重組溶瘤單純皰疹病毒對小鼠結腸癌移植瘤的抑制作用*

朱彥斌，彭瑞娟，張磊，張新強，馬正海

（新疆大學生命科學與技術學院新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830017）

0 引言

溶瘤病毒（Oncolytic Virus,OV）能特異性感染和裂解腫瘤細胞，是腫瘤治療領域的前沿和熱點.近些年以1型單純皰疹病毒（Herpes Simplex Virus-1,HSV-1）為基礎改造的溶瘤單純皰疹病毒取得了突破性進展，TVEC（talimogene laherparepvec）和Teserpaturev（G47Δ,Delytact）兩種oHSV先后獲批上市用于治療轉移性黑色素瘤和膠質瘤，并有多種oHSV治療方案進入臨床實驗階段[1].目前，oHSV主要通過刪除神經毒性基因γ34.5、免疫抑制基因ICP47和病毒復制相關基因ICP6等獲得，并在此基礎上插入細胞因子和趨化因子等免疫調節因子以增強抗腫瘤免疫反應[1-2].本課題組前期構建了刪除內部反向重復序列（Inverted Repeat,IR）的HSV-1載體MH1001，以及刪除IR和ICP47的病毒載體MH1005，并在MH1001中插入抑癌基因p53獲得oHSV MH1004、在MH1005中插入IL-12獲得oHSV MH1006，以上oHSV在皮下黑色素瘤模型、結腸癌肺轉移模型和小鼠皮下神經瘤模型中取得了良好的治療效果，顯著抑制了小鼠腫瘤的生長，延長了小鼠生存期[3-5]，本文旨在探討MH1004和MH1006對小鼠皮下結腸癌的抑制作用.

1 材料與方法

1.1 病毒株和細胞株

HSV-wt、HSV病毒載體MH1001和MH1005以及oHSV MH1004和MH1006均為實驗室保存的病毒株，詳見文獻[3-4]；小鼠結腸癌細胞系CT26、兔上皮細胞Rsc和人胚腎細胞HEK-293FT細胞均為實驗室保存.

1.2 實驗動物

4～6周雌性BALB/c小鼠60只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司.

1.3 主要試劑

細胞裂解液、脫脂奶粉、TBST、DAB顯色液、RPMI-1640培養基、磷酸緩沖液、0.25%胰蛋白酶購自Hyclone公司；胎牛血清FBS購自杭州四季青公司；吉姆薩染料為北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產品；IL-12檢測試劑盒為Abcam產品；鼠抗人p53單克隆抗體購自博士德生物公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG為北京鼎國昌盛生物技術有限公司產品；其余試劑均為國產分析純.

1.4 病毒的擴增與治療基因的表達檢測

1.4.1 病毒的擴增

重組HSV-1的擴增方法詳見文獻[2]，簡述如下：常規方法培養Rsc至細胞滿度達到85%以上，以0.1 MOI病毒感染細胞，待90%以上細胞發生病理變化時收集細胞，加入1 mL病毒儲存液，-80 ℃保存備用；病毒儲液經超聲波破碎細胞釋放病毒后，按常規方法感染Rsc測定病毒滴度.

1.4.2 Western blot檢測p53在MH1004感染細胞中的表達

以1 MOI MH1004感染HEK-293FT細胞，培養48 h后收集細胞懸液，提取細胞總蛋白；取30 μL樣品進行SDS-PAGE電泳分離蛋白；濕轉法將分離的蛋白轉到PVDF膜上；PVDF浸于1%脫脂奶粉封閉液中，4 ℃過夜；1∶200稀釋的鼠抗人p53單抗中室溫孵育2 h，PBST快洗3次；1∶4 000稀釋的山羊抗小鼠IgG中室溫孵育1.5 h，PBST快洗3次；加入2 mL DAB顯色液避光顯影，拍照.

1.4.3 ELISA檢測IL-12在MH1006感染細胞中的表達

以1 MOI MH1006感染HEK-293FT細胞，分別于感染后1、2、3、4 h收集細胞上清液檢測IL-12含量，操作步驟按照Abcam IL-12 p40/p70 Human SimpleStep ELISA Kit使用說明書進行.

1.5 小鼠結腸癌腫瘤模型的建立

6～7周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為6組，分別為Mock（病毒儲液）組、HSV-wt組、MH1001組、MH1004組、MH1005組和MH1006組，每組10只小鼠；將CT26細胞密度調至1×107個細胞/毫升，充分混勻后移至無菌EP管中；用酒精棉球浸濕小鼠背部右側皮毛，使其皮膚裸露，揪起小鼠皮毛，將針頭平行插入皮下，按1×106個細胞/100微升PBS進行皮下接種；正常飼養小鼠，觀察小鼠成瘤情況.

1.6 重組oHSV抑瘤效果和生存時間的監測

待小鼠皮下腫瘤直徑達到約6～7 mm時，挑選各組內腫瘤大小一致的小鼠（n=6）用于后續抑瘤實驗；用病毒儲液將各病毒調整至2×107PFU/mL，吸取100 μL各病毒或儲液（Mock）腫瘤內多點注射，連續注射3次，間隔7 d，每3 d測量腫瘤的長度（Length,L）和寬度（Width,W），按照公式V=(L×W2)/2計算腫瘤體積，監測小鼠的腫瘤體積和生存時間，繪制抑瘤曲線；小鼠死亡后先凍存，首次注射病毒后第42 d對各組小鼠統一進行剝瘤和拍照，每組腫瘤組織從大到小排列.

1.7 統計分析

實驗數據以“平均數±標準差”（X±S）表示，使用GraphPad Prism 5軟件進行t檢驗.0.01＜P＜0.05、0.001＜P＜0.01和P＜0.001分別為有差異、差異顯著和差異極顯著的判定標準.

2 實驗結果

2.1 重組HSV-1的擴增與鑒定

HSV-wt、MH1001、MH1005、MH1004和MH1006感染Rsc 36 h時的滴度均達到1×108PFU以上.Western blot從MH1004感染細胞中檢測到約55 kDa的p53蛋白質，且表達量明顯高于未感染病毒的對照細胞（圖1）.MH1006感染細胞1、2、3、4 h后IL-12的表達量分別為37.44±9.67 pg·mL-1、77.34±6.94 pg·mL-1、83.39±7.25 pg·mL-1和92.51±14.41 pg·mL-1（圖2），均顯著高于對照組（0.001＜P＜0.01），感染2～4 h時，IL-12表達量高于1 h的表達量（0.01＜P＜0.05），說明MH1006感染細胞1 h時IL-12已開始表達，且2 h后達到平臺期.

圖1 Western blot檢測MH1004感染細胞中p53蛋白質的表達

圖2 ELISA檢測MH1006感染細胞中IL-12的表達

2.2 重組oHSV對小鼠腫瘤體積的影響

oHSV抑制移植瘤效果見圖3.治療6～18 d時，MH-1006組小鼠的腫瘤體積小于Mock組（0.01＜P＜0.05），其中12 d時MH1004組小鼠腫瘤體積亦小于Mock組（0.01＜P＜0.05）.治療21 d后，MH1006組小鼠腫瘤體積為1 414.36±1 639.19 mm3，極顯著小于Mock組腫瘤體積（7 682.92±2 648.74 mm3）（P＜0.001）；MH1004和MH1005組小鼠的腫瘤體積分別為2 820.69±2 539.35 mm3和2 127.31±2 017.02 mm3，均顯著小于Mock組（0.001＜P＜0.01）；MH1006和MH1005組小鼠腫瘤體積均小于MH1001組（0.01＜P＜0.05）；另外，MH1006組小鼠腫瘤體積在3～21 d始終略小于MH1005組和MH1004組，但無統計學意義.

圖3 重組oHSV對結腸癌荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制

2.3 剝瘤實驗結果

對各組小鼠進行剝瘤，腫瘤大小見圖4.治療42 d時，MH1004、MH1005和MH1006治療組均有1只小鼠腫瘤消失，這3組小鼠腫瘤體積顯著小于Mock、HSV-wt和MH1001組，且MH1006組小鼠腫瘤體積略小于MH1004和MH1005組（圖3），表明3種oHSV-1均能有效抑制小鼠皮下結腸癌的生長，且MH1006抑瘤效果最佳.

2.4 重組oHSV對小鼠生存率的影響

荷瘤小鼠生存率統計結果顯示：治療42 d時，Mock和HSV-wt組各死亡3只，生存率均為50%，且Mock組存活小鼠行動遲緩、反應呆滯、喜聚集；MH1001和MH1005組各死亡2只，生存率為66.67%；MH1004和MH1006治療組小鼠未見死亡，生存率（100%）高于其余各組（0.01＜P＜0.05）（圖5）.

圖5 重組oHSV對結腸癌荷瘤小鼠生存率的影響

3 討論

oHSV可以靶向性感染并裂解癌細胞，20世紀90年代初，Moolten等[6]報道了缺失胸苷激酶的HSV-1保留了復制能力，并延長了顱內膠質瘤裸鼠的存活率，之后又出現了許多oHSV，其中很多缺失RL1、UL39或兩者都缺失[7].為了提高安全性，改造策略開始傾向于刪除神經毒性基因γ34.5，其編碼蛋白ICP34.5通過與蛋白磷酸酶1α直接作用使eIF2α去磷酸化，從蛋白激酶R介導的先天性免疫反應途徑的主要宿主防御機制中脫離，從而發揮關鍵作用；相比之下，刪除γ34.5的oHSV不能使eIF2α去磷酸化，導致宿主細胞蛋白質合成停滯，從而防止病毒在正常細胞中復制.然而，癌細胞的抗病毒機制受損，允許病毒復制[8].

結腸癌致死占全球死亡人數的9.2%[9]，我國每年新發結腸癌55萬例，新增結腸癌死亡28萬例，中國新發結腸癌占世界新發結腸癌人數的28.4%[10].目前，手術切除、放療及化療仍是結腸癌治療的主要手段，盡管取得了一定的效果，但患者生存結果較差[11]，亟待新的治療方案.本課題組前期構建了攜載p53和IL-12的重組oHSV MH1004和MH1006，其對黑色素瘤和神經膠質瘤皮下移植瘤模型以及結腸癌肺轉移模型均具有顯著的溶瘤效應，可顯著提高荷瘤小鼠的存活率，并延長生存期[3-5].本文以刪除IR和ICP47的重組HSV-1載體MH1005以及MH1004和MH1006瘤內注射治療結腸癌皮下移植瘤小鼠，治療21 d后MH1006組小鼠腫瘤體積極顯著小于對照組，其余兩組小鼠腫瘤體積均顯著小于對照組（圖3），治療42 d時，3組均有1只小鼠腫瘤完全消失（圖4）.小鼠生存率結果顯示：MH1004和MH1006組可延長結腸癌荷瘤小鼠的生存期，42 d內的生存率為100%，顯著高于Mock組（50%）、HSV-wt組（50%）、MH1001組（66.67%）和MH1005組（66.67%）（圖5）；組內小鼠腫瘤組織大小與生存期差異為小鼠個體差異所致[12].

MH1005為刪除IR區和ICP47的重組HSV-1載體，刪除區包括HSV-1的神經毒性基因γ34.5、潛伏相關轉錄本（Latency Associated Transcripts,LATs）、復制相關的立即早期基因ICP0和ICP4以及抑制抗原遞呈的ICP47.本文發現MH1005作為病毒骨架載體亦表現出較強的溶瘤效應（圖4），其一是MH1005復制能力較強，本課題組之前的研究表明，MH1005以及載入治療基因的MH1004和MH1006在感染Neuro-2a細胞36 h時的滴度均達到1×108PFU以上[3-4]，本文中MH1004和MH1006感染Rsc細胞36 h時的滴度亦達到1×108PFU以上，其復制水平與野生型HSV-1相當，故瘤內注射后可高效感染和抑殺腫瘤細胞.通常刪除ICP0和ICP4等立即早期基因會降低HSV-1的復制能力，由于MH1005同時刪除了LAT，LATs的缺失可在一定程度打破HSV-1的潛伏，促使病毒進入裂解增殖狀態，從而保持了病毒在哺乳動物細胞中的復制能力.其二是ICP47產物可抑制抗原遞呈，據報道，刪除該基因的溶瘤病毒瘤內注射后可激發抗腫瘤免疫反應，從而促進溶瘤效應[13]，本文中刪除ICP47的MH1005可能誘發了較強的腫瘤免疫反應，加之MH1005神經毒性降低、載容量較大，可作為理想的復制型OV載體.

為提高OV抗腫瘤效應，可將具有抗腫瘤作用的基因載入OV中，如抑癌基因p53、增強免疫的細胞因子等.p53具有抗腫瘤作用，其用于腫瘤治療已有廣泛的研究[14].據Ⅰ/Ⅱ期臨床研究表明，攜載p53的溶瘤腺病毒單獨或結合放化療治療多種腫瘤具有較高的安全性和抑癌活性[15-20]；據報道，攜載p53的水泡性口炎病毒亦能顯著延長荷瘤小鼠的生存期[21].本文中MH1004抑瘤作用明顯，并延長了結腸癌小鼠生存期（圖5），據報道，很多惡性腫瘤細胞p53均發生突變并在腫瘤發生中發揮重要作用[22].MH1004感染細胞中p53的表達水平明顯提高（圖1），其瘤內注射治療時通過高表達p53調節細胞周期，并發揮抑瘤作用.

目前，表達細胞因子的OV治療腫瘤的研究較多，是OV研究的熱點.其中表達IL-12的OV已用于多種腫瘤的治療研究，表達IL-12的牛痘病毒和HSV-1用于治療荷瘤小鼠均已見報道[23-24]，IL-12還可與其它細胞因子協同促進OV治療效果，如表達IL-12和IL-7的痘病毒瘤內注射可使小鼠移植瘤完全消退[25]；表達IL-12和GMCSF的oHSV治療黑色素瘤荷瘤小鼠顯著抑制了腫瘤的生長，延長了小鼠的存活期[26].本文結果表明：MH1006感染HEK-293FT細胞后IL-12表達水平顯著提高（圖2），IL-12在體內表達后可以通過INF-γ誘導體內抗腫瘤免疫反應[12,27]，故直接溶瘤和腫瘤免疫應答疊加使MH1006的抑瘤作用更為顯著（圖3～5）.