累代遺傳的肝豆狀核變性的臨床與基因診斷分析

劉力生， 方明娟， 年 娜， 趙 雯， 童廣安， 王佳煒， 胡文彬，

肝豆狀核變性（hepatolenticular degeneration，HLD），又稱Wilson 病，是由于ATP7B基因突變造成其編碼的P 型銅轉運ATP 酶缺陷引起肝銅跨膜轉運障礙，使機體排銅障礙從而導致銅在肝、腦等多器官中過度蓄積，最終出現肝硬化、運動障礙、精神癥狀等［1］。HLD 是一種單基因常染色體隱性遺傳性的、可治性的疾病，其發病率約1/30 000，人群攜帶率約為1/90，并具有區域差異，通常不會連續幾代發?。?-4］?？赡芤驗檩^高人群攜帶率，目前國外已有部分病例報道在同一家族內連續兩代或多代中存在HLD，反映了“偽顯性”遺傳［5-8］。故而，2022 年美國肝病學會實踐指導中明確提出對于HLD 確診患者的一級親屬需進行ATP7B基因篩查［9］。目前國內尚無相關報道及研究，本研究針對我科近期收治的3 個累代遺傳的HLD 家系進行了相關臨床及基因的診斷，并進行總結分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇安徽中醫藥大學神經病學研究所附屬醫院神經內科二病區于2017 年6 月—2023 年7 月收治的HLD 患者3 例。收集調查其現病史、既往史、家族史等資料，并尋找其存在患病風險的父母、子女等一級親屬（見圖1）。本研究經安徽中醫藥大學倫理委員會批準，取得每位參與者同意并簽訂知情同意書，采集家系成員的臨床臨檢及生化指標、角膜K-F 環（kayser-fleischer ring，KFR）、腹部及頭部影像學等臨床資料，通過外周靜脈血提取ATP7B基因檢測。

圖1 3個HLD家系遺傳圖譜

家系1：先證者（Ⅱ∶1），患者，男性，30歲，先后檢查血小板減低、動作笨拙7 個月。2016 年11 月在當地醫院檢查發現“血小板、白細胞減低”，進一步檢查腹部B超示：“肝硬化、脾腫大”，具體診治不詳。2017年2 月，家人發現其穿衣、持筷、系鞋帶等精細動作笨拙，外院檢查發現“血清銅藍蛋白（ceruloplasmin，CP）減低”，予以“二巰基丙磺酸鈉驅銅10 余天”，上述癥狀略有緩解。2017 年6 月5 日首次入住我科。家族史：否認父母近親婚配，患者兒子（Ⅲ∶1）曾因“感冒”在當地醫院檢查“肝功能異?！?。

家系2：先證者（Ⅲ∶2），患兒，女性，3 歲，檢查發現轉氨酶升高、CP 減低12 d。2021 年8 月6 日患兒在幼兒園入院體檢時發現“肝功能：谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）299 U/L，谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）184 U/L”，進一步檢查“血清CP 0.1 g/L（參考范圍0.16～0.45）；肝炎病毒學指標及自身免疫性肝炎指標均正?！?，遂于2021年8月17 日入我科。家族史：否認父母近親婚配，患兒母親（Ⅱ∶2）及小姨（Ⅱ∶4）有不明原因轉氨酶升高情況，胞兄（Ⅲ∶1）體健，未行HLD相關篩查。

家系3：先證者（Ⅰ∶2），患者，女性，54 歲，漸進性頭抖、四肢抖動16 年。2007 年起先后出現頭部及四肢不自主抖動。至2013 年出現行走欠穩及言語含糊，就診北京某醫院考慮“HLD”，予以“驅銅”等治療后上述癥狀明顯改善。2023 年4 月初，因家庭矛盾出現情緒低落、夜間入睡困難，于2023 年4月23 日入我科。家族史：否認父母近親婚配，患者兒子（Ⅱ∶1）曾檢查血清銅藍蛋白減低，近期體檢有脂肪肝。

1.2 方法

1.2.1 一般檢查項目 血清學指標（ALT、AST、血清CP）使用日立7180全自動生化分析儀檢測，基礎24 h尿銅排泄量（尿Cu）采用火焰原子吸收光譜法，儀器為北京瑞利分析儀器公司生產WFX-120B型原子吸收分光光度計。由我院專業人員在裂隙燈（YT2A型，蘇州醫療器械廠）下進行KFR檢查。使用Siemens ACUSON Sequoia超聲（5C1探頭）檢查進行腹部彩超檢查；對于家系1、3 先證者使用采用Philips Achieva 1.5T MRI掃描設備進行頭部影像學檢查。

1.2.2 基因檢測 對先證者及其診斷存在疑問的一級親屬進行ATP7B基因二代測序（next generation sequencing，NGS），所有突變位點都通過多個數據庫進行評估，包括HGMD 專業版、Clinvar、gnom AD 等數據庫。使用Mutation Taster 和PolyPhen-2 軟件檢測分析所有可能致病突變的危害性。并對所有的突變位點進行ACMG（美國醫學遺傳學與基因組學學會）遺傳變異分類標準和指南進行分類。最后，所有可能的致病性突變都用Sanger進行了測序，并通過家族譜系進行驗證。診斷方法參照2021年《中國肝豆狀核變性診治指南》［10］，并符合2001年萊比錫第8屆國際HLD 會議提出的診斷標準（Leipzig計分系統）的積分 ≥ 4分［11］。

2 結 果

2.1 一般檢查項目結果 家系1，Ⅱ∶1存在明顯CP減低和尿Cu增高，ALT、AST正常，KFR陽性，腹部彩超提示肝硬化、脾大，頭部MRI平掃提示腦干片狀長T2信號，FLAIR呈稍高信號（見圖2）；Ⅲ∶1僅有輕度CP減低，但尿Cu增高，ALT水平輕度升高，KFR陰性，腹部彩超未見異常，遂進一步完善基因檢測。

圖2 家系1的Ⅱ∶1頭部MRI平掃

家系2，Ⅲ∶2、Ⅲ∶1 均有CP 減低和尿Cu 增高，KFR 均陰性。Ⅲ∶2 的ALT、AST 水平明顯升高，腹部彩超提示肝內鈣化灶；但Ⅲ∶1 肝功能及腹部彩超均正常，遂進一步完善基因檢測，結果顯示與Ⅲ∶2基因型存在差異。因Ⅱ∶2、Ⅱ∶4 曾于外院檢查CP 均為0.11 g/L，且均有不明原因轉氨酶增高情況，而我院CP 僅輕度減低或正常，且Ⅱ∶4 尿Cu 正常范圍，KFR均陰性，故同時進行基因檢測。

家系3，Ⅰ∶2 存在明顯CP 減低，尿Cu 不高，肝功能指標正常，KFR 陽性，腹部彩超提示肝硬化、脾稍大，頭部MRI平掃提示腦干、雙側額頂葉皮質下、雙側放射冠區可見點片狀長T2信號，FLAIR 呈高信號；腦室系統稍擴張，兩側大小腦半球腦溝裂增寬（見圖3）；Ⅱ∶1的CP明顯減低，尿Cu高，腹部彩超提示脂肪肝，但肝功能正常，KFR 陰性，故予以完善基因檢測。3個HLD家系一般檢驗資料（見表1）。

表1 3個HLD家系一般檢驗資料

圖3 家系3的Ⅰ∶2頭部MRI平掃

2.2 基因檢測結果 3 個家系共計發現六處雜合錯義突變和一處缺失突變，分別是位于14 號外顯子的c. 3121C ＞ T p. Arg1041Trp、8 號外顯子的c.2333G ＞ T p.Arg778Leu、12號外顯子的c.2975C ＞ T p. Pro992Leu、13 號外顯子的c. 2755C ＞ G p. Arg919 Gly、11號外顯子的c.2605G ＞ A p.Gly869Arg和12號外顯子的c.2790_2792delCAT p.Ile930del，均為已報道的HLD 常見致病位點。然而，位于2 號外顯子的c. 482T ＞ C p. Ile161Thr，目前在Clinvar 數據庫有收錄，致病性分級為Uncertain significance，HGMD 專業版暫未收錄，ACMG 致病性分析為PP3 Moderate +PM2_support+PP1_suppor，分級亦為Uncertain significance；通過PolyPhen-2、Mutation Taster 軟件分析該位點危害性結果均為：0.999（見表2）。

表2 3個HLD家系ATP7B基因突變位點

2.3 3 個HLD 家系診斷結果 根據Leipzig 計分系統：家系3 中Ⅱ：1 以“CP 53.3 mg/L”“尿Cu 121.06 μg/24 h”“ATP7B基因 c. 2333G＞T p.Arg778Leu雜合突變”計算積分 ≥ 4分。最終，通過一般檢查項目及ATP7B基因檢測，家系1 中Ⅱ∶1、Ⅲ∶1，家系2 中Ⅲ∶2、Ⅲ∶1、Ⅱ∶2、Ⅱ∶4，家系3 中Ⅰ∶2、Ⅱ∶1 均確診為HLD；家系2 中Ⅰ∶1、Ⅰ∶2、Ⅱ∶1、Ⅲ∶3，家系3 中Ⅰ∶1、Ⅲ∶1、Ⅲ∶2均被明確為HLD雜合突變攜帶者。

3 討 論

HLD是一種由ATP7B基因突變引起的罕見的常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙性疾?。?2］。1968 年，Sternlieb 和Scheinberg 首次估計了其患病率為5/100萬［13］。隨后的研究顯示，德國每100 萬人中有29 例HLD［14］，日本每100萬人中有33例HLD［15］。1984年，HLD 的全球患病率估計為3.3/100 000，經推算突變攜帶者頻率為1/90［16］。國內最早由胡文彬對安徽省部分地區進行了兩次流行病學調查，得出HLD 患病率為4.93/10 萬～6.21/10 萬［3，17］。而對封閉/孤立人群的研究顯示：希臘卡利姆諾斯島HLD 突變攜帶者頻率達7/100，意大利撒丁島的HLD 患病率高達1/2 707［18］。此外，在英國的一項分子研究預測攜帶兩個致病ATP7B等位基因的個體的頻率為1/7 026，突變攜帶者頻率高達2.4/100［19］；法國通過二代測序也發現HLD 人群雜合攜帶率達1/31［20］。因此，HLD 的患病率及普通人群突變攜帶率可能比以往認為的要高得多，當HLD 患者與雜合突變攜帶者婚配，這就意味著HLD 患者的一級親屬，如除兄弟姐妹外的父母、子代，患病的可能性不容忽視。

血清CP 的檢測是目前臨床診斷HLD 最常用的方法。根據最新Cochrane 數據庫的系統評價結果顯示，當以0.2 g/L 作為臨界值時，CP 的敏感性為77.1%～99.0%，特異性為55.9%～82.8%；而當以0.1 g/L作為臨界值時，總體的敏感性下降至65%～78.9%，但特異性提高至96.6%～100%［21］。然而，部分HLD患者的CP水平接近正常，本單位前期研究表明HLD患者CP 正?；c銅負荷過重以及肝損傷有關［22］。此外，在兒童HLD 的CP 水平研究中也發現，部分癥狀前期患兒CP水平是正常的［23］。本研究中，除家系1 的Ⅱ∶1 和家系3 的Ⅰ∶2 表現為典型的神經系統及肝硬化癥狀外，其余6例HLD 患者均為癥狀前期患者。其中1 例患者CP 在正常范圍（16.7%），只有1 例患者CP水平低于0.1 g/L（僅占16.7%）。故而，不能單純的以“CP 正?！北闩懦鼿LD 患者一級親屬的患病可能。

尿Cu 可以間接反映血清游離銅水平，有助于HLD 的診斷和治療監測。當尿Cu＞100 μg/24 h 時，對診斷HLD 的敏感性為50%～80%，特異性為75.6%～98.3%；對于無癥狀和兒童患者，當尿Cu＞40 μg/24 h 時，對診斷HLD 的敏感性為78.9%，特異性為87.9%［21］。若能夠排除其他慢性活動性肝病、肝硬化等疾病，尿Cu越高對HLD診斷價值越大。另外，尿Cu 水平會隨驅銅治療逐漸下降。本研究中，除家系3的Ⅰ∶2入院前曾進行驅銅導致尿Cu偏低外，其余患者尿Cu 均增高，符合診斷標準（100%）。因此，尿Cu測定對于篩查癥狀前期HLD具有較高的特異性。

根據研究顯示，除膽汁淤積性肝病、部分膽道閉鎖、自身免疫性肝炎等少見疾病外，KFR被廣泛認為是HLD的一種特征性標志［24］。另有研究指出：在神經型HLD患者中KFR陽性率約72%～85.2%，而內臟型及癥狀前期患者中分別僅50%及20%～30%［25，26］。本研究結果顯示，除家系1 和家系3 中的2 名先證者，亦為神經型患者的KFR 為陽性外，其余6名癥狀前期HLD 患者KFR 均為陰性，即陽性率為0%，因此KFR對于癥狀前期HLD患者的診斷敏感性較差。

目前已知的ATP7B基因致病位點達600 余種，其中以單核苷酸錯義和無義突變最為常見，其次是插入/缺失，而剪接位點突變很少見［4］。在歐洲HLD患者人群中，最常見的突變為p.H1069Q［27］，而我國人群的高頻致病突變依次為p. R778L，p. P992L 和p.T935M［28，29］。隨著人類基因組計劃的完成和基因突變數據的快速積累，研究者可以有效地利用生物信息學軟件來綜合預測新突變的致病性［30］。其中，PolyPhen-2 是基于進化保守性與蛋白的三維結構，利用貝葉斯分類器計算后驗概率來預測［31］；Mutation Taster 是基于進化保守性、Grantham 矩陣評分、貝葉斯分類器來預測［32］；二者在靈敏度、特異性、陽性預測值、準確度等多個指標參數與其他生物信息學軟件對比，表現出較好的評估性能［30］。本研究中8例HLD患者均為復合雜合突變，共發現7個突變位點，其中p.R919G出現4次（25%），其次是p.R778L、p. G869R 出現3 次（18.8%），p. P992L、p. I930del 出現2 次（12.5%），p. R1041W、p. I161T 出現1 次（6.3%）。其中除p. I161T 外均為已報道HLD 致病位點。從家系3 中Ⅱ：1 發現的p. I161T 目前僅在Clinvar 數據庫有收錄，但致病性分級為“Uncertain significance”，HGMD 專業版未收錄，ACMG 致病性分析為“PP3 Moderate+PM2_support+PP1_suppor”，分級亦為“Uncertain significance”；通過PolyPhen-2、Mutation Taster 軟件分析該位點危害性分別為“PROBABLY DAMAGING”“disease causing”，評分均為：0.999。結合該患者已有的臨床數據計算Leipzig評分≥4 分，故可診斷癥狀前期HLD，本研究進一步證實了p.I161T突變的致病性。

HLD 的臨床異質性較大，患者發病年齡可從嬰兒期至70 歲以上?；颊呖赡艹霈F各種類型的肝病、神經精神障礙等癥狀，亦可無任何臨床癥狀［33，34］。對于典型的HLD 患者，根據最新的指南進行診斷并不困難［10，35］，然而，對于部分臨床表現不典型的患者，如癥狀前期患者，一方面，缺乏典型的肝、腦損害的癥狀、體征；另一方面，常規的臨床指標如CP、KFR 等也可能與典型HLD 患者表現不同；這些均增加了診斷難度。有研究表明，血清轉氨酶升高是兒童或癥狀前期HLD 診斷的重要線索［23］。本研究中，6 例癥狀前期患者有5 例出現不同的程度轉氨酶升高情況（83.3%）。隨著HLD 基因的克隆以及基因診斷技術的應用和進步，在判斷臨床表現和實驗室檢查結果不典型的HLD 疑診患者以及有HLD 先證者的家系成員是否患病方面，基因診斷有著十分重要的價值［36］。

HLD 是一種單基因常染色體隱性遺傳疾病，攜帶者沒有任何癥狀，通常被認為不會發生累代遺傳，然而，由于HLD 致病基因ATP7B基因突變在人群中的高攜帶頻率，我們進行了上述研究，以展示HLD的“偽顯性”遺傳特征，并明確了p.Ile161Thr 突變的致病性。HLD 是一種為數不多的可治療的遺傳病，早期診斷對于確?；颊吣軌蛟缙诮邮艹浞值闹委?、避免進展為神經型和肝硬化至關重要。臨床醫師可通過肝功能、CP、尿Cu 等臨床指標初步評估HLD 患者父母及子女的HLD 患病風險，必要時進行基因檢測明確診斷。同時，建議HLD 患者生育前對配偶進行基因檢測，以避免累代遺傳的發生。然而，本研究因病例數有限，研究結果可能有失偏頗，待后期繼續收集案例進一步分析、驗證。

倫理學聲明：本研究經安徽中醫藥大學神經病學研究所附屬醫院倫理委員會批準［批號：2023倫字（27）號］，患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：劉力生負責論文設計、起草論文；方明娟、趙雯負責收集臨床資料、繪制圖表；年娜負責基因分析；童廣安、王佳煒負責文獻收集、擬定寫作思路；胡文彬負責論文修改、指導撰寫文章并最后定稿。