mRNA藥物的結構和臨床應用

常東峰，孫召朋

石藥集團巨石生物有限責任公司，石家莊 050015

遺傳信息存在于細胞核內染色體的DNA 中，直接決定了蛋白質的合成與表達。信使RNA（messager RNA，mRNA）將DNA 上的遺傳信息傳遞出細胞核，在細胞質中的核糖體上將DNA 遺傳信息翻譯合成蛋白質［1］。

mRNA 藥物是一種整合分子生物學和免疫學的新型先進技術，屬于精準醫學的應用。mRNA的藥學概念是編碼mRNA的遺傳信息通過非病毒遞送途徑轉入細胞質中，攜帶的遺傳信息可以滿足所有功能蛋白的編碼和表達，通過蛋白質發揮治療作用，其中的功能性活性成分為mRNA分子。1990 年mRNA 首次完成藥物的概念驗證［2］。mRNA 在疫苗方面顯示出諸多優勢，如自帶佐劑特性使得不需額外的佐劑即可刺激機體產生強大而持久的免疫反應［3］；體外轉錄（in vitro transcription，IVT）使mRNA 的生產成本較低，便于快速大規模生產，如新型冠狀病毒（以下簡稱新冠病毒）大流行期間mRNA 疫苗的迅速應用［4-5］；mRNA 不需進入細胞核內，在細胞基質中即可行使功能，避免了因整合宿主基因組導致的突變［6］；能夠避免菌株、毒株難以獲取的問題。在作為治療性藥物應用時，缺乏CpG 島結構使mRNA 誘導機體產生排斥反應的可能性也較?。?］；mRNA 較短的分子壽命和內源性物質組成使機體易于將其代謝分解而不會給機體造成較大負擔［1］，與傳統的蛋白質/肽類藥物相比，mRNA 能夠連續翻譯成編碼的蛋白質/肽，從而引發長時間的表達，因此在以蛋白質表達為手段的疾病治療方面具有廣闊的應用前景和較好的療效［8］。2020 年，基于脂質體包裹的mRNA 疫苗（mRNA-1273 和BNT162b2）在緩解新型冠狀病毒癥狀方面，有效性超過90%［9］。2023年，國家藥品監督管理局批準石藥集團新型冠狀病毒mRNA疫苗（SYS6006）納入緊急使用。

了解mRNA的分子結構將有助于解析藥物功能，幫助設計藥物，解決mRNA的不穩定性和不可成藥性等問題，臨床應用將為藥物的發展提供方向和思路。

1 mRNA一級結構元件

基于mRNA的藥物通過增加mRNA分子核苷修飾和結構元件等來影響免疫反應的強度和特異性。結構元件如帽子結構（Cap）、Poly（A）尾和非翻譯區（UTRs）能夠直接影響mRNA的穩定性和翻譯效率［10］，尤其是位于mRNA 5′和3′末端的Cap和Poly（A）尾對于mRNA 在細胞質中的穩定性至關重要。mRNA 還需要開放閱讀框（open reading frame，ORF）周圍的5′UTRs和3′UTRs來增加半衰期、表達水平和翻譯效率［11］。Poly（A）尾的長度與翻譯效率相關［12］。此外，增加mRNA的G-C組分可改善mRNA 的穩定性［13］。RNA 結構、翻譯效率和蛋白質折疊機制最有可能通過稀有密碼子替換mRNA序列和插入修飾核苷酸來改變［14］。

1.1 5' Cap結構

最簡單的5' Cap結構是掉轉方向的7-甲基鳥苷三磷酸，與mRNA 5'端核苷酸通過5'ppp5'連接，形成m7GpppN 結構。復雜的Cap 結構在后面的一個或兩個核苷酸還有2'-O-甲基修飾。Cap結構的通式可寫為m7GpppN（m）pN（m）……［15］。5'Cap 結構是真核生物mRNA 在進化上非常保守的修飾。5'Cap 可募集細胞蛋白并介導加帽相關的生物學功能，例如前mRNA 加工、核輸出、帽依賴性蛋白質合成和免疫原性等［16］。

Cap 結構對穩定mRNA 及其翻譯具有重要意義，它不僅可以將5'端封閉起來，避免被核酸外切酶水解，還可作為蛋白合成系統的辨認信號，被Cap 結合蛋白（Cap binding protein）eIF-4E 識別并結合，促使mRNA與核糖體小亞基結合，進而啟動翻譯過程［16］。另外，在病毒與固有免疫的博弈中，5'Cap 的結構也極為重要。因為固有免疫系統對沒有5'Cap 結構的 RNA 具有較高的敏銳度，因此很多病毒進化出了豐富多樣的加帽策略。而對這些病毒mRNA的加帽機制研究已拓展出諸如高效體外RNA 加帽系統和自擴增 mRNA 技術，大大促進了科研型與治療型 mRNA 的大規模生產［17］。

1.2 5'非翻譯區

5'非翻譯區（5' untranslated region，5'UTR）是Cap 結構與編碼區起始密碼子之間的一段較短的序列，其中包括標志翻譯起始的序列，如原核生物的SD 序列。5'UTR 是翻譯起始的高度敏感區，其長度、二級結構以及AUG 的數量都會影響翻譯的起始效率［18］。此外，還影響mRNA 的半衰期和蛋白表達水平［19］。5'UTR 的長度一般是100～200 個核苷酸，少于20 個堿基時會錯過起始密碼子AUG，稱為遺漏掃描（leaky scanning）。過長的5'UTR 容易形成過多二級結構，不利于翻譯起始［20］，因此一般引入Kozak 序列或保持短散的設計來增強翻譯效率［21］。

1.3 編碼區

編碼區由起始密碼子AUG 開始，到終止密碼子（UAG、UGA、UAA）截止。編碼區的二級結構和密碼子選擇都可能影響翻譯效率，過多的二級結構和稀有密碼子都會降低翻譯速度，通過密碼子的優化（規避不常見/不安全組合）、核苷酸替換（使用假尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺苷等修飾核苷酸）等方法可增強mRNA 的穩定性和翻譯效率，同時減少固有免疫反應和mRNA的降解［22］。

編碼區中高GC 含量可能會影響mRNA 的二級結構，但比例較高的GC 序列比低GC 序列的翻譯效率高100 倍［23］。翻譯延伸率受同源tRNA 可及性和密碼子修飾影響，以防止匹配稀有物種的tRNA 序列并整合與更常見tRNA 物種匹配的序列［24］。此外，密碼子依賴性翻譯延伸率是mRNA穩定性的主要參數，密碼子修飾對mRNA 穩定性至關重要［25］。用相同的頻繁密碼子替換稀有密碼子會提高產量，而重復使用相同的密碼子會加速tRNA 翻譯，這是由于tRNA 在核糖體附近的氨基?；?6］。相鄰的核苷酸和密碼子也會影響翻譯速率和效率［27］。起始密碼子應包括Kozak 序列［28］，并且可以修改終止密碼子的序列［29］。此外，在正確的起始密碼子之前，mRNA 中不應存在上游起始密碼子。密碼子優化的mRNA已被有效地利用在針對病毒感染的疫苗研究中，用于表達非病毒蛋白［30］。為了進行適當的折疊，一些蛋白質需要由不常見的密碼子保證修飾來延遲翻譯［31］。mRNA 序列的密碼子選擇可顯著影響蛋白質生成速率和核糖體結合時間。研究發現，N1-甲基-假尿嘧啶核苷（1mΨ）核苷酸替換可增加堿基對的穩定性，形成復雜的二級結構和改善mRNA 的翻譯效率［32］。此外，通過修改mRNA二級結構設計，可以提高mRNA對核酸內切酶裂解和化學降解的穩定性［33］。通常首選5-甲基胞苷（m5C）和假尿嘧啶核苷（ψ）核苷酸修飾來降低免疫原性的同時提高翻譯效率［34］。

1.4 3'非翻譯區

3'非翻譯區（3'UTR）是位于終止密碼子之后的轉錄序列，是mRNA不穩定因素的集中區，可影響轉錄后修飾和翻譯過程。3'UTR 含有加尾信號，包括核心序列AAUAAA，以及下游10～30 bp處的一段富含GU 的輔助序列，這些都是導致mRNA 不穩定的常見因素［35-36］。因此，在設計mRNA 藥物時，應該避免使用這些序列，例如BioNTech 在發明專利中使用了人類β-球蛋白3'UTR 的兩個連續拷貝（2 hBg，也稱2βgUTR），以提高轉錄穩定性和翻譯效率（WO 2017/059902 Al；BioNTech RNA 制藥有限公司）［37］。研究表明，人α 和β 球蛋白的3'UTR 可以提高mRNA 的穩定性和翻譯效率，而頭尾排列的兩種人β 球蛋白的3'UTR 可以提高mRNA 的穩定性［38］。使用細胞和病毒5?UTR 和3?UTR 的不同區域可以提高mRNA的穩定性和翻譯效率。通過將富含AU 的區域插入3'UTRs可以破壞mRNA 的穩定性，反而有助于縮短蛋白質合成時間，從而確保mRNA 快速分解和短時間內持續性的蛋白質合成［39］。

1.5 Poly(A)尾結構

多數真核生物mRNA的3'端都有幾十到數百個堿基組成的Poly（A）尾［40］。成熟的mRNA 一般會在它的3'端加上長度為20～200 bp 的多聚Poly（A）尾，可以防止外切酶降解，也可以作為核膜孔轉運系統的標志，與成熟的mRNA 通過核膜孔轉運到胞漿有關［41］。然而，3'Poly（A）尾的長度在細胞核和細胞質中是受到高度調控的，不同長度的3'Poly（A）尾部可調節成熟mRNA 的穩定性、轉運和翻譯。一旦mRNA 到達細胞質，Poly（A）尾就會與5'Cap 協同，與eIF4F 復合體形成穩定的閉環結構，促進翻譯起始［42］。3'Poly（A）尾與5'Cap、內部核糖體進入位點和各種其他決定因素共同作用，調節mRNA的穩定性和翻譯效率。

3'Poly（A）尾的長度決定了mRNA 翻譯的程度。3'Poly（A）尾的縮短和延長可以很好地反映其對基因表達在時間和空間上的調控。哺乳動物細胞mRNA 分子在細胞質中含有長約250 個核苷酸（nt）的Poly（A）尾，在其一生中從3′逐漸減少。約100 nt 的 Poly（A）尾是合成mRNA 藥物的理想選擇，因為尾大小可以通過調節3′外切核降解影響mRNA 的衰變［43］。Poly（A）的長度與翻譯效率之間存在正相關關系，例如，100 nt 的 Poly（A）尾比64 nt 的 Poly（A）尾蛋白質表達水平高約35倍［44］；120 nt 的 Poly（A）尾比51 nt 和42 nt 的 Poly（A）尾更有利于形成穩定的mRNA，保證有效的翻譯［46］；325 nt 的 Poly（A）尾比172 nt 的 Poly（A）尾顯示出更高的效率［38］。然而，Poly（A）尾長度與 mRNA 翻譯效率的正相關關系并不總是成立的，在人原代T 細胞中，425 nt和525 nt的Poly（A）尾僅比120 nt的 Poly（A）尾翻譯效率高［45］。

對mRNA 的一級結構表征包括核苷酸序列、核苷酸修飾、帽子結構、Poly（A）尾和核苷酸修飾。目前，三代測序技術可以實現核苷酸堿基序列確定?；贒NA 測序技術，RNA 需逆轉錄為與之互補的DNA 進行測定，目前所用的逆轉錄酶的差錯率在10-4～10-5數量級，這對于藥物的質控可以忽略不計［46］。相對于核酸測序技術，基于酶切的高分辨質譜，包括三酶切方法和固定化RNaseT1 單酶部分酶切方法，序列覆蓋率在70%左右［47］。加帽效率、Poly（A）尾長度及分布、核苷酸修飾等特殊結構通常需要其他技術手段進行表征。例如，液相色譜-質譜聯用（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）可用于監測體外轉錄反應的進程和確定關鍵質量屬性（如5'加帽）的狀態［47-48］。在工藝優化和放大過程中，依據不同需要可以選擇不同的分析技術。在工藝表征和工藝驗證過程中，mRNA 理化性質基本是固定的，其生物活性也是固定的，mRNA 的一級結構表征鑒定方法也基本固定。mRNA 自身的不穩定性決定了在檢測時會優先考慮速度和效率，高效液相色譜的快捷性會成為一級結構表征的趨勢。

2 mRNA的高級結構

單鏈mRNA 的堆疊、氫鍵結合以及與水和離子的額外相互作用和自身的折疊形成了各種mRNA的高級結構。

2.1 mRNA的二級結構

RNA 二級結構也稱為莖環結構（stem-loop structure），包括互補堿基對構成的單鏈區結構、莖環結構以及雙鏈結構等各種不同組件形成的平面結構，并通過這些結構進行自我折疊。RNA 的二級結構一般由以下幾個基本構件組成：單鏈結構、莖、發卡環、凸環、內環以及多分支環［50-51］。

單鏈結構是RNA 分子折疊成平面結構后兩端沒有形成配對的單鏈狀結構。

莖是指堿基逆向互補配對時這些堿基對組成的集合［52］。由空出來不配對的堿基形成的環狀結構和“莖”組合成形似發夾的結構，得名為發夾環，莖至少由4個未配對堿基組成，其中5個堿基對最為穩定［52-53］。

內環是莖區的兩條單鏈上都存在的未能形成堿基對的堿基，由堿基間作用力而形成向外突出的圓環狀結構。通常發生在螺旋內的非典型堿基配對區域，并引起A型螺旋骨架的畸變，當兩條鏈上的未配對堿基數相等時，內環是對稱的［51］。

相對于內環，凸環則是由某段莖區的一條單鏈上存在著的未能形成堿基對的堿基形成的，這條單鏈上至少存在一個自由堿基。凸環的存在使得RNA 二級結構的莖區可以出現彎折現象，且凸環的存在會影響RNA的三級結構［54］。

多分支環也稱為多重環，是多個莖區和環的連接組合，二級結構中經?？梢钥吹? 個多分支環連接4個或更多的莖區［53］。

假結結構是由發夾環上堿基與發夾結構外部非莖區的堿基互補配對形成的氫鍵所組成，假結屬于三級結構的范疇。假結對RNA 的功能具有重要影響，并在RNA 參與的生命過程中起重要作用［55］。

2.2 mRNA的三級結構

三級結構是一種三維空間形式的高級結構，這種三維結構以二級結構為基礎，除了堿基配對產生的相互作用力外，分子內部還存在主鏈與主鏈間的相互作用力、主鏈與堿基間的相互作用力以及孤立氫鍵間的相互作用力等。這些相互作用力促使平面的二級結構折疊成緊湊的空間結構，通過幾個同軸螺旋堆積形成三級結構［56］。其中，內環中連續腺嘌呤堿基可以形成偽Watson-Crick堿基對（沃森克里克模型，雙鏈反向平行），這是形成穩定三級結構的基礎，當發夾或內環的互補一級序列和單鏈區域通過Watson-Crick 堿基配對相互影響時，形成假結，也可以形成兩個交替發夾結構。假結的形成通過發夾雙螺旋莖和新形成的環-環相互作用的螺旋堆疊產生延伸的螺旋區域。盡管假結僅比兩個發卡略穩定，但橋接環中未配對核苷酸與延伸螺旋內堿基對之間的相互作用（如堿基三倍）提高了三級結構的穩定性［57］。例如，三級結構中核糖拉鏈是最常見的形式［58］。此外，三級結構的穩定性要低于二級結構，其結構極易受到溫度、環境等因素的影響。

2.3 mRNA的四級結構

在RNA 及其他生物大分子三級結構基礎上，RNA 和RNA、RNA 和DNA、RNA 和蛋白質之間通過相互作用形成的復合物，即為RNA 的四級結構，這種相互作用大部分依賴Watson-Crick 堿基對。其中，核糖體就是由rRNA 和蛋白質組成的最為常見的RNA 四級結構，如Sarcin-Ricin（也稱Bulged G-Motif）結構和Kink-Turns Motif 結構。Sarcin-Ricin 結構是核糖體的高度保守結構，對于維持核糖體活性、錨定mRNA 至關重要［59］。Kink-Turns Motif 結構又稱扭結轉角，大部分扭結轉角與蛋白質結合，可以促進RNA之間的結合［60］。

mRNA 的高級結構中二級結構對于調控來說非常重要，尤其是二級結構的不同模式與編碼區域、剪接點和多腺苷酸化點相關，細胞的代謝活動過程受mRNA 二級結構的影響明顯不同，二級結構可以極大地影響三級結構。所以確定和表征mRNA 的二級結構，對分析和理解基因遺傳信息的傳遞機制至關重要。mRNA 分子的三級結構和四級結構，對遺傳信息的影響作用機理尚不完全清楚［61］。Huang等［62］嘗試過使用RNA二級和三級結構預測程序最簡單的技術，但充滿不確定性，將輸入的一級序列折疊成潛在的二級結構。這些程序都是通過計算許多堿基配對方案的自由能，找到總自由能最低的二級結構，并將最低能量電位的二級結構返回為最可能的結構。目前，這些高級結構的特性鑒定方法少有報道，mRNA 的實際結構表征方法應用仍需進一步探索。

3 mRNA的臨床應用進展

迄今為止，大多數mRNA 的臨床應用都集中在傳染病和癌癥疫苗領域（表1）。mRNA 在臨床上的應用機理基本一致，包裹編碼靶蛋白（抗原蛋白）mRNA 的脂質納米顆粒（lipid nanoparticles，LNP）在體內給藥時，LNP-mRNA 由于內吞作用被吞噬，mRNA 通過抗原呈遞細胞中的內體逃逸機制釋放到細胞質中［63］。在核糖體內部，mRNA 通過翻譯形成蛋白質，涉及的蛋白質療法使用合成的mRNA在人體內產生所需的蛋白質，如抗體、細胞因子和酶。對于疫苗，模仿病毒感染過程，細胞內產生的抗原主要引起細胞介導和抗體介導的免疫應答。

表1 臨床階段的mRNA藥物Table1 mRNA drugs in clinical phase

3.1 mRNA在傳染病上的應用

mRNA的臨床應用大都集中在傳染病領域（表1），在新冠病毒的預防上應用最多，季節性流感病毒、Epstein-Barr 病毒、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）、寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）、帶狀皰疹病毒（varicella zoster virus，VZV）也都取得了臨床進展。此外，在狂犬病毒、埃博拉病毒、登革熱病毒和猴痘病毒等預防方面均取得了積極效果［64-66］。針對鏈球菌、銅綠假單胞菌、肺結核桿菌和金黃色葡萄球菌等細菌性傳染病也顯示出潛在的實驗效果［67-69］。在預防寄生蟲，如瘧疾、血吸蟲和弓形蟲等的感染上，mRNA 也提供了可能［69-71］。在動物傳染病方面，如禽流感預防也顯示出一定的效果［72-73］。mRNA在傳染病的應用上具有許多共同特征，mRNA進入細胞質后可直接翻譯成蛋白質，因此，mRNA疫苗是非整合的、非傳染性的，且耐受性良好。mRNA 在細胞中短暫表達，允許重復接種。mRNA轉錄物中編碼單位的選擇是靈活多樣的，允許編碼抗原和免疫調節分子來誘導和調節適應性和先天免疫應答，并且含有多個表位的編碼全長抗原可以由主要組織相容性復合體Ⅰ類（major histocompatibility complex-Ⅰ，MHC-Ⅰ）和Ⅱ類（MHC-Ⅱ）分子呈現，而不受MHC限制［69］。但是，在傳染病的傳播方式上，現有的mRNA 修飾技術和遞送系統仍然沒有完全解決mRNA本身的免疫原性［69］。

3.2 mRNA在癌癥療法上的應用

近年來，mRNA 療法在癌癥領域的應用逐漸成為研究熱點。相對于傳染病，mRNA 在癌癥等療法的開發方面臨著更多挑戰。在傳染病預防上mRNA 只需要產生少量蛋白質，人體免疫系統會通過細胞和抗體介導的免疫反應放大免疫信號，而mRNA 癌癥療法需要mRNA 疫苗所表達的1 000 倍以上的蛋白質水平才能達到治療閾值。通常情況下，mRNA 療法需要作用于特定的靶通路、細胞、組織或器官。因此需要重視靶細胞對mRNA 的吸收，這決定了mRNA 表達的持續時間和水平。脂質載體遞送到組織中的生物利用度、循環半衰期和遞送效率都是限速因素。靜脈注射可以很容易讓mRNA 藥物靶向肝臟，但將其有效遞送到其他實體器官仍然具有挑戰性。此外，對于慢性疾病的治療通常需要多次給藥，即使優化過的mRNA 和LNP 在多次給藥后也會激活先天免疫，從而降低治療性蛋白的表達［74］。

對于mRNA 癌癥免疫療法的機制，一種方法是通過編碼表達腫瘤抗原蛋白來抑制腫瘤生長，或抑制腫瘤微環境。然而，目前的mRNA 遞送方式不太可能到達患者的每個癌細胞。另外一種方法是通過mRNA作為治療性疫苗來刺激免疫系統殺死癌細胞［75］。

3.2.1 基于腫瘤抗原的mRNA 癌癥療法 mRNA癌癥療法可根據癌細胞表達的腫瘤抗原特異性設計，激發體內抗腫瘤T 細胞或B 細胞反應。腫瘤包括腫瘤相關自身抗原（tumor associated autoantigens，TAAs）和腫瘤特異性抗原（tumor specific antigen，TSA）。其中，TAA在腫瘤細胞中過表達，但也存在于正常組織中，具有較弱的腫瘤特異性和免疫原性，而TSA是來源于腫瘤細胞突變的抗原，具有高的腫瘤特異性和免疫原性，但機體耐受性較弱。使用多個（如2～6 個）共享TAAs 的組合已成為臨床開發靶向mRNA癌癥疫苗的趨勢。通常所選擇的TAAs 在相關腫瘤中廣泛表達，當與不同的載體或佐劑結合時，可以誘導抗腫瘤免疫反應。

與TAA 不同，TSA 是由于腫瘤細胞突變而產生的，不會影響中樞免疫耐受。因此，TSA 疫苗或新抗原疫苗是治療癌癥的一種有潛力的形式。一般來說，癌癥細胞中的新抗原被蛋白酶降解為小肽，這些小肽在內質網上加工并呈現給細胞表面的分子。這些新表位MHC 被CD4+和CD8+T 細胞識別，以誘導細胞免疫反應?；蛘?，釋放到細胞外液中的TSA可以被腫瘤微環境中滲透的抗原呈遞細胞吸收并呈遞。癌癥患者腫瘤細胞內的獨特突變特征還可用于個性化疫苗設計［76］。

3.2.2 基于細胞因子的mRNA 癌癥療法 基于mRNA 產生的細胞因子來抑制腫瘤微環境，比重組細胞因子更有優勢，因為它們理論上可以保持其信號活性。mRNA 技術可以快速且經濟高效地生產大量基于細胞因子的治療分子，使其成為與重組細胞因子相比更廣泛使用的選擇。此外，無論是系統注射還是腫瘤內給藥，將編碼細胞因子的mRNA封裝在納米顆粒中均可以延長細胞因子的半衰期［76］。

3.2.3 基于細胞治療的mRNA 癌癥療法 基于mRNA 技術的細胞療法，如樹突狀細胞在誘導特異性腫瘤抗原反應中至關重要，在誘導潛在的免疫反應中，樹突狀細胞（dendritic cell，DCs）發揮著關鍵的作用，DCs 能夠指導細胞毒性T 淋巴細胞和自然殺傷細胞形成強大的抗腫瘤武器，從而攻擊腫瘤細胞，是mRNA 癌癥疫苗的理想遞送目標。mRNA 可以在離體或細胞原位將DCs 工程化，用于癌癥治療。除了DCs，基于mRNA 的CAR-T 或TCR-T 細胞療法也可用于癌癥治療，而且mRNA 編碼CAR 或TCR 用于工程化T 細胞的策略優于逆轉錄病毒或慢病毒，因為轉染率較高且無基因突變的風險［34］。

3.3 mRNA在其他治療領域上的應用

在其他治療領域（表1），例如，以色列Arcturus Therapeutics 公司正在研發一種用于治療鳥氨酸氨甲?；D移酶（ornithine transcarbamoylase，OTC）缺乏癥的mRNA 治療藥物LUNAROTC。利用脂質核酸遞送系統，評估其在OTC 缺乏癥患者中的安全性和耐受性［77］。目前正處于Ⅱ期臨床試驗階段（NCT05526066）。

英國阿斯利康公司和美國莫德納公司合作開發了一種編碼血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）的mRNA 治療藥物AZD8601。Ⅱ期臨床試驗（NCT03370887）研究了在接受冠狀動脈搭橋手術的中度收縮功能受損患者的心肌內注射AZD8601 藥物后的安全性和耐受性，并探索了其相關療效。結果顯示，AZD8601 藥物無嚴重不良反應，且療效呈上升趨勢［78］。

美國SQZ生物技術公司與瑞士羅氏公司合作開發了一種基于mRNA 的細胞療法，名為SQZeAPC HPV。SQZeAPC-HPV 向4 種不同類型的工程免疫細胞（單核細胞、T 細胞、B 細胞和NK 細胞）輸送5 種針對HPV16 蛋白抗原和免疫刺激蛋白的mRNA 分子。目前正在招募一項Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗（NCT05357898），以評估SQZeAPC HPV 作為單一療法和聯合派姆單抗治療復發、局部晚期或轉移性HPV16+實體瘤患者的安全性、耐受性、抗腫瘤活性、免疫原性和藥效學效應等。

德國BioNTech 公司開發了一種可在體內編碼分泌IgG 抗體的mRNA 藥物BNT141。該藥物目前正處于Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗（NCT04683939）階段，主要研究其在Claudin18.2 陽性實體瘤患者中的安全性和藥代動力學［79］。

4 挑戰與展望

mRNA 新冠疫苗的成功研制促進了mRNA 藥物的高速發展，但是mRNA 技術仍然存在許多挑戰有待解決。

首先，優化mRNA 從而提高體內蛋白質生產的時間和數量，利用基于核苷的化學修飾（如尿苷修飾）來增加蛋白質的表達［74，80］。除蛋白質的表達量外，縮短蛋白質翻譯的時間、解決重復給藥障礙也是mRNA 用于治療慢性病的關鍵，如自我復制的mRNAs（saRNAs）在使用自身RNA 序列作為模板進行擴增后，在細胞質中可提高RNA 轉錄本的含量［81-82］。環狀mRNAs（circRNAs）能夠提供另外一種延長蛋白質翻譯時間的方法，即環狀結構可使circRNAs 免受核酸外切酶的攻擊，通過延長RNA的壽命提高蛋白質的總產量［83］。

其次，各種智能的遞送系統可以改善在血液中的循環時間、生物分布、裝載和釋放等關鍵功能。改進包裝和遞送系統，包括可電離的脂質納米顆粒（LNP）、基于肽的納米顆粒、細胞生物膜、基于細胞的胞外囊泡等，能夠提高mRNA 藥物靶向精準度，增強藥效。陽離子和可電離的LNP 是目前研究最深入、應用最廣泛、臨床上最先進的mRNA 遞送載體［84-86］，但其可能的細胞毒性和相對較短的循環時間將阻礙其在臨床上的應用［87-88］。目前已經合成并測試了各種新型脂質-聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）共軛物和可電離脂質?？呻婋x脂質在生理pH條件下保持中性，降低毒性的同時，還能在一定程度上增加循環半衰期［89］。在酸性pH 下可電離脂質的質子化現象不僅能夠封裝mRNA，還能夠使mRNA 從酸性核內體中逃逸［22］。由PEG 脂質化形成的PEG 外殼能夠顯著延長LNPs 的循環半衰期、減少聚集，從而減少與血清蛋白不利的相互作用［90］。另外一種有效的方法是使用細胞外囊泡（外泌體）。外泌體具有生物相容性、低免疫原性、無毒性、重復給藥后耐受性良好等優點，在需要重復給藥的情況下，被認為是未來最有前景的mRNA遞送系統［91］。細胞穿透肽（cell penetrating peptide，CPPs）可以穿透細胞膜進入細胞質中，根據CPPs 和RNA 的性質，通過形成各種納米復合物用于RNA 遞送系統［92］?；诩毎倪f送系統，其可以利用細胞的分泌能力直接將mRNA合成的蛋白質遞送至離體細胞中。該遞送系統具有生物相容性、無毒性、延長循環半衰期等優點，可將mRNA 導入免疫細胞等細胞中進行修飾［92］。研究人員還開發了一種細菌介導的口服mRNA 疫苗載體，該多靶點疫苗成功探索了基于沙門氏菌的工程化載體，以提供針對新冠病毒德爾塔和奧密克戎變異株的mRNA疫苗［93］。

另外，要實現mRNA療法的全部潛力，還需要解決mRNA 的靶向性問題，特別是對于心臟、腎臟、大腦和肺等實體器官的特異性遞送。目前，肝臟是大多數分子療法的首選器官，其豐富的血管系統有利于有效的均勻遞送和大顆粒通過。簡單的靜脈注射就可以將mRNA高效遞送到肝臟細胞并表達出治療性蛋白質。此外，GalNAc 與寡核苷酸的結合代表了一種可安全用于肝臟靶向遞送的核酸治療劑方法［94］?；贕alNAc 的遞送主要依賴于肝細胞表達去唾液酸糖蛋白受體的能力，通過受體介導的內吞作用結合糖蛋白［95］。然而，將mRNA 治療藥物選擇性遞送到肝臟以外的器官需要專門開發具有適當親和力的包裝和遞送系統。如近年開發的工程脂質納米顆粒能夠選擇性地將mRNA 傳遞到肝外器官［96］；內源性淋巴結導向脂質納米顆粒系統［97］；腹腔內給藥將含有陽離子輔助性脂質納米顆粒傳遞到胰腺，進而產生胰島素細胞［98］；基于LNP 的mRNA 治療方法可增加PEG和膽固醇類似物β-谷固醇［99］；允許重復給藥治療慢性疾病的策略。

盡管存在這些挑戰，mRNA 疫苗在預防新冠病毒感染應用中的巨大成功，以及在致命癌癥治療中的多種嘗試，驗證了未來該技術的巨大應用前景。