲喹(FLU)、諾氟沙星(NOR)、環丙沙星(CIP)、培氟沙星(PEF)、洛美沙星(LOM)、恩諾沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL)、沙拉沙星(SAR)、雙氟沙星(DIF)、氟羅沙星(FLE)、達氟沙星(DAN)、馬波沙星(MAR)、奧比沙星(ORB)、依洛沙星(ENO)、司帕沙星(SPA)]:純度≥98%,德國Dr. Ehrenstorfer公司;

乙腈、甲醇:色譜級(≥99.9%),美國J. T. Baker公司;

甲酸、氨水:色譜級(≥98%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱:100 mm×2.1 mm,1.7 μm,美國Waters公司;

尼龍濾膜:0.22 μm,天津艾杰爾有限公司;

注射器:常州悅康醫療器材有限公司;

色譜自動進樣小瓶:浙江愛吉仁有限公司;

高通量組織研磨儀:XINW-M24型,上海鑫翁科學儀器有限公司;

移液槍:10,20,50,100,1 000,5 000 μL,德國Eppendorf公司;

純水機:Milli-Q Synergy型,默克化工技術(上海)有限公司;

高速渦旋儀:MS 3 basic小型,德國IKA公司;

臺式離心機:DM0412型,深圳市易瑞生物技術股份有限公司;

氮吹儀:UGC-24C型,北京優晟聯合科技有限公司;

超高效液相色譜—串聯質譜聯用儀:SCIEX QTRAP 5500+型,美國AB SCIEX公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制 16種喹諾酮藥物標準物質用甲醇配制標準儲備液(1 mg/mL),-20 ℃密封避光貯藏備用,有效期6個月。用50%乙腈水溶液稀釋16種喹諾酮藥物的標準儲備液,配制成1 μg/mL,100 ng/mL的單標溶液及16種喹諾酮混合標準溶液,4 ℃避光冷藏保存備用,有效期1個月。

1.2.2 樣品前處理 取5.0 g基質樣品于50 mL離心管中,加入 20 mL 80%乙腈(含0.2%甲酸)提取溶劑,渦旋3 min,4 000 r/min離心2 min,取5 mL上清液于15 mL離心管中,將Speedy Prep?-Quino 1凈化柱的橡膠頭置于離心管端口,將離心管—凈化柱放置于樣品架上,使用過柱儀過柱,填料上端濾過的提取液即為凈化后的提取液,倒出至樣品瓶或樣品管中,備用。取適量樣品用氮氣(45 ℃)吹干,按V0.2% 甲酸水∶V甲醇為9∶1復溶,渦旋混勻,過0.22 μm濾膜,上機檢測。

1.2.3 色譜與質譜分析條件

(1) 液相條件:色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相A為0.2%甲酸水,流動相B為甲醇;流速0.35 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量10 μL;梯度洗脫程序:0.00～5.00 min,90%～70% A;5.00～7.00 min,70%～50% A;7.00～7.10 min,50%～5% A;7.10～10.00 min,5%A;10.00～10.10 min,5%～90% A;10.10～13.00 min,90% A。

(2) 質譜條件:質譜離子源為電噴霧離子源(ESI);采用正離子掃描模式;多反應監測(MRM)檢測方式;離子源溫度550 ℃;電噴霧電壓5 500 V;氣簾氣壓力0.241 MPa(氮氣);噴霧氣壓力0.379 MPa(氮氣);輔助氣壓力0.379 MPa(氮氣);離子源溫度550 ℃。

1.2.4 方法學驗證

(1) 檢出限及定量限:空白羊肉基質經過前處理的提取、凈化得到樣品測試前的復溶液,用此復溶液稀釋16種混合標準溶液,配制喹諾酮藥物溶液,質量濃度梯度分別為0.05,0.1,0.2,0.5,0.8,1.0,2.0,5.0 ng/mL,UPLC-MS/MS測試后,根據SCIEX OS 軟件得到標準曲線、線性方程、線性范圍以及相關系數,以3,10倍的信噪比計算每種喹諾酮藥物的檢出限(LOD)與定量限(LOQ)。

(2) 基質效應:純溶劑稀釋標品,得到純溶劑空白標準溶液,質量濃度梯度分別為0.05,0.1,0.2,0.5,0.8,1.0,2.0,5.0 ng/mL?？瞻谆|復溶液稀釋標品,得到基質標準溶液,質量濃度梯度分別為0.05,0.1,0.2,0.5,0.8,1.0,2.0,5.0 ng/mL。UPLC-MS/MS檢測后得到純溶劑標準曲線和空白基質匹配曲線。按式(1)計算基質效應。

(1)

式中:

ME——基質效應;

K1——空白基質匹配曲線斜率;

K2——純溶劑標準曲線斜率。

(3) 添加回收率與精密度:精確稱取5.0 g空白基質樣品,分別加入5,20,100 μg/kg的16種喹諾酮混合標準溶液,按1.2.2的方法對基質樣品進行處理,外標法基質匹配曲線定量,以加標回收率及相對標準偏差為評價指標,驗證方法的準確性及精密度。

(4) 數據分析:運用 Excel 2010軟件進行數據處理、計算,使用SolidWorks建模、繪圖,使用Origin繪圖,使用SPSS 23.0進行方差分析,試驗結果以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 色譜條件和質譜條件優化

2.1.1 色譜條件優化 由圖1可知,當水相均為0.1%甲酸水,甲醇為有機相時,喹諾酮藥物在色譜上相互分離程度較乙腈為有機相時的好,峰型更為尖銳。0.1%甲酸水—乙腈洗脫的噁喹酸及氟甲喹拖尾嚴重,且乙腈毒性較大,因此選用甲醇為有機相。此外,隨著甲酸濃度的增加,部分化合物響應有稍微的降低或增加,但均滿足所需的響應需求,為使整體響應值偏高,選用0.2%甲酸水—甲醇作為流動相。

圖1 不同流動相下16種喹諾酮藥物標準溶液的MRM色譜圖

2.1.2 質譜參數優化 由表1可知,16種喹諾酮藥物保留時間為4.25～8.26 min,可在10 min內完成定性分析。

2.2 前處理條件優化

2.2.1 凈化材料 由圖2可知,凈化柱從裝有提取液的離心管端口下壓使得提取液穿過復合填料,此過程中雜質被復合填料吸附,而目標分析物不被吸附,流穿的提取液即為凈化后的提取液。分別對凈化前和凈化后的羊肉基質提取液中的雜質進行紫外測試,結果如圖3所示。由圖3可知,過柱后的提取液在波長<300 nm時紫外吸收值較未過柱的提取液有一定程度的降低,表明動物源性食品提取液經凈化柱過柱后蛋白質等雜質有一定程度的減少,利用凈化柱方法凈化效果較好。

圖2 凈化柱凈化樣品提取液過程示意圖

圖3 羊肉基質凈化前及凈化后的紫外吸收對比圖

2.2.2 過柱儀輔助凈化 過柱儀輔助凈化操作過程如圖4所示,插入電源適配器通電,將離心管—凈化柱放置于樣品管架上,然后將待過柱的管架水平居中放入艙內運動板下方,啟動儀器開始工作,工作流程結束后運動板自動復位,此時可取出離心管架,完成過柱。

圖4 過柱儀過柱示意圖

2.2.3 提取溶劑 以羊肉為基質,探究不同濃度的乙腈水對回收率的影響。結果顯示,隨著有機溶劑的減少,提取液色素含量顯著增高,提取液雜質增多,渾濁度增高,當乙腈濃度低于50%時,色素增加得更為明顯。因此選擇50%,60%,70%,80%,90%,100%乙腈分別對羊肉基質進行提取。當以90%,100%乙腈作為提取液時,大部分喹諾酮藥物的回收率較低;當以50%,60%,70%乙腈水作為提取液時,噁喹酸、氟甲喹的回收率較低,尤其是氟甲喹的回收率低于60%。當以80%乙腈水作為提取液時,16種喹諾酮藥物的回收率為73.12%～122.41%,提取效果較好。

為進一步提高部分喹諾酮藥物的回收率,向80%乙腈水中分別添加氨水及甲酸,結果見表2。由表2可知,與80%乙腈水相比,當提取液中添加0.2%氨水時,大部分喹諾酮藥物的回收率顯著降低(P<0.05),而添加0.2%甲酸的提取液,9種喹諾酮藥物的回收率均顯著增加(P<0.05),尤其是依諾沙星的回收率由73.12%提升至97.39%。當甲酸添加量分別增加至0.5%,1.0%時,部分藥物的回收率顯著降低(P<0.05),可能是因為喹諾酮藥物是兩性化合物,一定的酸性條件促進了部分喹諾酮藥物的溶解,而過酸條件下部分喹諾酮藥物可能會有一定程度的降解[22]。與80%甲醇水(含0.2%甲酸)相比,當以80%乙腈水(含0.2%甲酸)作為提取液時,喹諾酮藥物的回收率較高且具有顯著性差異。因此,最終選擇80%乙腈水(含0.2%甲酸)為提取溶劑。

表2 不同提取溶劑下16種喹諾酮藥物的回收率?

2.3 方法檢出限和定量限

以羊肉基質為例,其基質標曲的檢出限、定量限、線性范圍、線性方程、相關系數如表3所示。羊肉基質在此方法檢測下的16種喹諾酮類藥物在1.6～40.0 μg/kg質量濃度范圍內線性較好,相關系數r≥0.996 1,檢出限為0.14～0.80 μg/kg,定量限為0.47～2.68 μg/kg。

表3 16種喹諾酮藥物的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限及定量限

2.4 基質效應

以羊肉基質為例,由表4可知,16種喹諾酮藥物中有6種喹諾酮藥物即噁喹酸、氟甲喹、環丙沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、奧比沙星受基質干擾程度大,表現為強基質效應,其中氟甲喹的基質效應最強,比值為0.29,其余10種基質效應為弱基質效應,可忽略不計。

表4 16種喹諾酮藥物基質效應

2.5 回收率與精密度

以羊肉、鴨肉、牛肉、魚肉、雞蛋、豬腰、鴨皮為樣品基質,使用建立的方法對其進行添加回收試驗,進行方法驗證和應用,結果見表5。由表5可知,羊肉基質的平均回收率為72%～109%,相對標準偏差為1.7%～11.0%;鴨肉基質的平均回收率為72%～112%,相對標準偏差為0.9%～13.0%;牛肉基質的平均回收率為72%～105%,相對標準偏差為1.6%～13.1%;魚肉基質的平均回收率為74%～110%,相對標準偏差為2.6%～10.9%;雞蛋基質的平均回收率為69%～110%,相對標準偏差為1.0%～18.7%;豬腰基質的平均回收率為62%～109%,相對標準偏差為1.5%～13.3%;鴨皮基質的平均回收率為71%～118%,相對標準偏差為1.8%～10.7%;7個基質的平均回收率為62%～112%,RSD為0.90%～18.7%,平均回收率均滿足GB/T 27404—2008的要求,表明試驗建立的方法適用基質廣泛,準確度和精密度良好,穩定性好。

表5 16種喹諾酮藥物在不同加標水平下的回收率及精密度

3 結論

建立了一種過柱儀輔助凈化柱結合UPLC-MS/MS檢測動物源性食品中16種喹諾酮藥物的確證性定量方法。樣品經80%乙腈水(含0.2%甲酸)提取溶劑進行提取,能減少部分雜質與目標化合物共提取。使用濾過型凈化柱對提取液內雜質進行凈化,相對于SPE小柱可減少凈化過程中活化、淋洗、洗脫等步驟,解決了16種喹諾酮藥物因雜質干擾導致的部分化合物回收率差及前處理過程復雜、耗時長的問題,配合使用過柱儀可一次性于20 s內完成12管樣品的凈化,增大了樣品檢測通量,提高了前處理凈化效率。結合UPLC-MS/MS對每個化合物進行獨立檢測,其重現性好,靈敏度高,滿足定性及痕量分析的檢測需求。研究的不足在于對色素較深和基質較為復雜的動物源性食品可能需要進行2次及以上凈化或減少凈化量從而確保較好的凈化效果,而此關鍵在于凈化柱填料的選擇及填料的使用量和待凈化液量,以期在未來的凈化柱產品填料選擇以及方法建立上進行進一步優化。