安徽新安江水牛mtDNA D-Loop區遺傳多樣性與系統進化研究

趙拴平，金 海，劉 峻，李永勝，金 磊，李 倩，徐 磊，賈玉堂

（1.安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所，畜禽產品安全工程安徽省重點實驗室，合肥 230031；2.休寧縣畜牧獸醫技術推廣站，休寧 245000；3.黃山市畜牧獸醫推廣中心，黃山 245700）

自古以來，我國南方是水稻的主要種植區，水牛作為役畜在其生產中發揮了重要的作用。在系統分類學中，水牛分為亞洲水牛和非洲水牛，亞洲水牛根據其外貌、習性、生產性能等的不同，進一步分為沼澤型水牛和江河型水牛。新安江水牛屬役用及役肉兼用型，主要分布于安徽省沿新安江上游地區的休寧縣、歙縣、徽州區等地。當地地貌類型多樣，平原、崗地、丘陵和山地俱全，是安徽省內水熱帶最優越的區域，適合水牛生長，而且其獨特隔絕的自然環境避免了新安江水牛與其他品種之間發生交流。新安江水牛耐粗放、適應性強、役用性能強，善于行走。

線粒體DNA（mtDNA）遵循母系遺傳特性，其控制區D-Loop 序列變異速率為其他片段的5～10 倍，且不易發生基因重組，在家畜起源進化和群體遺傳多樣性等研究中有廣泛的應用。研究發現，沼澤型水牛和江河型水牛不僅在形態學［1］、細胞學［2-3］和蛋白質多態性［4-5］上存在較大的差異，而且有較遠的遺傳距離［6］。Ting 等［7］通過分析25 個沼澤型水牛和江河型水牛品種的121 個全基因組，發現沼澤型水牛和江河型水牛的祖先在大約23 萬年前分化，然后經歷了獨立的馴化過程。Lei 等［8-9］研究發現，中國本地水牛品種具有豐富的遺傳多樣性，中國沼澤型水牛具有兩條線粒體DNA 譜系，有2 個母系起源。Yue 等［10］通過對中國本地沼澤型水牛和江河型水牛mtDNA D-loop 區的研究，發現大部分的中國沼澤型水牛屬于A 支系，且A 支系很有可能在中國西南部馴化而成。亐開興等［11］和張自芳等［12］通過研究滇東南水牛的D-Loop區，發現滇東南水牛屬于沼澤型水牛，存在2 個母系血統來源，受河流型水?；驖B入較小。盧永芳等［13］和趙拴平等［14］通過分析安徽地區江淮水牛和東流水牛的D-Loop 區，發現江淮水牛和東流水牛遺傳多樣性豐富，且具有2 個線粒體母系來源。本研究通過分析28 條安徽新安江水牛的線粒體DNA D-Loop序列和693 條中國其他地方水牛的D-Loop 序列，探索新安江水牛群體的遺傳多態性和系統進化關系，以期為中國地方水牛種質資源保護和創新利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

在安徽省黃山市休寧縣、徽州區等新安江水牛主產區，選擇28 頭25～36 月齡、無親緣關系的水牛個體，頸靜脈每頭采血10 mL，ACD 抗凝，低溫帶回實驗室凍存于-80℃冰箱中。同時從GenBank 數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）下載24 個中國地方水牛群體693 條D-Loop 序列數據，合計25 個地方品種共721份樣本（表1）。

表1 中國25個地方水牛群體遺傳多樣性比較

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

利用天根生化科技有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒提取新安江水牛的全基因組，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和核酸分析儀檢測DNA 完整性，將檢測合格的DNA樣品使用雙蒸水稀釋至50 ng/μL冷藏備用。

1.2.2 PCR擴增和測序

新安江水牛mtDNA D-Loop 全序列利用引物DLoop-F：5'-TAGTGCTAATACCAACGGCC-3'和D-Loop-R：5'-AGGCATTTTCAGTGCCTTGC-3'［15］進行擴增。PCR反應體系25 μL，包括1 μL DNA，12.5 μL 2×Taq PCR Mix 緩沖液，正反向引物各1 μL（100 ng/μL）和去離子水。擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，32 個循環；72℃總延伸5 min。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，陽性產物進行純化與回收后委托上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.3 數據分析

利用DNASTAR 5.0 和Clustal X 軟件分析校對測序獲得的新安江水牛mtDNA D-Loop 區序列，利用DnaSP 5.10軟件［16］統計變異位點數、單倍型數、核苷酸多樣性和單倍型多樣性，利用MEGA 11.0.13 軟件［17］分析多態位點，構建Neighbor-joining 系統發生樹，利用Network10.2.0.0［18］軟件構建Media-joining網絡。

2 結果與分析

2.1 新安江水牛mtDNA D-Loop區遺傳變異分析

由表1可知，安徽新安江水牛的mtDNA D-Loop 區完整序列長度為926～933 bp，28 個新安江水牛群體中共存在117個變異位點，構成25種單倍型，其中共有單倍型包括Hap5 和Hap7，Hap5 頻率最大（10.7%，3/28），其他單倍型均為不同個體所特有。新安江水牛mtDNA D-Loop 區核苷酸多樣性為0.989±0.014，單倍型多樣性為0.026 02±0.003 03，說明其遺傳多樣性豐富。

中國25 個地方水牛群體的721 條mtDNA D-Loop序列共存在226 個變異位點，構成了224 個單倍型，核苷酸多樣性為0.018 15±0.002 42，單倍型多樣性為0.883±0.011，其中18 個單倍型在新安江水牛群體首次發現。新安江水牛群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性與其他水牛群體無顯著差異，其群體遺傳多樣性與其他水牛群體接近。

2.2 新安江水牛群體mtDNA D-Loop 區的系統進化樹分析

利用新安江水牛群體構建Neighbor-joining 系統發生樹，結果如圖1所示，25個單倍型分為A、B兩個大的支系，A 支系由21 個單倍型構成，代表24 個水牛個體，占總水牛群體的85.71%（24/28），B支系由4個單倍型構成，代表4 個水牛個體，說明新安江水牛具有A 支系和B支系2個母系來源，其中A支系占據主導地位。

2.3 基于mtDNA D-Loop 區的中國水牛群體的遺傳距離和系統進化樹分析

以肉牛（Bos taurus）（NC_006853）作為外群體參照，利用MEGA11.0.13 軟件對獲得的25 個水牛群體721 個mtDNA D-Loop 序列進行遺傳距離分析，結果如表2 所示。新安江水牛與東流水牛、江淮水牛和峽江水牛的遺傳距離最近，與廣西水牛的遺傳距離最遠，為0.054。由圖2可知，新安江水牛與中國其他地方水牛群體聚為一類，廣西水牛單獨聚為一類，可能與廣西水牛群體在長期培育過程中，有江河型水?；驖B入有關。

表2 中國25個地方水牛群體遺傳距離

圖2 25個中國地方水牛群體Neighbor-joining系統發生樹

2.4 基于mtDNA D-Loop 單倍型間的Mediajoining進化網絡分析

進化網絡圖（Network）能客觀地描述物種內不同單倍型間的遺傳進化關系，呈現物種的進化進程［19］。本研究利用DnaSP 5.10 和Network10.2.0.0 軟件構建了721 條mtDNA D-Loop 序列224 個單倍型的網絡圖，結果如圖3 所示。224 個單倍型分為A 和B 兩個支系，A 支系呈現以單倍型Hap_15 和Hap_174 為中心，周圍單倍型環繞的星狀輻射結構；B 支系包含b1 和b2 兩個亞支系，b1 支系以Hap_7 為中心，b2 支系以Hap_22 為中心，均呈現星狀輻射結構。距離A 支系和B 支系較遠的9個單倍型，代表廣西水牛的16個個體。

圖3 25個中國地方水牛群體線粒體D-Loop單倍型的Media-joining進化網絡圖

3 討論

新安江水牛主要分布于安徽省沿新安江流域上游地區，主要產區為安徽省黃山市的休寧縣、歙縣、徽州區和祁門等地。南宋羅愿所著《新安志》記載，“水牛色蒼而多力其角如環，所謂吳牛也”。安徽新安江流域雨水充沛，氣候溫和濕潤，自古以來就有種植水稻的歷史，山間水田面積小，交通不便，當地農民多飼養水牛用于耕田，水牛作為當地傳統農業不可分割的一部分，飼養歷史悠久。當地人們的傳統思想認為，牛是財富的象征。

生物群體豐富的遺傳多樣性不僅有助于適應不同的生態環境，更是其可持續穩定發展的重要基石。核苷酸多樣度和單倍型多樣度是衡量群體遺傳變異程度的重要指標，核苷酸多樣度和單倍型多樣度越高，群體的遺傳變異程度越高。本研究通過分析28 頭安徽新安江水牛mtDNA D-Loop 區的核苷酸變異，發現其群體中共存在117 個變異位點，核苷酸多樣性為0.989±0.014，單倍型多樣性為0.026 02±0.003 03；新安江水牛的單倍型多樣性高于中國其他地方水牛品種，與東流水牛、江淮水牛、濱湖水牛和廣西水牛較為接近；其核苷酸多樣度低于濱湖水牛和廣西水牛，高于其他地方水牛品種。說明新安江水牛線粒體D-Loop 區遺傳變異率較高。系統進化樹分析發現，新安江水牛具有2個母系來源（A支系和B支系），本研究結果與Lei等［8-9］所發現的中國水牛群體2 個母系遺傳起源的觀點一致。遺傳進化分析發現，新安江水牛與東流水牛（安徽）、江淮水牛（安徽）和峽江水牛（江西）遺傳距離最近，與廣西水牛遺傳距離最遠。N-J 系統發生樹顯示，新安江水牛與中國其他地方水牛群體聚為一類，說明新安江水牛屬于沼澤型水牛。進化網絡圖描述了25個水牛群體224 個單倍型的遺傳進化關系，呈現A 支系以單倍型Hap_15 和Hap_174 為中心的星狀輻射結構；亞支系b1 和b2 也具有星狀結構的特征，預示著中國水牛經歷了群體的擴張。距離A 支系和B 支系較遠的9 個單倍型，代表廣西水牛的16 個個體，與趙拴平等［14］報道的廣西水牛具有江河型水牛血統的研究結果一致。

新安江水牛是安徽優良地方水牛品種之一，是我國豐富基因庫的重要組成部分。本研究發現，新安江水牛屬于沼澤型水牛。歷史研究證明，沼澤型水牛在社會生產生活中主要用來役用，是水稻田耕作重要的勞動力［20］，與新安江流域自古以來就有種植水稻的歷史相符合。近年來，對沼澤型水牛馴化地點和時間的研究仍然存在爭議。Yue 等［10］研究認為，沼澤型水牛在中國西南地區馴化形成，而Colli 等［21］和Zhang 等［22］認為，沼澤型水牛在中國西南-東南亞邊境和泰國北部地區馴化形成。據聯合國糧食及農業組織2017 年數據統計，中國是世界3 個主要水牛飼養大國之一，共飼養水牛2 347 萬頭，占世界總頭數的11.68%［23］。近年來，由于農業產業結構調整和農村勞動力的轉移，機械逐漸取代了役用水牛，加之本土水牛缺乏完善的遺傳資源保護和利用，我國面臨著本土水牛種質資源退化，群體數量和質量大幅度下降的窘況。據統計，2022 年底具有種用價值的新安江水牛僅有4 129頭。因此，迫切需要加大對新安江水牛的保護力度，應在保種的基礎上加以開發利用。

4 結論

本試驗研究了我國安徽新安江水牛群體線粒體D-Loop 區的遺傳多樣性及系統進化關系，證明新安江水牛屬于沼澤型水牛，具有2個母系起源，其群體變異水平與中國其他地方水牛群體接近，且新安江水牛與我國其他地方水牛具有一定的遺傳距離。