杏仁中苦杏仁苷合成關鍵基因PaCYP79啟動子互作蛋白的篩選

張美玲 張俊環 殷麗麗 楊麗 姜鳳超 于文劍 王玉柱 孫浩元

摘 要：【目的】苦杏仁苷是形成杏仁苦味的主要物質，細胞色素P450 基因CYP79 是苦杏仁苷合成路徑上的重要基因，研究調控CYP79 基因表達的轉錄因子對進一步闡明杏仁中苦杏仁苷合成與調控機制具有重要意義?！痉椒ā恳浴t‘駱駝黃杏仁不同發育時期的種皮和子葉為試驗材料，構建杏仁cDNA 文庫。對杏中PaCYP79 啟動子上順式作用元件進行預測，并利用重組的誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 對杏仁cDNA 酵母文庫進行篩選，結合酵母單雜交實驗，鑒定PaCYP79 啟動子可能的上游調控因子?！窘Y果】對PaCYP79 啟動子順式作用元件分析表明，PaCYP79 啟動子序列中含有多個植物的組成型核心啟動子順式作用元件，還含有ABA、赤霉素、茉莉酸等多種植物激素和環境脅迫的響應元件，參與分生組織發育及種子特異調控等順式作用元件。成功構建杏仁cDNA 酵母文庫，庫容為1.2×107 CFU，平均插入片段大于1 000 bp，文庫的重組率為100%。酵母文庫篩選結果經測序和Blast 同源性分析，獲得10 個互作蛋白，其中包括淀粉樣蛋白聚集和蛋白毒性的正調控相關的蛋白（small EDRK-rich factor 2），與種子發育和隨后的萌發調控相關的蛋白（seed biotin-containing proteinSBP65），參與控制纖維素微原纖維定向沉積調控的類動力蛋白（kinesin-like protein KIN-4C），60S 核糖體蛋白L19-2（PREDICTED： 60S ribosomal protein L19-2），聚腺苷結合蛋白2 亞型X1（polyadenylate-binding protein2 isoform X1），以及5 個未知功能的蛋白。酵母單雜交進一步證實這10 個蛋白能與PaCYP79 基因啟動子結合?！窘Y論】本研究成功構建了高質量的杏仁cDNA 酵母文庫，并利用酵母單雜交技術在酵母文庫中篩選并驗證了10 個與PaCYP79 啟動子互作的蛋白。這些互作蛋白的篩選為深入研究杏仁中苦杏仁苷的合成與調控奠定了基礎。

關鍵詞：杏仁；酵母cDNA 文庫；酵母單雜交；互作蛋白；PaCYP79 啟動子

中圖分類號：S662.2 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981（2023）03—0057—13

杏Prunus armeniaca L. 是原產于中國的重要果樹樹種[1]。其種子—杏仁有甜、苦之分，甜杏仁富含蛋白質（其含量為23% ～ 27%）、不飽和脂肪酸、維生素和礦物質，可加工成杏仁油、杏仁露等多種食品[2-4]?？嘈尤蕜t是我國傳統的中藥材，具有鎮咳、平喘、抗炎、鎮痛等功效，被廣泛應用于止咳潤肺，散寒宣肺等功效中成藥的研制[5]。甜/ 苦杏仁中苦杏仁苷含量差異顯著，其含量變異幅度0.002 ～ 3.778 mg/g[6]?？嘈尤受帐且环N生氰糖苷，主要存在于扁桃、桃、杏、李、櫻桃等薔薇科植物中，是形成種子苦味的主要物質?？嘈尤受者€是維生素B17 的主要功效成分，因其具有祛痰和治療癌癥的功效而被廣泛應用于醫藥行業[7]。

關于苦杏仁苷的研究目前主要集中在對其提取純化效率、分析檢測技術的研發和提升、苦杏仁苷安全控制及生物活性等[8-10]。而關于杏仁中苦杏仁苷合成路徑蛋白質互作機制及調控因子篩選的深入研究仍然較少見，僅在扁桃、梅等物種中苦杏仁苷合成相關基因的挖掘及功能鑒定取得了一些進展。在扁桃中，前體苯丙氨酸首先在2個細胞色素P450 單加氧酶CYP79 和CYP71 的催化下，合成扁桃腈（Mandelonitrile），之后在二磷酸尿苷葡萄糖苷轉移酶GT1（UDP-glucuronidetransferases，GT） 的作用下生成洋李苷， 再經GT2 催化形成苦杏仁苷；同時，苦杏仁苷在苦杏仁苷水解酶（Amygdalin hydrolases，AH）和李苷水解酶（Prunasin hydrolases，PH）的催化下可進行分解轉化[11-12]。扁桃腈裂解酶（Mandelonitrilelyase，MDL）可間接地競爭性催化洋李苷底物扁桃腈，從而影響苦杏仁苷的合成 [13]?？嘈尤受赵诜N皮中合成。位于起始位置2 個細胞色素P450 基因PdCYP79 和PdCYP71 在甜仁種皮呈現低表達[14]，是扁桃中苦杏仁苷合成的重要限速酶。李苷水解酶（PH）參與了苦杏仁苷及洋李苷的降解代謝，且PH 蛋白可在種仁不同發育時期的質外體和共質體之間產生移動[15-17]。CYP79 作為苦杏仁苷合成的起始限速酶，已經在多個物種中克隆。Yamaguchi 等[18] 鑒定了梅（Prunus mume） 中的苦杏仁苷合成代謝起始步驟的細胞色素P450 酶CYP79s 和CYP71s，利用RNA 測序數據，克隆獲得了編碼CYP79s 和CYP71s 的全長cDNA 序列。對梅的不同組織中CYP79s 和CYP71s 的表達和酶活檢測顯示，CYP79D16 和CYP71AN24 在幼苗中呈現高表達，并在調控生氰糖苷的合成中起關鍵調控作用[18]。

杏仁資源的深加工和綜合利用及杏仁的遺傳改良一直備受重視[5， 19]。杏仁不僅具有豐富的營養應用于食品加工，還因其含有重要活性物質苦杏仁苷（Amygdalin）被廣泛應用于醫藥行業[5]。調控苦杏仁苷含量一直是杏遺傳改良研究的重要目標和方向之一，一方面，作為食品利用，要求盡量降低甚至清除杏仁中的苦杏仁苷，以消除杏仁的苦味和致毒性（苦杏仁苷是決定杏仁苦味性狀形成的關鍵物質并具有一定的毒性）并免除加工過程中的脫苦程序；另一方面，作為藥用原材料，則需要盡量提高苦杏仁苷的含量[20]。自1978年Kostina[21] 研究發現杏仁的苦味是受一對等位基因控制的質量性狀以來，國內外在杏仁苦味性狀的遺傳規律、基因型鑒定、苦杏仁苷含量在品種資源中的變異等方面取得了一定進展。陳學森等[22]、Negri 等[23] 利用杏雜種一代群體分析了杏仁苦味性狀的遺傳規律。Cervellati 等[24] 對杏仁苦杏仁苷進行了qNMR 檢測分析及QTL 定位。Liu等[25] 利用SSR 及ISSR 分子標記對甜仁杏進行了遺傳多樣性分析。黃雪等[6]、Karsavuran 等[26] 分別調查了國內、國外不同杏品種資源的苦杏仁苷的含量。然而，長久以來人們對于杏仁中苦杏仁苷的合成和調控機制知之甚少，極大地制約了此方面的杏育種進程和生產應用。

酵母單雜交技術是分析蛋白與基因之間互作的一種有效實驗手段，現在已被廣泛應用于蛋白質組學、細胞信號轉導和功能基因組學等領域[27]。利用特異誘餌基因篩選種仁發育時期的酵母cDNA文庫中互作的轉錄因子，將為我們研究苦杏仁苷合成路徑、建立蛋白互作調控網絡提供更多有益信息[28]。本研究首先構建杏仁不同發育時期的種皮和種仁的酵母cDNA 文庫。利用杏基因組數據克隆獲得杏仁中苦杏仁苷合成關鍵基因PaCYP79的啟動子，并構建誘餌載體，結合酵母單雜交技術篩選PaCYP79 的上游調控因子，以期為闡明PaCYP79 調控機制、揭示杏仁苦味形成的分子機制提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、載體與試劑

試驗材料‘串枝紅（苦仁品種）和‘駱駝黃（甜仁品種）不同發育時期的樣品取自北京市農林科學院林業果樹研究所杏資源圃。根據杏仁發育形態分為4 個時期：Ⅰ - 胚乳發育期（種皮內的胚乳為液態，未形成子葉），Ⅱ - 子葉發育初期（種皮內大部分為液體形態的胚乳，在種仁的尖端形成少部分固態的子葉），Ⅲ - 子葉發育完成期（種皮內無液態的胚乳，已完全形成子葉，但種皮還未纖維化，仍為白色且較厚），Ⅳ - 杏仁發育成熟期（種皮顏色變深并纖維化成薄薄的一層，種仁達到成熟階段）。在種仁發育階段，采集‘串枝紅‘駱駝黃Ⅰ、Ⅱ時期的種皮、Ⅲ時期的種皮和子葉、Ⅳ時期的子葉，共計10 個樣品，每個樣品3 次重復，切成小塊，立即放入液氮中速凍，存于-80 ℃冰箱，用于后續RNA 提取及酵母文庫構建。在新葉生長期，采集幼嫩葉片用于后續DNA 提取及基因啟動子克隆。

試驗中涉及的RNA 提?。═rizol）、純化（Oligotex mRNA Midi Kit）、cDNA 反轉錄、質粒提取等所需的各類試劑購自Invitrogen 和Qiagen 公司。酵母文庫構建中所用載體pAbAi及pGADT7、酵母菌株Y187、酵母單雜交菌株Y1HGold由上海歐易生物醫學科技有限公司提供。載體構建所需要的引物合成和測序由生工生物公司和華大基因完成。用于酵母自激活抑制的金擔子素A、酵母培養所需的各類培養基購自Clontech公司，各種工具酶、Marker 購自TaKaRa 公司。其他常規試劑耗材購自北京欣匯天東方科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 杏仁總RNA 的提取與mRNA 的分離純化

采用Trizol 法提取‘串枝紅‘駱駝黃杏仁不同發育時期種皮及子葉的RNA，經Qiagen 的純化試劑盒分離純化mRNA，利用電泳觀察特征條帶后，將10 個樣品等比例混合形成混樣，利用NanoDrop 微量分光光度計檢測混合純化產物的OD 值和RIN 值。

1.2.2 杏仁核體系酵母cDNA 文庫的構建

采用Gateway 位點特異性重組技術， 參照Cloneminer cDNA library construction kit 試劑盒說明書進行杏仁核體系酵母cDNA 文庫構建。將分離純化得到mRNA，再經反轉錄為雙鏈cDNA（dscDNA），經連接重組反應后，獲得4 mL 初級文庫菌液。提取初級文庫質粒，稀釋濃度到300 ng/μL后再經重組反應獲得次級文庫。篩庫時，活化擴繁酵母次級文庫，并提取質粒轉化到酵母感受態細胞Y187 中進行后續試驗。

1.2.3 酵母初級、次級文庫的質量鑒定

參照趙彩良等[29] 的方法對構建的酵母初級文庫和次級文庫進行質量鑒定。將酵母初級文庫、次級文庫菌液各10 μL 稀釋100 倍后，取其中50 μL 涂布在含卡那霉素（濃度：50 μg·mL-1）的LB 固體培養基上，對平板上長出的單克隆進行計數，計算庫容量和總庫容。計算公式為：庫容量= 單克隆數/ 涂布體積× 稀釋倍數= 單克隆數/50 μL×100×1 000（CFU·mL-1），4 mL 文庫菌液的總庫容= 庫容量× 總體積= 庫容量×4（CFU）。同時，對初級文庫和次級文庫隨機挑取24 個單克隆， 利用通用引物M13，pGADT7分別進行擴增，PCR 產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳后鑒定文庫質量。初級文庫鑒定引物（M13通用引物，F：GTAAAACGACGGCCAG，R：CAGGAAACAGCTATGAC），次級文庫鑒定引物（pGADT7-DEST 載體引物，F：TAATACGACTCACTATAGGGCGAGCGCCGCCATG，R：GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT）。

1.2.4PaCYP79 啟動子的克隆與誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 的構建

PaCYP79 啟動子序列選取杏基因組中PaCYP79（NCBI 中PaCYP79 基因登錄號：OL321787） 基因起始密碼子上游1 674 bp。根據所提取的序列設計PaCYP79 啟動子的擴增引物（CYP79-Pro-F：ACAATGATCAGTGCAAGATTTG；CYP79-Pro-R：GACTGCACGAGTAGAAAA）。提取杏基因組DNA，克隆得到PaCYP79基因的啟動子并測序。利用啟動子分析在線軟件PlantCARE（網址：http：//bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測該啟動子序列上的順式作用元件。

采用雙酶切的方法構建誘餌載體pAbAi-PaCYP79p。誘餌序列（PaCYP79 啟動子）兩端加入酶切位點Sal I 和Xho I。用Sal I 和Xho I 雙酶切pAbAi 質粒，得到純化的線性化pAbAi 片段后與加了酶切位點的PaCYP79 啟動子片段進行連接反應，經氨芐青霉素（濃度：100 μg·mL-1）的抗性篩選，獲得陽性單克隆。經Sal I 和Xho I雙酶切和測序驗證（測序引物F：GTTCCTTATATGTAGCTTTCGACAT），獲得構建好的誘餌載體pAbAi-PaCYP79p。

1.2.5 誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 轉化Y1HGold酵母菌株

采用LiAC/PEG 法將誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 轉化到酵母Y1HGold 菌株中（方法參照Clontech 產品說明書）。用Bst BI 酶對誘餌質粒pAbAi-PaCYP79p 進行單酶切，并純化酶切產物。取1 μg 線性化誘餌質粒pAbAi-PaCYP79p 轉化至酵母感受態Y1HGold 中，并在SD/-Ura 缺陷培養基上培養2 ～ 3 d 后進行篩選，利用PCR 鑒定轉化成功的陽性單克隆。

1.2.6 金擔子素（Aureobasidin A， AbA） 抗性篩選

參照余婧等[30] 的方法，對實驗中需要的ABA抗性進行篩選和確定。將500 μL 轉化成功的含有pAbAi-PaCYP79p 的陽性Y1HGold 菌液，稀釋至濃度達到OD600=0.002 時，涂布到含有不同濃度梯度的AbA的SD/-Ura 平板上，AbA濃度分別為0，100，150，200，300，500，700，900 ng/mL。觀察不同平板上單克隆的生長狀況，如果在某個濃度下陽性克隆的自激活可得到抑制，無法正常生長，則可以確定該AbA 濃度及以上可以用于后續篩選試驗。

1.2.7 杏仁cDNA 酵母文庫的篩選

參照Clontech 公司的MatchmakerTM LibraryConstruction&Screening Kit 試劑盒說明書，對杏仁cDNA 酵母文庫進行篩選。取10 μg 酵母文庫質粒，轉化到1.2.5 含有誘餌載體pAbAi-PaCYP79p的Y1HGold 酵母菌液中，按照10、102、103 倍稀釋后，涂布于SD/-Leu 缺陷培養基上進行篩選，統計平板上單克隆數，計算酵母文庫篩選總克隆數CFU=[ 平板上單克隆數]×[ 稀釋倍數]×[ 重懸體積（6 mL）]，酵母文庫轉化效率CFU/μg=文庫總克隆數/ 酵母文庫質量（10 μg）。剩余菌液涂布于SD/-Leu/AbA（AbA 添加量為1.2.6 中篩選的濃度） 平板， 待SD/-Leu/AbA 平板長出單克隆后，初篩完成。將初篩板上長出的陽性克隆再次轉移到SD/-Leu/AbA 平板上， 進行二次篩選。挑取單菌落進行PCR 鑒定（T7 通用引物，F：TAATACGACTCACTATAGGGC 和R：GTAGATGGTGCACGATGCACAG）， 測序獲得將陽性克隆的序列，通過uniprot（網址：https：//www.uniprot.org/）和NCBI 數據庫（網址：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取該序列的注釋信息和蛋白功能預測。

1.2.8 篩選陽性克隆與誘餌載體單雜交驗證

將1.2.7 中獲得的陽性克隆的酵母質粒DNA與誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 共轉Y1HGold 酵母感受態細胞，涂布在SD/-Leu/AbA 篩選培養基上進行酵母單雜交驗證（抗性篩選板的AbA 添加量不低于1.2.6 篩選的ABA 濃度），觀察酵母生長情況，參照劉振寧等[31] 的方法驗證誘餌質粒與蛋白的互作。

2 結果與分析

2.1 杏仁酵母初級cDNA 文庫構建

RNA 的完整度與穩定性是構建cDNA 文庫的關鍵。提取杏仁不同發育時期的RNA，取2 μL 進行電泳檢測，結果（圖1A）具有RNA 的兩條特征條帶。將所有10 個樣品等比例混合后檢測總RNA 的OD260 nm/OD280 nm 值為2.11，RIN 值（RNA integrity number）為9.0。將總RNA 進行分離純化和反轉錄分別獲得mRNA（圖1B）和雙鏈cDNA（圖1C），電泳結果均呈現彌散條帶，且ds cDNA 主要片段大于1 000 bp。以上結果表明，所提取的總RNA和反轉錄獲得的cDNA質量良好，可用于后續酵母文庫構建。

2.2 杏仁酵母初級cDNA 文庫質量評估

統計初級文庫涂布在平板上長出的單克隆數為1 300 個（圖2A），初級文庫庫容量= 平板上的克隆數/50 μL×100×1 000 μL=1 300/50 μL×100×1 000 μL=2.6×106 CFU/mL，4 mL 總庫容=2.6×106×4=1.04×107 CFU，大于106（標準文庫的質量）。對隨機挑取的24 個單克隆進行PCR 檢測，結果表明，文庫重組率達100%，插入的片段也都為大于1 000 bp 的有效片段（圖2B）。

2.3 杏仁酵母核體系次級文庫的構建及質量評估

統計次級文庫涂布在平板上長出的單克隆數為1 500 個（圖3A），次級文庫庫容量= 平板上的克隆數/50 μL×100×1 000 μL=1 500/50 μL×100×1 000 μL=3.0×106 CFU/mL?？値烊?3.0×106×4=1.2×107 CFU。從次級文庫中隨機挑取的24 個單克隆進行PCR 檢測，均獲得了清晰條帶，次級文庫重組率達100%，插入的片段范圍800 ～2 000 bp 有效片段所占比例較大（圖3B）。由此可見，本研究構建的杏仁cDNA 文庫質量較高，可用于酵母文庫的篩選，為進一步開展杏仁中苦杏仁苷合成關鍵基因的挖掘及杏仁甜苦分子調控機制的深入研究奠定了基礎。

2.4PaCYP79 基因啟動子的克隆及序列分析

啟動子分析表明，PaCYP79 啟動子序列中含有多個植物的組成型核心啟動子順式作用元件，如TATA-box 和CAAT-box；還含有ABA、赤霉素、茉莉酸等多種植物激素的響應元件， 如ABRE、GARE-motif、CGTCA-motif、TGACG-motif； 光響應元件Box 4、MRE、G-box、ATCT-motif、L-box、TCT-motif、AE-box、TCCC-motif；響應環境脅迫的元件TC-rich repeats、LTR、MBS、ARE；參與分生組織發育的CAT-box 及種子特異調控的RYelement等順式作用元件（表1）。

2.5 誘餌載體的構建、轉化酵母及鑒定

將PaCYP79 基因啟動子的序列（1686 bp）連接到誘餌載體pAbAi 上，利用Sac I 和Xho I 雙酶切驗證誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 構建成功，目的片段為1.7 kb（圖4A）。用BstBI 單酶切誘餌載體，轉化Y1HGold 酵母感受態細胞，涂平板培養3 天后，挑取生長健康的單菌落，經PCR 擴增目的片段，預期陽性克隆目的條帶大小應為397+1686 bp。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示（圖4B），誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 轉化酵母Y1HGold 菌株后的陽性克隆目的條帶大小約為2 000 bp，與預期片段大小相近，進一步測序驗證，確定誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 成功轉入到酵母菌株中。

2.6 抑制誘餌酵母自激活的AbA 濃度篩選

AbA 抗性測定結果顯示， 誘餌酵母菌株Y1HGold 在含有0、100、150、200 ng·mL-1AbA的SD/-Ura 平板上生長良好（圖5），而在含有濃度為300 ng·mL-1AbA 及以上的SD/-Ura 平板上停止生長（圖6），說明AbA 濃度在300 ng·mL-1以上即可用于酵母單雜交篩選，本實驗中選取300 ng·mL-1 用于后續的酵母單雜交篩選實驗。

2.7PaCYP79 啟動子片段與杏仁cDNA 文庫的酵母單雜交篩選及互作驗證

將構建好的杏仁cDNA 酵母文庫質粒轉化誘餌菌株Y1HGlod [pAbAi-PaCYP79p] 稀釋1 000 倍后的菌液涂布在SD/-Leu 平板上，統計單克隆數量為35，篩選克隆總數=35/100 μL×1 000×6 mL=2.1×106 CFU，文庫轉化效率CFU/μg= 文庫總克隆數/ 酵母文庫質量（10 μg）=2.1×105 CFU/μg。表明杏仁cDNA 酵母文庫的轉化效率符合文庫篩選要求（大于1×105 CFU/μg）。

酵母轉化產物在含300 ng·mL-1 AbA 的SD/-Leu的培養基上培養3 ～ 5 d，初篩獲得43 個陽性單克隆菌落，將pAbAi-PaCYP79p 初篩獲得的陽性單克隆菌落再次轉移到SD/-Leu/AbA（400 ng/mL）篩選平板上，進行二次篩選，共獲得41 個候選陽性單克隆菌落（圖7A）。提取質粒測序得到對應的序列，并結合NCBI 和uniprot 數據庫進行序列比對和蛋白功能注釋，排除文庫構建時由于核酸移碼突變造成的假陽性克隆，合并重復序列，鑒定得到10 個候選的可編碼不同的蛋白基因序列，具體信息見表2。提取10 個候選陽性克隆的酵母質粒DNA與誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 共轉Y1HGold 酵母感受態細胞，涂布在SD/-Leu/AbA（500 ng/mL）篩選培養基上進行酵母單雜交驗證，這10 個候選基因與誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 共轉Y1HGold酵母菌均可在SD/-Leu/AbA（500 ng/mL） 平板上正常生長（圖7B），說明這些蛋白可以激活PaCYP79 啟動子。

3 討 論

構建高質量的杏仁cDNA 文庫，是后續利用酵母文庫篩選互作蛋白的重要前提[32]。本試驗中用于酵母文庫構建的RNA 樣品取自‘串枝紅‘駱駝黃杏仁不同發育時期的種皮和子葉，包含了盡量多的轉錄本信息。提取的杏仁發育時期總RNA 的RIN 值9.0，經mRNA 分離純化后，反轉錄獲得雙鏈cDNA 條帶呈彌散分布，符合文庫構建對其純度和完整性的要求。本研究中用于篩選的酵母次級文庫容量為1.2×107 CFU，插入片段均在1 000 bp 以上，重組率為100%，覆蓋度和完整性良好，可用于后續苦杏仁苷合成路徑調控基因的篩選研究。

利用誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 對構建好的杏仁cDNA 酵母文庫進行單雜交篩選，獲得10 個可能與苦杏仁苷合成路徑關鍵基因PaCYP79 啟動子互作的候選蛋白。對這10 個蛋白的基因序列在NCBI 和uniprot 數據庫進行序列比對和蛋白功能注釋，結果顯示，其中5 個比對到有功能注釋的蛋白，另外5 個功能未知的新蛋白。其中包括淀粉樣蛋白聚集和蛋白毒性的正調控相關的small EDRKrichfactor 2（SERF2）蛋白[33-34]，與種子發育和萌發調控相關的蛋白seed biotin-containing proteinSBP65[35]，與參與控制纖維素微原纖維定向沉積調控的類運動蛋白kinesin-like protein KIN-4C[36]，60S核糖體蛋白L19-2（60S ribosomal protein L19-2），聚腺苷結合蛋白2 亞型X1（polyadenylate-bindingprotein 2 isoform X1），以及5 個未知功能的蛋白。酵母單雜交進一步證實這10 個蛋白能與PaCYP79啟動子結合，為深入研究杏仁苦杏仁苷合成與調控的通路奠定基礎。

對SERF2 蛋白的研究與應用主要集中在醫學方面。SERF2 蛋白最初被分離出來是用于亨廷頓病、帕金森病和阿爾茨海默病等疾病的研究，純化的SERF2 蛋白在體外加速了這些疾病中相關的淀粉樣蛋白的形成[33]。同時，SERF2 是一種高度保守的蛋白質，在體外修飾淀粉樣纖維組裝并促進蛋白質錯誤折疊，在調節與年齡相關的蛋白質毒性中具有一定作用[34]?？嘈尤受赵谶m宜的濃度范圍對于抗腫瘤、抗器官纖維化、抗動脈粥樣硬化等方面能發揮顯著作用，但是過量食用則會由于苦杏仁苷分解產生的氫氰酸（HCN）而中毒[37-38]。PaCYP79 是苦杏仁苷合成路徑上的起始位置重要限速酶，屬于細胞色素P450 家族基因。該基因家族編碼的單加氧酶，可參與體內藥物代謝的氧化還原反應，在毒性物質和致癌物質代謝過程中發揮重要作用[39]。因此SERF2 蛋白有可能與細胞色素P450 家族基因相互作用，共同參與苦杏仁苷合成代謝的相關路徑。

SBP65 基因編碼65 kDa 的種子生物素化LEA蛋白（胚胎發育晚期豐富蛋白），且ABA 在種子胚胎發育的特定階段對SBP65 的表達起特異性調控作用[35]。SBP65 蛋白在豌豆種子發育后期大量積累，并在其突變體（vip-1）中的表達量和蛋白含量水平都很低[32]。SBP65 是LEA 大家族中的一員。而LEA 蛋白在提高種子耐儲性、增強植物響應干旱、低溫等逆境脅迫的抗性中發揮重要作用[40-41]。擬南芥、玉米、小麥、苜蓿種子中許多與種子耐貯性相關的LEA 蛋白已被鑒定，如擬南芥LEA14，AtLEA3 蛋白，玉米的LEA 蛋白（EMB564），小麥和苜蓿種子的Em 蛋白等[42-45]。此外玉米種子發育過程中的LEA 類蛋白—胚胎蛋白DC-8 在高活力的種子中大量積累，并在種子發育后期的胚胎形成過程中受ABA 的調控[46]。扁桃中CYP79 的表達隨著種仁發育進程呈現規律性變化，且在甜、苦仁間的種皮、子葉、胚乳等組織中表現組織表達特異性，并與苦杏仁苷的含量緊密相關[47]。對杏PaCYP79 啟動子順式作用元件分析發現，其啟動子上存在種子特異調控的順式作用元件（RY-element）和ABA 響應元件（ABRE），有可能作為SBP65 蛋白發揮互作的作用位點。

類驅動蛋白KIN-4C 在開花植物中參與沿皮層微管運輸含有非纖維素成分的物質[36]。而KIN-4C的同源蛋白KIN-4A 在赤霉素（GA）生物合成途徑中起轉錄激活作用[48]。該蛋白可特異性結合到貝殼杉烯氧化酶2（ent-kaurene oxidase，KO2）啟動子的DNA 序列上，通過調節GA 生物合成途徑來調控OsKO2 基因表達并介導細胞伸長[48]。貝殼杉烯氧化酶ent-kaurene oxidase（KO）作為細胞色素P450（CYP）701 家族成員，是所有高等植物中參與赤霉素（GA）生物合成所必需的酶[49]。但是細胞色素P450（CYP701）不同家族成員在功能上存在差異，如水稻中有5 個CYP701A 亞家族成員，只有一個（OsKO2/CYP701A6）是GA 生物合成所必需的[50-51]。PaCYP79 啟動子上也具有赤霉素響應元件GARE-motif，受GA 的調控，同時與CYP701A6 同為細胞色素P450 蛋白，可能存在相似結構，與類運動蛋白KIN-4C 相結合發揮功能。

酵母單雜交是利用基因啟動子與蛋白之間的相互作用來研究基因轉錄調控的重要實驗技術，也是篩選鑒定與啟動子特異調控序列相結合的轉錄因子的有效手段[52]。因此，除了具有高質量的重要發育階段的杏仁cDNA 文庫外，構建含有特異調控DNA 片段的誘餌載體也是篩選轉錄因子的重要影響因素[53]。為了獲得較多的互作蛋白，本研究中所用的酵母單雜交試驗的誘餌質粒包含了PaCYP79 起始密碼子ATG 上游的1 674 bp 序列。PaCYP79 啟動子序列中含有較豐富的元件，不僅包含有ABA、赤霉素等多種植物激素響應元件、光響應、環境脅迫響應的元件，還包含有植物的組成型核心啟動子順式作用元件，以及參與分生組織發育及種子特異調控等的順式作用元件。此外，還有可能發生互作的未知片段。因此除了篩選到與PaCYP79 互作的可能參與苦杏仁苷合成路徑的SERF2，SBP65，KIN-4C 調控因子外，還篩選到調節基礎功能的蛋白60S 核糖體蛋白L19-2和聚腺苷結合蛋白2 亞型X1。60S 核糖體蛋白L19-2（60S ribosomal protein L19-2）是大核糖體亞基的組成部分。核糖體是一種大型核蛋白復合體，負責細胞內蛋白質的合成。聚腺苷結合蛋白2 亞型X1（polyadenylate-binding protein 2 isoformX1）參與RNA 結合與多核苷酸腺苷轉移酶活性的正調控。兩者在基因轉錄和蛋白形成過程中發揮基礎調節功能。

本研究以較長片段而非特異序列的啟動子序列為誘餌，利用酵母單雜交技術在杏仁cDNA 酵母文庫中篩選并驗證到了10 個與PaCYP79 啟動子互作的蛋白，因此獲得的候選蛋白的特異性還有待驗證。與植物相比，利用酵母雜交系統進行DNA 特異序列與轉錄因子的互作驗證，可能缺乏高等生物在轉錄過程所特有的修飾反應，其在植物細胞中DNA 特異序列與轉錄因子互作的真實性還需要進一步驗證。另外由于酵母雜交自身技術也有可能在實驗結果出現少數假陽性和假陰性的現象。針對以上問題，下一步可利用熒光素酶報告基因分析及EMSA 凝膠遷移分析等方法進一步驗證SERF2 蛋白，SBP65 蛋白及KIN-4C 蛋白對PaCYP79 轉錄調控的真實性，結合啟動子序列短截或突變等實驗來驗證其特異互作區段和關鍵結合位點。對篩選到的其他功能未知的蛋白進行基因功能鑒定，發掘可能參與苦杏仁苷代謝的新基因，以期完善PaCYP79 的功能解析，為深入解析苦杏仁苷合成路徑分子調控網絡提供參考。

4 結 論

本研究成功構建了高質量的杏仁cDNA 酵母文庫，并利用酵母單雜交技術在酵母文庫中篩選并驗證了10 個與PaCYP79 啟動子互作的蛋白。這些互作蛋白的篩選為深入研究杏仁中苦杏仁苷的合成與調控奠定了基礎。

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[ 本文編校：趙 坤]