Cp2-EPS對鹽脅迫下紫花苜蓿苗期形態及光合特性的影響

陳海雁,黃 榮,趙 亮,楊 杰,謝金晶,張振粉

(甘肅農業大學草業學院草業生態系統教育部重點實驗室,甘肅 蘭州 730070)

土壤鹽漬化已成為影響資源和環境生態問題的主要因素之一,據報道,全球接近20%的耕地和50%的灌溉地受到鹽分影響[1]。同時,人類活動所帶來的全球變暖以及人類反復循環的灌溉加上高水平的施肥進一步加劇了土壤鹽漬化,尤其是在干旱和半干旱地區[2-3]。而鹽脅迫是造成植物生長和生產力下降的有害非生物環境因子之一,高濃度的鹽(尤其是NaCl)可誘導氧化脅迫、滲透脅迫和離子毒性等,進而影響植物的正常生長,降低作物的產量和品質[4-6]。因此,應對鹽脅迫是當前農業生產的重要任務之一。

胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)是一些特殊微生物在生長代謝過程中分泌到細胞外的水溶性高分子聚合物[7],因其具有豐富的物理、化學性質和生物活性,如穩定性、生物降解性、無毒、抗氧化活性和離子螯合等,在環境和農業的可持續發展中顯示出良好的應用潛力[8-9]。已有研究證實微生物EPS通過螯合土壤中的Na+、激活植物生理代謝機制、維持微生物與植物的共生關系、提高土壤肥力等途徑,促進植物生長并抵御各種逆境脅迫(鹽和干旱等)[10-13]。例如,圓褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)C5和C9產生的EPS通過增加K+/Na+比以及脯氨酸含量促進鹽脅迫下玉米(Zeamays)的生長[14];銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PF23產生的EPS作為滲透保護劑保護向日葵(Helianthusannuus)免受過量的鹽脅迫傷害[15];杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)產生的EPS通過增加抗氧化酶活性來提高番茄(Lycopersiconesculentum)的耐鹽性[16]。此外,與動植物多糖相比,微生物多糖培養周期短、成本低和產量大[17],因此,微生物EPS是一種具備良好潛能的新型生物源大分子物質。桃色歐文氏菌(Erwiniapersicina)Cp2菌株能在金氏B培養基上產生大量黏液狀EPS,且廣泛存在于自然環境中。前期我們的研究發現該菌所產生的EPS能夠促進紫花苜蓿種子的萌發,但目前關于其對紫花苜蓿苗期抗鹽性的影響尚未可知。

紫花苜蓿(Medicagosativa)是我國重要的豆科牧草之一,它的優質高產以及可持續發展直接關系到家畜產業的高質量發展,而土壤鹽漬化是影響苜蓿產量的限制性因素之一[18-19]。研究表明,不同的鹽脅迫濃度處理下,紫花苜蓿苗期的生長速度和地上生物量均顯著下降,且下降速度與鹽濃度成正比[20]。此外,鹽脅迫還會導致苜蓿幼苗光合效率差,嚴重影響其后期的群體大小和產量形成[21]。所以,提高紫花苜蓿在苗期的耐鹽性對其后期栽培的產量和質量具有極其重要的意義。目前,對于紫花苜?？果}性的研究多集中在外源添加植物生長調節劑(如褪黑素、赤霉素和甜菜堿[21-23])以及接種根際促生菌(如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和根瘤菌(Rhizobium)[24-25])等方面,而添加微生物的次生代謝物質(如EPS)提高苜?？果}性的研究較少?；诖?本試驗在前人研究的基礎上,探究桃色歐文氏菌Cp2產生的EPS對紫花苜蓿苗期耐鹽性的調控作用,以期為開發一種新型微生物源制劑并促進紫花苜蓿在鹽堿地的生長提供一定的實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試紫花苜蓿品種:紫花苜?！弈?51’,由甘肅農業大學牧草種質資源實驗室提供。

供試胞外多糖:提取自桃色歐文氏菌Cp2,由甘肅農業大學牧草病理學實驗室提供。

1.2 試驗設計

1.2.1鹽濃度篩選 選取籽粒健康飽滿、大小基本一致苜蓿種子數粒,于75%的酒精中浸泡1 min后轉入1%的次氯酸鈉(NaClO)溶液中浸泡5 min,之后用蒸餾水反復沖洗4～5次。種子消毒后置于鋪兩層濾紙的培養皿中,20℃恒溫條件下暗培養4 d,挑選已發芽且長勢一致的紫花苜蓿轉移至裝有等量已高溫滅菌細沙(121℃、高溫滅菌21 min)的育苗杯(直徑9 cm、高13 cm)中,然后將育苗杯擺放在水培盒中,置于光照培養室(每天光照16 h,晝夜溫度分別為23℃,20℃,相對濕度為55%)中培養。培養至出現真葉后,用Hoagland營養液澆灌(每3 d更換一次營養液)進行強化。每杯保留長勢一致的幼苗6株,3周后進行鹽脅迫處理。共設置6個處理0,50,100,150,200和250 mmol·L-1NaCl,用Hoagland營養液配置不同濃度的NaCl。每個處理6個重復,鹽處理2周后,根據株高和根長,確定后期鹽脅迫處理濃度。

1.2.2鹽和Cp2-EPS復合處理 試驗共設置6個處理:0 mmol·L-1NaCl(CK);100 mmol·L-1NaCl(T0);100 mmol·L-1NaCl+0.5 g·L-1Cp2-EPS(T1);100 mmol·L-1NaCl+1.0 g·L-1Cp2-EPS(T2);100 mmol·L-1NaCl+1.5 g·L-1Cp2-EPS(T3);100 mmol·L-1NaCl +2.0 g·L-1Cp2-EPS(T4)。幼苗前期培養條件同上,待其生長三周后分別用不同濃度的EPS溶液澆灌幼苗根際,對照澆灌等量的營養液。除CK外,其他處理均用含100 mmol·L-1NaCl的Hoagland營養液配置,每個處理6個重復,鹽處理2周后,分別取樣測定各項指標。

1.3 相關指標測定

1.3.1生長指標的測定 株高和根長:每處理隨機選取6株幼苗,用直尺進行測量。

莖粗:每處理隨機選取6株幼苗,用游標卡尺進行測量。

鮮重和干重:每處理隨機選取6株幼苗,將其地上和地下部分開,用蒸餾水沖洗干凈,擦干水分,分別稱取地上鮮重和地下鮮重,然后于105℃殺青15 min,70℃烘干72 h,分別稱取地上干重和地下干重。

根系形態指標:從各處理中隨機選取幼苗6株,保留根系通過根系掃描儀(Epson Expression)獲取圖像,然后用Win-RHIZO根系分析軟件(Regent Istruments Canada Ine)進行分析。

1.3.2光合指標的測定 用95%乙醇浸提法[26]測定葉綠素含量。稱取0.1 g新鮮葉片,放入10 mL離心管中,加入5 mL95%乙醇,黑暗下浸提48 h至葉片呈白色,于665,649和470 nm下測定OD值。

使用便攜式光合儀(GFS-3000,Heinz Walz GmbH,Effeltrich,Germany)在上午9∶00—11∶00之間測量植物同一部位葉片的凈光合速率(Pn),氣孔導度(Gs),胞間CO2(Ci)和蒸騰速率(Tr)。

1.3.3葉片相對含水量和相對電導率的測定 葉片相對含水量采用烘干法[27]測定。稱取新鮮葉片m1,然后將其浸入蒸餾水24 h后吸干表面水分,再次稱重,記為m2。隨后將葉片置于70℃烘箱中烘干,稱取干重m3。

(1)

葉片相對電導率采用電導儀法[28]測定。準確稱取0.1 g新鮮葉片,置于含有10 mL去離子水的玻璃試管中,于室溫下浸泡20 h后用電導儀測定電導率R1,然后沸水浴加熱30 min后冷卻至室溫并搖勻,再次測定電導率R2,同時測定去離子水的電導率R0。

(2)

1.3.4耐鹽性綜合評價 利用主成分分析將Cp2-EPS處理對鹽脅迫下紫花苜蓿苗期生長的18個指標進行降維后,用隸屬函數法[29-30]進行Cp2-EPS處理對紫花苜蓿耐鹽性的綜合評價。

各處理綜合指標隸屬函數值:

(3)

Xj表示第j個綜合指標;Xjmin表示第j個綜合指標最小值;Xjmax表示第j個綜合指標最大值。

各處理綜合指標權重:

(4)

wj表示第j個綜合指標在所有綜合指標中重要程度即權重;Pj為第j個綜合指標貢獻率。

各處理耐鹽性綜合評價:

(5)

D值為各處理的耐鹽性綜合評價值。

1.4 數據分析

用Microsoft Excel 2019和SPSS 26.0軟件對數據進行整理分析并作圖,使用Duncan法對差異顯著性進行多重比較(P<0.05)。使用SPSS 26.0進行主成分分析。

2 結果分析

2.1 鹽脅迫處理對苗期紫花苜蓿生長的影響

由圖1可知,50 mmol·L-1NaCl濃度處理下,紫花苜蓿的株高和根長與對照相比差異不顯著,而100～250 mmol·L-1NaCl濃度處理下,苜蓿的株高和根長均較對照顯著降低(P<0.05),說明100 mmol·L-1以上濃度的鹽會顯著影響苜蓿幼苗的生長發育,因此選用100 mmol·L-1NaCl脅迫濃度進行后期試驗。

圖1 鹽脅迫處理下苜蓿幼苗的株高、根長和生長表型Fig.1 Plant height,root length and growth phenotype of alfalfa seedlings under salt stress注:不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05),下同Note:Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05),the same as below

2.2 Cp2-EPS處理下苗期紫花苜蓿的生長表型

如圖2所示,與CK相比,T0處理顯著抑制紫花苜蓿幼苗的生長(P<0.05),其株高、莖粗和根長分別降低了44.90%,45.04%和22.43%。NaCl處理下,隨著EPS濃度的增大,紫花苜蓿的株高、莖粗和根長均呈先上升后下降的趨勢。與T0相比,T1～T3處理苜蓿的株高和莖粗均顯著增加(P<0.05),株高分別增加了20.87%,49.95%和39.01%;莖粗分別增加了20.81%,27.60%和22.29%,且均在T2處理下達到最大值;而T4處理的株高較T0顯著降低了11.34%(P<0.05),莖粗較T0差異不顯著(圖2A,2B)。T2～T4處理下根長顯著增加(P<0.05),分別增加了36.00%,41.64%和19.82%,且在T3處理下達到最大值;T1處理的根長較T0差異不顯著(圖2C)。

圖2 Cp2-EPS處理下苜蓿幼苗的株高、莖粗、根長和生長表型Fig.2 Plant height,stem diameter,root length and growth phenotype of alfalfa seedlings under Cp2-EPS treatment注:CK表示蒸餾水對照;T0表示100 mmol·L-1NaCl脅迫;T1,T2,T3,T4表示在100 mmol·L-1NaCl溶液中分別添加0.5,1.0,1.5,2.0 g·L-1Cp2-EPS處理Note:CK indicates distilled water control;T0 stands for 100 mmol·L-1NaCl coercion;T1,T2,T3,T4 mean at 100 mmol·L-1NaCl solution added 0.5,1.0,1.5,2.0 g·L-1Cp2-EPS treatment

2.3 Cp2-EPS處理下苗期紫花苜蓿的根系形態

如表1所示,與CK相比,T0顯著降低了紫花苜蓿的總根表面積、總根體積和根尖數(P<0.05),分別減小了48.58%,48.37%和36.16%,平均根直徑較CK增大了10.96%。NaCl脅迫處理下,隨著EPS濃度的增大,紫花苜蓿的總根表面積、總根體積和根尖數均呈先增后減的趨勢,平均根直徑呈先減后增的趨勢。與T0相比,T3處理下紫花苜蓿平均根直徑最小,較T0降低了8.96%;T2處理下總根表面積和總根體積均達到最大值,分別較T0增加了66.99%和57.43%(P<0.05)。T1處理下的根尖數最大,較T0增加了79.79%(P<0.05)。

表1 Cp2-EPS處理下苜蓿幼苗的平均根直徑、總根表面積、總根體積和根尖數Table 1 Average root diameter,root surface area,root volume,and tips number of alfalfa seedlings under Cp2-EPS treatment

2.4 Cp2-EPS處理下苗期紫花苜蓿的鮮重和干重

如圖3所示,與CK相比,T0顯著降低了紫花苜蓿幼苗的鮮重和干重(P<0.05),其地上鮮重(圖3A)、地下鮮重(圖3B)、地上干重(圖3C)和地下干重(圖3D)分別降低了62.00%,41.86%,57.02%和37.76%。NaCl處理下,隨著EPS濃度的增大,紫花苜蓿的地上鮮干重和地下鮮干重均呈先上升后下降的趨勢。與T0相比,T1～T3處理下地上鮮干重均顯著增加(P<0.05),地上鮮重分別增加了42.27%,68.44%和48.37%,地上干重分別增加了21.39%,72.41%和55.30%,且均在T2處理下達到最大值。地下鮮干重在T1～T3處理下均顯著增加(P<0.05),地下鮮重分別增加了50.80%,64.73%和63.27%,地下干重分別增加了34.91%,53.20%和56.55%,且分別在T2和T3處理下達到最大值;而T4處理下的地上鮮干重和地下鮮干重均較T0差異不顯著。

圖3 Cp2-EPS處理下苜蓿幼苗的鮮重和干重Fig.3 Fresh and dry weight of alfalfa seedlings under Cp2-EPS treatment

2.5 Cp2-EPS處理下苗期紫花苜蓿的葉綠素含量

如圖4所示,與CK相比,T0使紫花苜蓿葉片葉綠素a(圖4A)、葉綠素b(圖4B)和總葉綠素含量(圖4C)顯著降低(P<0.05),分別降低了8.12%,28.23%和15.59%。與T0相比,T1～T3處理均能不同程度地緩解鹽脅迫對紫花苜蓿幼苗葉綠素含量的抑制(P<0.05),其中葉綠素a含量分別增加了5.21%,12.53%和10.98%;葉綠素b含量分別增加了14.84%,28.34%和19.42%;總葉綠素含量分別增加了8.25%,17.53%和13.65%;且均以T2處理效果最佳,其次是T3處理。T4處理下的葉綠素a、總葉綠素含量均較T0顯著降低(P<0.05),分別降低了7.27%和5.57%。

圖4 Cp2-EPS處理下苜蓿幼苗的葉綠素含量Fig.4 Chlorophyll content of alfalfa seedlings under Cp2-EPS treatment

2.6 Cp2-EPS處理下苗期紫花苜蓿的光合指標

如圖5所示,與CK相比,T0處理下紫花苜蓿葉片的凈光合速率Pn(圖5A)、蒸騰速率Tr(圖5B)和氣孔導度Gs(圖5C)均顯著降低(P<0.05),分別降低了34.53%,17.36%和12.94%;而胞間CO2濃度Ci顯著增加(P<0.05),增加了19.92%(圖5D)。與T0相比,T1～T3處理均能不同程度地緩解鹽脅迫對紫花苜蓿幼苗Pn,Tr和Gs的抑制(P<0.05),其中Pn和Gs均在T2處理下達到最大值,分別增加了49.53%和12.73%;Tr在T3處理下達到最大值,增大了20.22%;Ci在T2處理下最小,較T0減小了9.65%。而T4處理下的Pn,Tr和Gs均較T0顯著降低(P<0.05),Ci較T0顯著增加(P<0.05)。

圖5 Cp2-EPS處理下苜蓿幼苗的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度和胞間CO2濃度Fig.5 Net photosynthetic rate,transpiration rate,stomatal conductance and intercellular CO2 concentration of alfalfa seedlings under Cp2-EPS treatment

2.7 Cp2-EPS處理下苗期紫花苜蓿的相對含水量和相對電導率

如圖6A所示,與CK相比,T0處理導致紫花苜蓿葉片的相對含水量顯著降低(P<0.05),降低了33.92%。與T0相比,T1～T3處理下苜蓿葉片的相對含水量均顯著升高(P<0.05),其中T2處理下的相對含水量最高,較T0增大了22.35%,其次是T3處理,與T2處理差異不顯著,且均達到了CK的水平;而T4處理下的相對含水量較T0降低。

圖6 Cp2-EPS處理下苜蓿幼苗的相對含水量和相對電導率Fig.6 Relative water content and relative conductivity of alfalfa seedlings under Cp2-EPS treatment

如圖6B所示,與CK相比,T0處理導致紫花苜蓿葉片的相對電導率顯著升高(P<0.05),是CK的3.41倍。與T0相比,T1～T3處理下苜蓿葉片的相對電導率均顯著降低(P<0.05),分別降低了34.52%,52.74%和48.80%,其中T2處理下的相對電導率最低,其次是T3處理,且均達到了CK的水平;而T4處理下的相對電導率較T0升高。

2.8 綜合評價

采用主成分分析法,將NaCl脅迫下紫花苜蓿苗期生長的18個指標分為了2個主成分(表2)。其中第1主成分特征值為15.614,貢獻率為86.742%,第2主成分特征值為1.114,貢獻率為6.190%,二者累計貢獻率達到了92.932%。

表2 各綜合指標系數及貢獻率Table 2 Coefficient and contribution rate of each comprehensive index

根據公式(3)得到2個主成分的各處理隸屬函數值;結合2個主成分的貢獻率,由公式(4)得到2個主成分的權重;然后利用公式(5)得到各處理的綜合評價值。隸屬函數綜合評價值越大,說明Cp2-EPS緩解苜蓿幼苗鹽脅迫的效應越強。結果顯示,T1～T3處理均能在不同程度上緩解紫花苜蓿受到的鹽脅迫,且T2(1.0 g·L-1Cp2-EPS)處理對100 mmol·L-1NaCl脅迫下紫花苜蓿種子萌發和幼苗生長的緩解效果最佳。綜合評價結果為:CK>T2>T3>T1>T0>T4(表3)。

表3 各處理綜合指標值、權重、隸屬函數值、D值及綜合評價Table 3 The comprehensive indicator values,index weight,membership function value,D values and comprehensive evaluation of each treatment

3 討論

苗期是紫花苜蓿整個生長周期中的關鍵階段,遭受鹽脅迫后會導致幼苗長勢弱,根系變少變短,進而影響其后期的生長發育及產量和品質[31]。生長量是植物對鹽脅迫響應的綜合體現,也是對鹽脅迫的綜合反應[32]。而根系作為植物最先感受到鹽脅迫信號的器官,是提高植物耐鹽性的關鍵,根系的發育對于植物從土壤中獲取水分和營養并由此增加蒸騰過程中損失的水分的補充率是極其重要的[33-34]。本研究中,鹽脅迫顯著抑制苜蓿植株的高度、莖粗、地上鮮干重、地下鮮干重和根系的發育。目前,已有不少研究證實微生物EPS在植物耐鹽性形成過程中發揮著重要作用[10-11,35]。本試驗結果顯示,添加0.5～1.5 g·L-1Cp2-EPS后有效緩解鹽脅迫導致的紫花苜蓿生長能力受阻,而這種生長促進作用可能是由于EPS作為一種天然抗氧化劑具有清除植物中鹽誘導的活性氧(ROS)的能力[17],Alami等[11]在向日葵、Atouei等[36]在小麥(Triticumaestivum)和Awad等[37]在玉米幼苗中也有類似的研究結果。Chen等[38]的研究還發現EPS可以刺激番茄體內的幾種植物激素信號傳導途徑,如生長素、脫落酸等,從而促進番茄在鹽脅迫環境中生長。此外,添加0.5～1.5 g·L-1Cp2-EPS后的幼苗根系生長明顯較好并且側根明顯增加,從而能夠更好地獲取水和營養,這可能是EPS作為生物膜附著在根系表面形成物理屏障,幫助根系抵御鹽分的傷害[39],Liu等[40]的研究結果與此一致。同時,我們還發現高濃度(2.0 g·L-1)Cp2-EPS會抑制苜蓿幼苗的根系和地上部的生長。艾力江·麥麥提等[41]也發現過高濃度(20 mmol·L-1)的海藻糖反而會加重鹽脅迫對甜瓜(Cucumismelo)幼苗的傷害,與本試驗結果類似。

葉綠素是光合作用所必需的,而光合能力降低是植物在鹽脅迫下生長抑制的主要原因[42]。在本研究中,鹽脅迫顯著降低了紫花苜蓿的葉綠素含量,而經過0.5～1.5 g·L-1Cp2-EPS處理后,苜蓿的葉綠素含量顯著升高,表明適宜濃度的Cp2-EPS能緩解鹽脅迫導致的葉綠素降解,原因可能是EPS維持了鹽脅迫下細胞的氧化還原平衡,從而減弱了鹽分對葉綠素合成的干擾[43],這與張成冉等[44]利用糖(葡萄糖、殼聚糖和海藻糖)減輕鹽脅迫對玉米幼苗葉綠素含量抑制的結果一致。此外,凈光合速率的降低還與細胞內CO2的可用性降低有關,而光合CO2的固定受氣孔限制和非氣孔限制因素的調節,鹽脅迫期間植物采用氣孔關閉的適應性措施,使蒸騰期間的水分損失最小化[45-46]。本研究中,鹽脅迫下苜蓿葉片中凈光合速率的減少與苜蓿胞間CO2含量的增加有關。當經過0.5～1.5 g·L-1Cp2-EPS處理后,苜蓿葉片的凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導度均顯著高于鹽處理,而胞間CO2濃度顯著低于鹽處理。這說明適量施用Cp2-EPS可以有效改善氣孔的功能,使植物在鹽脅迫下重新打開氣孔,有助于增強鹽脅迫下植物的光合作用。

葉片相對含水量的高低能夠反映植物抵御鹽脅迫引起的生理干旱水平[21]。相對電導率能夠鮮明的反映出植物葉片細胞膜的損傷程度,其值較低時表明植物細胞膜因鹽脅迫引起的損傷越低,抵抗鹽脅迫的能力越強[47]。本研究中,鹽脅迫使紫花苜蓿葉片相對含水量顯著降低,相對電導率顯著升高,可能是鹽脅迫誘導植物體內的滲透脅迫,導致葉片中的含水量降低,對細胞膜和細胞器具有破壞性影響[48]。有研究指出微生物EPS是清除自由基并保護植物免受ROS引起的脂質過氧化的有效抗氧化劑[17]。本研究中,添加0.5～1.5 g·L-1Cp2-EPS后,幼苗則顯示出較高水平的相對含水量和較低水平的相對電導率,這與尹雅潔等[49]在水稻(Oryzasativa)上的研究結果類似。此外,本研究還發現,添加高濃度(2.0 g·L-1)Cp2-EPS會降低相對含水量并提高相對電導率,加劇對葉片細胞膜的損害,原因可能是苜蓿幼苗受到鹽分與高濃度Cp2-EPS的雙重脅迫,但具體原因還待進一步研究。

綜上所述,在鹽脅迫條件下,適宜濃度的Cp2-EPS可以通過增加幼苗的株高、根長、相對含水量以及葉綠素含量等來調節紫花苜蓿的生長狀況,并通過降低葉片相對電導率進而降低膜脂過氧化水平來增強苜蓿的耐鹽性。

4 結論

100 mmol·L-1NaCl脅迫嚴重抑制了紫花苜蓿苗期的生長,添加0.5～1.5 g·L-1Cp2-EPS均能在一定程度上緩解該脅迫對紫花苜蓿的毒害作用,促進紫花苜蓿幼苗地上及地下部的生長,并提高紫花苜蓿的光合作用,而高濃度(2.0 g·L-1)的Cp2-EPS反而會加重鹽脅迫對苜蓿的傷害。最后,經隸屬函數綜合分析后顯示,1.0 g·L-1Cp2-EPS對該鹽脅迫濃度下紫花苜蓿的緩解效果最好。