SNP芯片評估歐拉藏羊群體遺傳多樣性和遺傳結構

王志武，孫銳鋒，趙 鵬，郭宏宇，王 婷

（山西農業大學動物科學學院，太原 030032）

歐拉藏羊產于四川、青海、甘肅三省交界處，是青藏高原特有的品種，以放牧為主，具有較強的抗逆性。歐拉藏羊體格高，體重大，肉質性能好，對高寒草原的低氣壓、嚴寒、潮濕等自然條件和四季放牧、常年露營的放牧管理方式能夠很好地適應。歐拉藏羊頭稍長，呈銳三角形，鼻梁隆起，公母羊大多數都有角，角形呈微螺旋狀向左右平伸或略向前，尖端向外。四肢高而端正，腰背寬平，胸、臀部發育良好，尾呈扁錐形，尾長13～20 cm，公羊前胸多著生粗硬的黃褐色“胸毛”。歐拉藏羊生長發育快，育肥性能較好，屠宰率和凈肉率高，肉質好，膻味輕，能量、蛋白質含量高，脂肪和膽固醇含量低［1］。6 月齡歐拉藏羊公羔體重在35 kg 以上，母羔體重在31 kg 以上；1.5 歲公羊體重在55 kg 以上，母羊體重在42 kg以上。繁殖率為100%。歐拉藏羊具有較好的產肉性能和抗病能力，是肉羊雜交組合中較好的父本品種，在生產實踐中值得應用和推廣。

為了解決山西省飼養肉羊生產性能低、核心競爭力弱的問題，山西省農業科學院畜牧獸醫研究所羊產業技術團隊根據國內外羊產業發展趨勢和山西省自然生態條件，通過查閱資料和實地調研，選擇產于甘肅瑪曲縣的采食能力強、肉質好、適應性強的肉用綿羊品種——歐拉藏羊（被稱藏羊之王），與山西省大量養殖的小尾寒羊進行二元雜交，生產出繁殖率高、適應性強、尾巴小的雜交二代。為了評估引進歐拉藏羊的遺傳結構和遺傳多樣性，本研究利用SNP 芯片技術檢測了從甘肅省瑪曲縣引進的45 只歐拉藏羊群體的遺傳多樣性、親緣關系及家系結構，為充分利用歐拉藏羊遺傳資源，建立適應山西省飼養的肉羊雜交模式，培育生長發育快、繁殖率高、適應性強的肉羊新品系奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗中歐拉藏羊來源于甘肅省瑪曲縣歐拉鄉畜合隆國家級農牧民專業合作社。在同等飼養條件下，共選擇1 歲左右的種羊45 只，其中20 只公羊、25 只母羊，采集靜脈血液于EDTA抗凝管中，-80℃保存備用。

1.2 歐拉藏羊DNA提取和檢測

在北京康普森生物技術有限公司采用磁珠法進行DNA 的提取，使用康為世紀的CWE9600 Magbead Blood DNA Kit 試劑盒，基于硅基磁珠特異性吸附DNA的原理，用酶解法釋放血液基因組，在特定高效裂解緩沖體系中結合DNA 分子，改變環境離子強度，從而實現基因組DNA 分離純化。在2.0 mL 的裂解管中加入適量的血液樣本，并加入ProteinaseK 和BufferWL，放入渦旋混勻振蕩器振蕩30 s，56℃恒溫水浴鍋裂解40 min，每隔20 min 振蕩1 次，裂解完成后放入離心機進行瞬時離心，加入Lysate、BufferKL、MagbeadsPN 溶液，將SpintipsPack（磁棒套）插入96DW 深孔板中，運行DNA提取程序，進行gDNA 提取。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性，判定DNA是否有降解。

1.3 歐拉藏羊DNA基因組分型

在北京康普森農業科技有限公司采用Infinium TM Ovine SNP50K Genotyping Array V3 芯片進行歐拉藏羊DNA基因組的測序和分型。

1.4 SNP芯片數據質控

為了保證分析的準確性，首先使用Plink（V1.90）軟件檢查重復樣本，重復樣本判定標準如下：當樣本間DST≥0.99 時，判斷為重復樣本。DST 為兩個個體在基因組水平上體現同態的概率。本次分析未發現重復樣本。其次對樣本的檢出率進行質控，其質控標準與李隱俠等［2］報道一致。本次分析未發現檢出率低于90%的樣本，質控后剩余20 只公羊和25 只母羊進行后續分析。

1.5 歐拉藏羊群體的PCA分析

利用Plink（V1.90）進行PCA分析［3］，從聚類情況圖可以了解藏羊群體的遺傳結構。個體羊的遺傳關系越近，在PCA 圖上顯示的直線距離就越近；反之，個體羊的遺傳關系越遠，顯示的直線距離就越遠。公羊樣本用較大的紅色圓點標注出來。

1.6 歐拉藏羊群體的近交系數分析

通過計算歐拉藏羊群體基因組上的純合片段長度來進行近交系數分析，一般純合片段長度越長，表明群體家系內可能存在近交，純合片段長度越短，表明家系內親緣關系較遠，近交的可能性就越小。

1.7 歐拉藏羊群體遺傳距離與親緣關系分析

歐拉藏羊群體的遺傳距離和親緣關系分析與李隱俠等［2］報道的方法相同。本試驗使用GCTA（V1.94）軟件，計算個體間的親緣關系系數。

1.8 歐拉藏羊群體的聚類分析

主要使用對接法和參考遺傳距離矩陣對個體進行聚類分析，聚合為關系密切的和關系相對疏遠的2 個分類單元，最后把分類后的個體組成系譜圖，就能看到歐拉藏羊個體間的親疏關系［3］。

1.9 歐拉藏羊群體的家系構建分析

采用MegaX（V10.0）軟件對質控后的SNP 位點進行分析，采用鄰接法構建群體進化樹，分析歐拉藏羊群體的種公羊家系結構，計算種公羊在不同家系中的分布［4］。

2 結果與分析

2.1 歐拉藏羊DNA提取

歐拉藏羊群體的DNA 樣品提取后，經檢測可知平均濃度≥50 ng/μL。同時經1%瓊脂糖凝膠電泳后，發現其基因組DNA 條帶清晰，滿足芯片檢測要求，符合后期的試驗研究條件。

2.2 基因組DNA的基因分型和質控檢測

基因組DNA 的SNA 基因分型和質控檢測結果表明（表1 和圖1），歐拉藏羊群體的標記總數為64 734個，說明歐拉藏羊的SNP位點分析可以用50K 芯片；質控后標記總數變為57 066個，其中最多的6 170個位點分布在1 號染色體上，最少的830 個位點分布在24 號染色體上。

圖1 質控前后的SNP在各染色體上的分布

表1 SNP質量控制結果

2.3 歐拉藏羊群體的PCA分析

利用Plink（V1.90）進行成分分析，以圖的形式展示個體的聚類情況，公羊樣本用較大的紅色圓點標注出來。從圖2 可知，25 只母羊與15 只公羊的直線距離較遠，個體間遺傳關系也較遠；25只母羊與5只公羊的直線距離較近，個體的遺傳關系也較近。20 只公羊可以分為5 個聚類。其中8 只公羊的遺傳關系較近，為1個聚類；5 只公羊的遺傳關系較近，為1 個聚類；3 只公羊的遺傳關系較近，為1 個聚類；2 只公羊的遺傳關系較近，為1個聚類；另外2只公羊的遺傳關系也較近，為1個聚類。

圖2 PCA可視化結果

2.4 歐拉藏羊群體的近交系數分析

個體中ROH 片段的總長度占常染色體基因組總長的比例為ROH 的近交系數。個體中ROH 的總長越長或數量越多，該個體的近交系數就越高。從歐拉藏羊群體基于ROH 的近交系數FROH的分布圖3 可知，近交系數在0～0.05 之間的個體數目較多，且群體的平均近交系數值為0.034，說明群體的近交程度較低。

圖3 基于ROH的近交系數FROH的分布

2.5 歐拉藏羊群體親緣關系分析

2.5.1 基于G矩陣的親緣關系分析

使用全基因組標記構建的基因組關系矩陣能更真實地反映個體間的親緣關系，它比單純根據系譜信息計算的親緣關系更加準確，且更接近實際情況?；蚪M親緣關系分析可視化結果圖能夠展示兩兩個體間基因的血緣關系，顏色越接近紫色表示親緣關系越近。從歐拉藏羊群體親緣關系圖4 可以看出，歐拉藏羊群體的親緣關系均較遠。

圖4 基因組親緣關系分析可視化結果

2.5.2 遺傳距離分析

從圖5 可知，45 只歐拉藏羊之間的IBS 遺傳距離在0.211 1～0.309 7之間，平均遺傳距離為0.278 9；20只公羊間的遺傳距離在0.211 1～0.307 5 之間，平均遺傳距離0.261 6。說明歐拉藏羊群體的遺傳距離較遠，近交風險較低。

圖5 遺傳距離分析可視化結果

2.6 聚類分析

通過對歐拉藏羊個體進行系譜圖分析，可知歐拉藏羊群體共有8 個家系。歐拉藏羊群體公羊樣本聚類分析結果見圖6。

圖6 公羊樣本聚類分析結果

2.7 家系構建分析

由圖7 可知，歐拉藏羊種公羊可以劃分為8 個家系，家系1 包含9 只公羊，家系2 包含2 只公羊，家系7包含4只公羊，其余家系均為1只公羊。根據現有母羊與公羊之間的親緣關系劃分為8 個不同家系，其中25只母羊與公羊的血緣關系均較遠，分類為其他，育種時可以作為參考。

圖7 所有公母羊樣本聚類分析結果

3 討論

在育種工作中，遺傳距離可以表示不同種群或個體間的基因差異程度，具有指導親本選育的重要作用。本試驗通過對歐拉藏羊之間的IBS 遺傳距離的分析，揭示了個體間的親緣關系。結果表明，歐拉藏羊群體的遺傳距離在0.211 1～0.309 7 之間，平均遺傳距離為0.278 9；20 只公羊間的遺傳距離在0.211 1～0.307 5 之間，平均遺傳距離為0.261 6。說明歐拉藏羊種公羊和母羊之間具有適中的遺傳距離［5-6］。根據親緣關系小于0.1的標準，將種公羊劃分為8個家系，其中有5個家系分別只有1 只公羊，需要進行擴繁選育，維持血統的完整。25 只母羊與所有公羊的親緣關系系數均小于0.1，可與任何1只公羊進行配種。

群體的近交系數是表示動物群體近交程度的一個指數。從本試驗可知，歐拉藏羊群體的平均近交系數為0.034，近交程度較低。因此，為降低群體的近交增量，避免歐拉藏羊生產性能的下降，建議在同一家系內公母羊盡量不要互相配種，參考歐拉藏羊的家系構建和親緣關系分析結果，確認親緣系數后，進行合理的配種。在生產管理中要做好配種記錄，完善系譜檔案，避免因配種計劃的錯誤而導致近親交配，同時加強對歐拉藏羊的選育提高，進一步保障藏羊群體的遺傳多樣性，從而提高其品種資源利用率。

4 結論

本試驗利用SNP 50K 芯片對歐拉藏羊群體的遺傳多樣性和遺傳結構進行了分析，發現歐拉藏羊群體的遺傳多樣性較豐富，群體內近交程度較低，共有8 個家系，其中有5 個家系種公羊數量少。需要加強后代的選育和擴繁，防止血統流失，從而提高歐拉藏羊品種資源的有效利用。