高效液相色譜-示差折光檢測器法測定復配消毒液中3種雙鏈季銨鹽的含量

睢超霞,袁 鵬,張文豪*,劉吉起,楊寧輝

(1.河南省醫學高等?？茖W校,鄭州 451191;2.河南省疾病預防控制中心,鄭州 450003)

季銨鹽是一種陽離子表面活性劑,可通過靜電力、氫鍵和疏水作用改變細胞膜通透性,抑制或破壞細胞內生物氧化、呼吸代謝,從而使蛋白酶變性,在消毒領域應用廣泛。迄今為止,國際上已開發了四代季銨鹽消毒產品[1]：第一代是單鏈烷基二甲基芐基氯(溴)化銨,其中烷基鏈碳原子數為12～16時的殺菌效果最佳;第二代是在第一代產品的苯環或氨基上進行取代反應得到的衍生物;第三代是雙烷基二甲基氯(溴)化銨,其中雙烷基碳原子數為8～10時的殺菌效果最佳,其殺菌能力遠高于單鏈季銨鹽的;第四代是第三代雙鏈季銨鹽與單鏈季銨鹽、聚六亞甲基雙胍、乙醇、戊二醛等消毒成分的復配產品,其殺菌效果較傳統的單配方季銨鹽消毒產品增強2～8倍,逐漸成為市場上的主流產品。

復配消毒液具有合成工藝簡單、氣味小、對新型冠狀病毒殺滅效果好等優點,廣泛應用于新型冠狀病毒的預防性消毒[2]。為保障消毒效果,需要建立合適的檢測方法測定復配消毒液中雙鏈季銨鹽的含量。傳統的容量分析法(銀量法或四苯硼鈉法)常應用于單配方消毒液中雙鏈季銨鹽含量的測定,而復配消毒液成分復雜,干擾多,采用該方法時得到的測定結果偏差較大[3]。液相色譜法采用分離后測定的模式,可用于復配消毒液成分的檢測[4]。文獻[5]和文獻[6]采用高效液相色譜法,以通用型蒸發光散射檢測器測定消毒液中雙鏈季銨鹽的含量,缺點是線性范圍較窄,檢測結果的準確度和重現性較差;此外,蒸發光散射檢測器需要額外配備氮氣發生裝置,氣體壓力波動易造成基線漂移或出現鬼峰。高效液相色譜-串聯質譜法[7]和離子色譜法[8]也應用于季銨鹽含量的測定,但昂貴的儀器和復雜的操作限制了其在基層實驗室的應用。示差折光檢測器是基層實驗室普遍配備的通用型檢測器。因此,本工作提出了高效液相色譜-示差折光檢測器法測定復配消毒液中二癸基二甲基氯化銨、二辛基二甲基氯化銨、辛基癸基二甲基氯化銨等3種雙鏈季銨鹽含量的方法,為復配消毒液中雙鏈季銨鹽化學成分的檢測提供方法參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀,配1260 Infinity II示差折光檢測器;CT15RE型高速離心機;BP211D型電子天平;PB-10型酸度計;PS3200型超聲波振蕩器;LL1C61型純水機。

混合標準儲備溶液：采用四硼酸鈉滴定法[9]測定二癸基二甲基氯化銨、辛基癸基二甲基氯化銨、二辛基二甲基氯化銨標準品的質量分數,分別為97.2%,98.7%,98.3%;取102.9 mg二癸基二甲基氯化銨、101.3 mg辛基癸基二甲基氯化銨、101.7 mg二辛基二甲基氯化銨等3種雙鏈季銨鹽標準品,用流動相溶解并定容至100 mL,配制成3種目標物質量濃度均為1 000 mg·L-1的混合標準儲備溶液,于4 ℃冰箱保存。

混合標準溶液系列：分別取0.50,1.00,3.00,5.00,10.00 mL混合標準儲備溶液,用流動相稀釋并定容至10 mL,搖勻,配制成質量濃度為50,100,300,500,1 000 mg·L-1的混合標準溶液系列。

二癸基二甲基溴化銨、辛基癸基二甲基氯化銨、二辛基二甲基氯化銨、丁烷磺酸鈉標準品的純度均不小于98.0%;二癸基二甲基氯化銨標準品的純度不小于95.0%;乙腈為色譜純;試驗用水為超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)。

1.2 儀器工作條件

Welchrom C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫30 ℃;流動相為體積比70…30的乙腈-0.01 mol·L-1丁烷磺酸鈉溶液的混合溶液(pH 3.5),等度洗脫;流量1.0 mL·min-1;進樣量10.0 μL;示差折光檢測器,折射率單位(RIU)模式,溫度30 ℃。

1.3 試驗方法

取5.0 mL復配消毒液樣品,用流動相稀釋至50 mL,超聲10 min,靜置至室溫,用0.45 μm尼龍濾膜過濾,濾液按照儀器工作條件進行測定。以色譜保留時間定性,標準曲線外標法定量。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 檢測器

常見的單鏈季銨鹽,如十二烷基二甲基芐基溴化銨含有芐基基團在260 nm附近出現芐基生色團的特征紫外吸收峰(圖1中曲線1),因此采用液相色譜-紫外檢測器法可以測定單鏈季銨鹽的含量[10]。復配消毒液中常用的雙鏈季銨鹽有二癸基二甲基氯化銨、二癸基二甲基溴化銨、辛基癸基二甲基氯化銨、二辛基二甲基氯化銨等。以二癸基二甲基溴化銨為例,該化合物是飽和單鍵碳氫化合物,只能產生σ→σ*躍遷,在紫外-可見光區沒有吸收峰(圖1中曲線2),也無熒光信號,因此無法采用液相色譜-紫外檢測器法或熒光檢測器法進行檢測,需要選擇通用型檢測器。

1-十二烷基二甲基芐基溴化銨;2-二癸基二甲基溴化銨圖1 單鏈和雙鏈季銨鹽的紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 UV-Vis absorption spectra of single-chain and double-chain quaternary ammonium salts

復配消毒液中雙鏈季銨鹽的含量較高(質量濃度大于1.0 g·L-1),無需采用靈敏度高、價格昂貴的蒸發光散射檢測器或質譜檢測器。示差折光檢測器是根據物質折射率的差異進行測定,優點是通用性強、操作簡便,適用于常量分析,并且價格便宜、普及性高,適宜在基層實驗室推廣。因此,試驗選擇采用示差折光檢測器測定雙鏈季銨鹽的含量。

2.1.2 流動相

采用高效液相色譜法檢測時,極性季銨鹽陽離子在非極性C18色譜柱上不易被保留,易出現與樣品雜質共流出的現象;同時季銨鹽陽離子與色譜柱固定相表面殘存的帶負電荷的硅羥基相互作用,吸附在固定相表面,造成色譜峰拖尾。在流動相中加入烷基磺酸鈉離子對試劑,使磺酸根陰離子基團與季銨鹽陽離子基團結合形成電中性的離子對,增加其在非極性固定相中的溶解度,增強極性離子的色譜保留,從而達到改善色譜分離效果的目的。因此,試驗對比了丁烷磺酸鈉對二癸基二甲基溴化銨色譜保留行為的影響,結果如圖2所示。

圖2 丁烷磺酸鈉對二癸基二甲基溴化銨色譜保留行為的影響Fig.2 Effect of sodium butane sulfonate on chromatographic retention behavior of didecyl dimethyl ammonium bromide

由圖2可知：加入丁烷磺酸鈉離子對試劑后,二癸基二甲基溴化銨保留時間從6.35 min延長到11.23 min,色譜峰拖尾現象消失。

試驗以混合標準溶液為待測對象,通過比較峰形、分離度及噪聲等進一步優化流動相。與甲醇相比,以乙腈為有機相時,相同條件下噪聲信號更低。離子對試劑是表面活性劑,流動相中離子對試劑的濃度一般為0.005～0.02 mol·L-1,濃度過高會對色譜柱固定相造成損傷;當丁烷磺酸鈉濃度為0.01 mol·L-1時,目標物具有合適的保留時間,且峰形良好。一般C18色譜柱的酸度適用范圍為pH 2.0～10.0,弱酸環境有利于目標物的分離,流動相pH低于2.0時會造成色譜柱的損壞;當流動相酸度為pH 3.5時,目標物分離度較好。流動相組成改變會影響物質的折射率,采用示差折光檢測器時不適用于梯度洗脫;試驗改變有機相與水相的比例, 觀察3種目標物的保留時間和分離度; 當有機相與水相體積比為70…30時,3種目標物可在15 min內完全分離,并且分離度大于1.5。

綜上分析,試驗最終選擇的流動相為體積比70…30的乙腈-0.01 mol·L-1丁烷磺酸鈉溶液的混合溶液(pH 3.5)。

2.1.3 色譜柱、柱溫和檢測器溫度

試驗分別考察了Welchrom C8(250 mm×4.6 mm,5 μm)和Welchrom C18兩種烷基色譜柱分離3種雙鏈季銨鹽的效果。結果表明,兩種色譜柱均能分離3種雙鏈季銨鹽,但Welchrom C18色譜柱的柱效更高。因此,試驗選用Welchrom C18色譜柱。

示差折光檢測器的信號對溫度變化較敏感,這可能會影響檢測結果的重現性。實驗室溫度恒定為25 ℃,柱溫比室溫高時更易控制,但由于介質的折射率隨溫度升高而降低,柱溫過高會導致靈敏度下降,因此試驗設置柱溫為30 ℃。同時,為避免檢測器溫度與柱溫差異較大造成信號偏差,試驗選擇的檢測器溫度為30 ℃。

2.2 專屬性試驗

按照儀器工作條件對混合標準溶液和戊二醛復配二癸基二甲基氯化銨消毒液進行測定,典型色譜圖見圖3。

圖3 典型色譜圖Fig.3 Typical chromatograms

由圖3可知,3種雙鏈季銨鹽分離效果較好,無拖尾現象,并且復配消毒液中的其他成分對目標物的檢測不造成干擾,說明本方法專屬性良好。

2.3 標準曲線、檢出限和測定下限

預試驗發現復配消毒液樣品無明顯基質效應,標準曲線與工作曲線斜率比為0.98～1.02,因此采用過程簡單的標準曲線法定量。按照儀器工作條件對混合標準溶液系列進行測定,以3種雙鏈季銨鹽的質量濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示：3種雙鏈季銨鹽標準曲線的線性范圍均為50～1 000 mg·L-1,線性回歸方程和相關系數見表1。

表1 線性參數、檢出限和測定下限

逐級稀釋混合標準溶液系列,觀察待測組分信噪比(S/N),分別以信噪比為3,10時對應的質量濃度為檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結果見表1。

2.4 精密度和回收試驗

取復配消毒液樣品1.0 mL,對其進行低、中、高等3個濃度水平的加標回收試驗(用流動相稀釋到10 mL),每個濃度水平平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表2。

表2 精密度和回收試驗結果(n=6)

由表2可知,3種雙鏈季銨鹽的回收率為91.0%～105%,測定值的RSD為1.3%～2.2%,表明本方法具有較好的精密度和準確度。

2.5 方法對比

分別采用本方法和高效液相色譜-蒸發光散射檢測器法[Welchrom C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫35 ℃;流動相A為0.1%(體積分數)三氟乙酸溶液,B為乙腈;流量1.0 mL·min-1;進樣量10.0 μL。梯度洗脫程序：0～1.0 min,A為55%;1.0～25.0 min,A由55%降至0;25.0～25.1 min,A由0跳轉至55%,保持2.0 min。霧化溫度50 ℃;蒸發溫度50 ℃;氣體流量1.6 L·min-1]對同一復配消毒液樣品中的二癸基二甲基氯化銨進行7次重復測定,采用獨立樣本t檢驗比較兩種方法是否有顯著性差異。結果顯示,二癸基二甲基氯化銨測定值分別為1.06～1.18 g·L-1(本方法)和1.10～1.19 g·L-1(高效液相色譜-蒸發光散射檢測器法),兩組測定結果t值為1.85,P值為0.089,表明兩種方法無顯著性差異。

本工作提出了高效液相色譜-示差折光檢測器法測定復配消毒液中3種雙鏈季銨鹽含量的方法,該方法專屬性好、方便快速、穩定性和重復性高,適用于復配消毒液中常量雙鏈季銨鹽的測定。