離子交換色譜-紫外檢測器法測定馬鈴薯中馬來酰肼的殘留量

王曉威,孟玲玲,蔡丹旎,于世強,劉鵬宇,欒紹嶸

(華東理工大學 化學與分子工程學院,上海 200237)

據聯合國糧食及農業組織(FAO)統計,我國是馬鈴薯種植面積最大的國家,種植面積穩定在8 000萬畝以上,全國馬鈴薯鮮薯產量達一億噸。在馬鈴薯貯藏過程中為防止其發芽、變綠,常在馬鈴薯收獲的前2～4周內,用0.2%(質量分數)馬來酰肼(MH)溶液進行葉面噴灑。MH又名抑芽丹,是一種植物生長抑制劑,能有效抑制植株頂端分生組織細胞分裂,破壞植株頂端優勢,強烈抑制芽的生長,常被用于抑制馬鈴薯、洋蔥、大蒜等蔬菜貯藏期的發芽。研究發現,MH是一種誘變致癌劑,一定劑量下會導致細胞染色體斷裂,從而產生細胞毒性,對人和高等動物有潛在風險[1]。據中國馬鈴薯協會統計,中國人均食用馬鈴薯消費量為31.3 kg·a-1,日均消費量為85.75 g·d-1。因此,建立馬鈴薯中MH殘留的簡便、快速的檢測方法已成為保障人民身體健康的迫切需求。

目前,MH殘留的檢測方法主要有蒸餾-分光光度法[2-3]、高效液相色譜法(HPLC)[4-6]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[7-11]、氣相色譜法[12]、毛細管電泳法[13]、拉曼光譜法[14]、化學發光法[15-17]、差分脈沖伏安法[18]等。較為常見的是前3種方法,其中蒸餾-分光光度法是美國分析化學家協會(AOAC)最初采用的方法,其依賴MH在濃堿及高溫條件下被鋅還原成肼,同時用氮氣保護,將生成的肼蒸餾出來,在酸性溶液中與對二甲基氨基苯甲醛反應生成黃色化合物,再用分光光度法進行檢測。該過程需要濃堿、高溫條件,以及蒸餾等步驟,前處理復雜,操作繁瑣,導致方法重復性不好。HPLC檢測靈敏度較差,若想達到較低的檢出限,則需要濃縮、復溶等一系列復雜的前處理手段。LC-MS/MS檢測MH雖有較高的靈敏度,但儀器成本高,難以作為常規檢測手段。根據MH的化學結構,它在弱酸性、堿性條件下呈陰離子狀態,并且具有紫外吸收,因此可采用帶有紫外檢測器的離子色譜法進行分析檢測。例如,文獻[19]采用高效離子排斥色譜法測定了蔬菜樣品中MH的殘留量,達到了較理想的結果;文獻[20]在此基礎上優化了淋洗液濃度和流量,并利用此方法考察了MH在馬鈴薯塊莖及芽葉中的分布情況,結果表明馬鈴薯塊莖中的MH會定向向芽葉中遷移并積累,且不同品種馬鈴薯中MH的遷移能力有差異。

鑒于此,本工作提出了離子交換色譜-紫外檢測器法測定馬鈴薯中MH殘留量的方法。相較于蒸餾-分光光度法、HPLC等傳統檢測方法,該方法前處理簡單,更易于推廣為常規檢測方法;相較于離子排斥色譜法,該方法更加通用,同時流動相避免了有機溶劑的引入,符合綠色環保的理念,且流動相由KOH淋洗液發生器在線產生,不僅基線噪聲更低,還避免了手動配制流動相產生的誤差及二氧化碳的影響,有效提高了方法的精密度和穩定性。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

ICS-6000型離子色譜儀,配UltiMate 3000 VWD可變波長檢測器、KOH淋洗液發生器、自動進樣器和Chromeleon 7.2.10色譜工作站;Xevo G2 TOF型質譜儀;Milli-Q型超純水機。

MH標準儲備溶液：稱取0.051 2 g MH標準品,用50%(體積分數)甲醇溶液溶解(超聲輔助)并定容至50 mL,搖勻,配制成MH質量濃度為1 014 mg·L-1的標準儲備溶液。使用時,用水稀釋至所需質量濃度。

MH標準品的純度大于99%;甲醇為色譜純;氫氧化鈉為優級純;試驗用水為超純水(電阻率不小于18.2 MΩ·cm)。

1.2 儀器工作條件

Dionex IonPac AS16分析柱(250 mm×4 mm,9 μm),Dionex IonPac AG16保護柱(50 mm×4 mm,9 μm);柱溫30 ℃;流量1.0 mL·min-1;進樣量25 μL;紫外檢測波長205 nm。流動相為KOH溶液,梯度洗脫程序：0～7.0 min,KOH溶液濃度為3 mmol·L-1;7.0～7.1 min,KOH溶液濃度跳轉至30 mmol·L-1,保持17.9 min;25.0～25.1 min,KOH溶液濃度跳轉至3 mmol·L-1,保持4.9 min。

1.3 試驗方法

本工作分析的市售馬鈴薯均未檢出MH,因此將馬鈴薯浸泡在MH標準溶液中可簡單模擬MH殘留的馬鈴薯樣品。將馬鈴薯洗凈,切成約1 cm厚度的厚片,浸泡于500 mg·L-1MH標準溶液中,再置于2～8 ℃冰箱中放置24 h。24 h后取出,洗凈、去皮、攪碎。稱取1 g處理后的樣品于15 mL離心管中,加入10 mL甲醇,超聲30 min,每隔5 min振搖1次,使樣品分散均勻,然后于60 ℃水浴加熱5 min,室溫下以轉速5 000 r·min-1離心20 min,上清液過0.22 μm聚醚砜針式濾器和IC-RP反相前處理柱,濾液按照儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

試驗采用陰離子交換色譜柱,流動相為堿性溶液,若提取溶劑選擇不當,不僅會影響提取效率,還會影響待測物的保留時間和檢測結果。試驗考察了含20 mmol·L-1氫氧化鈉的甲醇溶液、20 mmol·L-1氫氧化鈉溶液、水以及甲醇分別作為提取溶劑時模擬馬鈴薯樣品中MH的測定值,結果如圖1所示。

圖1 提取溶劑對MH測定值的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on the determined values of MH

由圖1可知,以甲醇和含20 mmol·L-1氫氧化鈉的甲醇溶液為提取溶劑時,MH測定值分別為44.19 μg·g-1和45.37 μg·g-1,略高于以20 mmol·L-1氫氧化鈉溶液和水為提取溶劑時的(MH測定值分別為36.23 μg·g-1和34.90 μg·g-1)?？紤]到加入堿會影響溶液酸度,從而影響待測物的出峰時間,試驗選擇以甲醇為馬鈴薯中MH的提取溶劑。

2.2 儀器工作條件的選擇

2.2.1 淋洗液發生器的使用

陰離子交換色譜柱的流動相可通過KOH淋洗液發生器在線產生,也可用手動配制的NaOH溶液。試驗考察了這兩種方式的流動相對MH檢測的影響,淋洗液發生器采用的流動相為3 mmol·L-1KOH溶液,手動配制的流動相為3 mmol·L-1NaOH溶液,結果如圖2所示。

圖2 淋洗液發生器與手動配制流動相對MH檢測的影響Fig.2 Effects of eluent generator and hand-made mobile phase on the determination of MH

結果表明,采用KOH淋洗液發生器的基線噪聲比采用手動配制NaOH溶液的小。這是由于NaOH溶液在手動配制過程中會吸收空氣中二氧化碳,對基線造成一定的影響,而淋洗液發生器可實時制備出較為純凈的KOH溶液,避免了雜質干擾。因此,試驗采用KOH淋洗液發生器提供流動相。

2.2.2 色譜柱

試驗考察了Dionex IonPac AS11-HC和AG11-HC、Dionex IonPac AS15和AG15、Dionex IonPac AS16和AG16、Dionex IonPac AS18和AG18以及Dionex IonPac AS19和AG19等5種色譜柱(前者為分析柱,后者為保護柱)對模擬馬鈴薯樣品中MH色譜峰的影響,結果見圖3。

圖3 不同色譜柱檢測模擬馬鈴薯樣品中MH的色譜圖Fig.3 Chromatograms of MH in the simulated potato sample determined by different chromatographic columns

結果表明：采用Dionex IonPac AS11-HC和AG11-HC色譜柱分離時(流動相為1 mmol·L-1KOH溶液), 基線不穩定, 且MH出峰前出現保留時間為12.75 min的未知峰(由于含量太少,圖中未能顯示),與MH的分離度為1.22,小于1.5,不適用于MH的分離檢測;采用Dionex IonPac AS19和AG19色譜柱分離時(流動相為5 mmol·L-1KOH溶液),MH顯示為倒峰,可能是由于模擬樣品中有其他物質與MH在同一位置出峰,且在205 nm檢測波長下的吸光度比基線小,不宜用于MH的檢測;Dionex IonPac AS15和AG15(流動相為10 mmol·L-1KOH溶液)、Dionex IonPac AS16和AG16(流動相為3 mmol·L-1KOH溶液)、Dionex IonPac AS18和AG18(流動相為5 mmol·L-1KOH溶液)色譜柱均可較好地分離MH,但Dionex IonPac AS16和AG16色譜柱得到的MH色譜峰峰高相對較高,半峰寬相對較小,對稱性較好。因此,試驗選用Dionex IonPac AS16和AG16色譜柱進行檢測。

2.2.3 洗脫程序

試驗考察了KOH溶液濃度分別為3,4,5 mmol·L-1時模擬馬鈴薯樣品中MH的分離情況,結果見圖4。

圖4 KOH溶液濃度對MH分離的影響Fig.4 Effect of the concentration of KOH solution on the separation of MH

結果表明,當KOH溶液濃度由5 mmol·L-1降低至3 mmol·L-1時,MH色譜峰與前面未知峰的分離度逐漸增加,其中3,4 mmol·L-1KOH溶液得到的MH分離度(1.99,1.68)均滿足大于1.5的要求。鑒于3 mmol·L-1KOH溶液得到的MH分離度更好,且保留時間也比較合理,試驗選擇以3 mmol·L-1KOH溶液分離MH。MH洗脫分離后,立即將KOH溶液濃度升至30 mmol·L-1來沖洗雜質,最后再將KOH溶液濃度降至3 mmol·L-1平衡系統。

2.3 系統適用性

按照儀器工作條件分別對空白溶液(不添加馬鈴薯樣品,其余前處理步驟同1.3節)、未浸泡MH的樣品溶液(馬鈴薯直接去皮、攪碎后處理,其余前處理步驟同1.3節)以及2.028 mg·L-1MH標準溶液進行測定,考察MH的干擾情況,結果見圖5。

圖5 系統適用性考察Fig.5 Investigation of the system suitability

由圖5可知,空白溶液和未浸泡MH的樣品溶液中均未出現干擾MH的物質,說明該方法對馬鈴薯中MH的檢測不存在干擾。

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線、檢出限和測定下限

取10,20,50,80,100 μL 1 014 mg·L-1MH標準儲備溶液,用水定容至10 mL,搖勻,即得質量濃度分別為1.014,2.028,5.070,8.112,10.14 mg·L-1的MH標準溶液系列;分取360 μL 5.070 mg·L-1MH標準溶液,用水定容至10 mL,搖勻,即得質量濃度為0.182 5 mg·L-1的MH標準溶液。按照儀器工作條件對上述6個濃度水平的MH標準溶液進行測定,以MH質量濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標進行線性回歸。結果表明：MH標準曲線的線性回歸方程為y=2.194x-0.064 24,相關系數為0.999 9,線性范圍為0.182 5～10.14 mg·L-1。

分別以3,10倍信噪比(S/N)確定檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結果分別為0.06 mg·L-1和0.18 mg·L-1。

2.4.2 儀器精密度和重復性試驗

將2.028 mg·L-1MH標準溶液按照儀器工作條件測定6次,結果顯示,MH的保留時間和峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為0.073%,3.7%,表明儀器穩定,精密度較好。

摘 要：新時代教育工作的開展，必須保持積極的創新思路，不能繼續按照老舊的灌輸式方法來完成。從客觀的角度分析，小學數學教育信息化的應用，已經得到了業界的高度肯定，同時能夠在教育的可靠性、可行性方面獲得良好的提升，針對未來教育的進步，能夠奠定堅實的基礎，在師生素質的共同提升方面，均能夠產生良好的推動作用。因此，研究在教育信息化背景下具體的小學數學教學策略，能為教學指出更明確的方向。

取同一模擬馬鈴薯樣品,按照試驗方法平行處理6份并測定,結果顯示,MH的保留時間、測定值和峰面積的RSD分別為0.15%,3.8%,3.4%,表明本方法重復性較好。

2.4.3 穩定性試驗

將2.082 mg·L-1MH標準溶液及模擬馬鈴薯樣品溶液在室溫下放置,于0,6,12,18,24 h分別進行測定。結果顯示：標準溶液中MH的保留時間和峰面積的RSD分別為1.6%,2.2%,模擬馬鈴薯樣品溶液中MH的保留時間和峰面積的RSD分別為1.3%,1.8%,說明24 h內MH的穩定性良好。

2.4.4 耐用性試驗

試驗考察了柱溫、流量和檢測波長這3個參數的耐用性。

改變柱溫為28 ℃和32 ℃,其他條件不變,對2.082 mg·L-1MH標準溶液測定6次,對模擬馬鈴薯樣品溶液測定1次。結果表明：當柱溫為28,32 ℃時,MH色譜峰與未知峰的分離度分別為1.91和2.10,均滿足分離度大于1.5的要求;6次測定的MH峰面積的RSD分別為4.0%和4.4%,精密度較好,說明柱溫為(30±2)℃時對MH的檢測沒有影響。

改變流量為0.9 mL·min-1和1.1 mL·min-1,其他條件不變,對2.082 mg·L-1MH標準溶液測定6次,對模擬馬鈴薯樣品溶液測定1次。結果表明：當流量為0.9,1.1 mL·min-1時,MH色譜峰與未知峰的分離度分別為1.95和2.03,均滿足分離度大于1.5的要求;6次測定的MH峰面積的RSD分別為3.1%和4.1%,精密度較好,說明流量為(1.0±0.1)mL·min-1時對MH的檢測沒有影響。

2.4.5 回收試驗

在模擬馬鈴薯樣品中加入MH本底值80%,100%,120%的MH標準品,即分別加入22,28,33 μL 1 014 mg·L-1MH標準儲備溶液,每個濃度水平平行加標3次,按照試驗方法進行處理和測定,計算回收率,結果如表1所示。

表1 回收試驗結果

由表1可知：MH回收率為97.9%～108%,表明本方法的準確度較高。

2.5 樣品分析

隨機從4個商家購買4份馬鈴薯樣品,按照試驗方法分析其中MH的殘留情況。結果顯示,馬鈴薯樣品中均未檢出MH(殘留量均低于檢出限),遠低于GB 2763-2019 《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》規定的馬鈴薯中MH的最大殘留量(50 μg·g-1)。

本工作提出了離子交換色譜-紫外檢測器法測定馬鈴薯中MH殘留量的方法,該方法分析快速,準確度高,重復性和穩定性均較好,可作為馬鈴薯中MH殘留檢測的通用方法,并可推廣到其他農產品如大蒜、洋蔥中MH的檢測和質量控制。