諾如病毒疫苗研究概況

焦紅燕，李國超，常亮，李巖異，翟麗麗

1.華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司，抗體藥物研制國家重點實驗室，抗體藥物河北省工程研究中心，石家莊 052160；2.華北制藥金坦生物技術股份有限公司，石家莊 050035

諾如病毒又名諾瓦克病毒（norwalk viruses，NV），是杯狀病毒科（Caliciviridae）諾如病毒屬（Norovirus）中的一種單鏈正義RNA 病毒［1］。大約五分之一的急性胃腸炎（acute gastroenteritis，AGE）是由NoV 引起的，以嘔吐、腹瀉為特征，部分患者出現惡心、發燒、寒戰和疲勞等癥狀［2］。NoV 在各年齡段均易感，5 歲以下兒童、老年人以及免疫力低下人群尤其嚴重［3-6］。全球每年約有6.99 億NoV 病例和21.9 萬死亡病例，造成的直接治療成本約42 億美元，間接社會成本約603 億美元［3］。全世界每年死于NoV 相關疾病的5 歲以下兒童約有7 萬人［3］。每年都會有NoV 的流行和爆發，我國5歲以下兒童的感染比例高達15.6 %［7］。

目前，尚無NoV疫苗或抗病毒藥物獲批使用。NoV胃腸炎患者的治療主要以預防脫水為主［8］，因此開發有效的NoV疫苗防范諾如病毒流行尤為重要。本文對NoV 疫苗的研究進展進行了綜述，重點闡述了病毒樣顆粒（virus like particles，VLP）疫苗、病毒載體疫苗和基于P 顆粒疫苗研究現狀和發展前景，以期為NoV疫苗的研發提供新思路。

1 NoV概述

NoV 基因組全長約7.7 kb，分為3 個開放閱讀框（open reading frame，ORF）（圖1A）［8-9］。ORF1 編碼一個大的多聚蛋白，后續被切割為6種非結構蛋白（non-structural protein，NSP），參與病毒的復制［10］。NoV 衣殼蛋白（norovirus capsid protein，NVCP）VP1由ORF2編碼，其相對分子質量約為58 kD，VP1單體包含一個保守的外殼S結構域（黃色）和一個突出的P結構域（藍色）（圖1B），S結構域形成病毒的二十面體衣殼，而P結構域參與病毒和細胞受體間相互作用，可與組織血型抗原（histoblood group antigen，HBGA）結合［11-12］。P 結構域分為P1 和P2 亞結構域，P2亞結構域高度可變，顯示不同變體的特定表位［13］。VP1可通過自組裝產生VLP，VLP與天然病毒粒子具有相似的形態和抗原性［9］。VP2 是NoV 的次要結構蛋白，該蛋白由ORF3 編碼，可能參與了維持衣殼穩定的過程［9，14］。

圖1 NoV基因組及其衣殼結構[15]Fig.1 NoV genome and capsid structure[15]

NoV具有高度的基因多態性，根據病毒的VP1衣殼蛋白的氨基酸序列不同，NoV 分為10 種基因型（GⅠ～GⅩ），并且在GⅠ、GⅡ、GⅣ、GⅧ和GⅨ基因組中鑒定出至少35種人類感染基因型［8，16-17］。感染人的NoV主要是GⅠ和GⅡ基因型的成員，其他基因型在人類感染中少有檢出［18-19］。目前，在全世界范圍內主要流行的是GⅡ.4 毒株，其變異較快，2～5 年就會出現一種新的變體。GⅡ.4 sydney 變異株最早于2012 年出現在澳大利亞，隨后在世界范圍內普遍流行［6，8］。

2 NoV疫苗研究現狀

疫苗按照性質可分為4類，分別是減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗和基因工程疫苗（表1）［20］。傳統疫苗（包括滅活疫苗、減毒活疫苗和亞單位疫苗）的制備需要體外制備大量病原體。由于NoV對內源性干擾素敏感、體外培養時需要輔助因子（例如膽汁酸、腸道共生菌）等原因，直至2014 年Jones 等才發現在表達HBGA 的腸道菌群的輔助下，GⅡ.4-Sydney NoV 毒株可以感染并在人類B細胞內進行復制［22-23］。2016 年，Ettayebi 等［24］發現NoV 的GⅠ和GⅡ基因型的多個毒株可以在干細胞來源的、非轉化的人腸道類腸（human gut like intestine，HIEs）單層培養的細胞中復制，然而NoV在這些細胞中的復制量并不高。目前，尚沒有合適的用于體外大量培養NoV 的細胞，因此利用NoV病毒制備疫苗的傳統方法并不適用于NoV疫苗的開發［25］。

表1 疫苗類型[21]Table 1 Types of vaccines[21]

由于缺乏成功的動物模型，抗NoV 藥物和非傳統疫苗的后續評價受到了限制［18］。針對此問題目前已發現無菌豬和無菌?？筛腥救祟怤oV GⅡ.4 基因型菌株，但由于動物與人的腸道環境不同，人和動物感染的癥狀并不完全相同，因此人類NoV 感染的標準化動物模型還需進一步探索［26-27］。體外評價系統中，多項研究表明抗體阻斷VLP 結合配體（如合成的HBGA、人類唾液、豬粘液素）的效率與對NoV 的保護效應呈正相關。目前，實驗室常采用HBGA 體外阻斷試驗（合成的 HBGA）評價NoV疫苗的保護效應。

2.1 VLP疫苗

VLP 是一種跟病毒結構類似的納米結構，顆粒大小在20～200 nm 間［28］。VLP 由一種或多種結構蛋白組成，可在細菌、酵母、昆蟲等多種細胞中重組表達并自組裝［29］。根據有無脂質包膜，可將VLP 分為包膜型和非包膜型，其結構蛋白可形成單層、雙層或三層的蛋白衣殼（圖2）［29-30］。病毒衣殼蛋白自發聚合可以產生具有幾何對稱性的VLPs，不同的病毒衣殼形成不同的對稱幾何體，通常為二十面體、球形或桿狀結構［29］。VLP 的多個重復結構作為高密度的表位，具有高度的免疫原性，可引發體液和細胞免疫反應［31］。VLP 缺乏病毒遺傳物質，不能感染宿主細胞，具有較好的安全性，在預防醫學領域越來越受歡迎［32］。

圖2 VLP分類[28]Fig.2 VLP classification[28]

目前，已有3 款基于VLP 的疫苗（乙肝疫苗、宮頸癌疫苗和戊肝疫苗）上市。22 nm 球形乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）表面抗原（HBsAg）疫苗是一種滅活疫苗，最初來源于人血漿，該疫苗于1981 年在美國獲得許可［33］。1986 年，默克公司用釀酒酵母也生產出22 nm 的HBsAg顆粒人用疫苗RECOMBIVAX HB［33］。第2 種人用VLP 疫苗是2006 年由默克公司研制的人類乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）疫苗［33］。第3 種是由我國廈門大學和養生堂萬泰公司聯合研制的戊型肝炎疫苗Hecolin，該疫苗于2012年上市，是全球首款上市戊型肝炎疫苗。Hecolin是由大腸桿菌表達的重組Ⅰ型戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）ORF2 截短蛋白HEV239（aa368-aa606），經純化和折疊后，HEV239 可以自組裝成VLPs 顆粒，而這些顆粒與成熟HEV 病毒粒子的衣殼結構具有高度的相似性［34］。Hecolin 在16～65 歲人群中具有較好的耐受性和較高的保護率，并且該疫苗在2～8℃長期保存具有較好的穩定性［35］。

由于NoV 存在基因多樣、高度變異且無法在體外大規模培養等問題，導致NoV 疫苗的研制進程緩慢。NoV 的ORF2 編碼的主要衣殼蛋白VP1可以通過自組裝產生VLP，VLP 與天然病毒顆粒具有相似的形態和抗原性［9］。NoV VP1 衣殼蛋白可以在昆蟲-桿狀病毒表達系統、畢赤酵母表達系統、植物表達系統和乳桿菌表達系統等多個表達系統中表達。目前，NoV 疫苗研發主要集中在VLP 疫苗、病毒載體疫苗和基于P 顆粒疫苗等方面?，F階段全球處于臨床階段的NoV 疫苗共有8款，其中6 款為重組蛋白疫苗，1 款為腺病毒載體疫苗，1款為mRNA核酸疫苗（表2）。

表2 全球處于臨床研究的NoV疫苗Table 2 NoV vaccines in clinical research worldwide

武田公司開發的HIL-214疫苗目前處于Ⅱ/Ⅲ期臨床研究，該疫苗由昆蟲-桿狀病毒表達系統表達，包含150 μg GⅡ.4 流行株共有序列衍生的GⅡ.4 衣殼蛋白VLP 和50 μg GⅠ.1 衣殼蛋白VLP，純化后的純度達到95%以上［36-37］。以500 μg 氫氧化鋁為佐劑，肌內注射第一劑和第二劑HIL-214疫苗間隔兩個月，受試者NoV 特異性血清抗體滴度至少增加了3 倍，并且會誘導對其他毒株的交叉反應［36］。

HIL-214 疫苗中的GⅡ.4 組分是由3 個流行株的共有序列衍生的，以期能提供對多株NoV 的多價保護［37］。事實上HIL-214 疫苗的臨床Ⅰ期試驗結果顯示接種疫苗可以快速誘導中和抗體的產生，并阻斷一系列疫苗VLP 和非疫苗VLP 與腸道上皮細胞配體的結合［38］。值得注意的是，HIL-214疫苗誘導的抗體能夠結合接種疫苗時還未傳播的NoV（GⅡ.4.2012 和GⅡ.4.2006b.P.D302）VLP，并能阻斷這兩種VLP 與腸道上皮配體的結合［38］。這些數據表明接種HIL-214 疫苗能夠誘導一定的交叉免疫保護作用。然而，該項研究的規模很?。╪=10），并且抗體結合和抗體阻斷實驗并不能完全模擬人體免疫系統對NoV 感染時的反應，因此需要更多的研究來揭示HIL-214 疫苗對NoV 的多價保護。

中國科學院上海巴斯德研究院黃忠課題組與智飛龍科馬生物制藥有限公司用畢赤酵母異源表達了NoV 的GⅠ.1、GⅡ.3、GⅡ.4、GⅡ.17 基因型的VLP，制備了四價重組諾如病毒疫苗，該疫苗免疫小鼠可誘導產生與單價疫苗相當的抗體水平［18，39］。2019 年5 月30 日，該四價重組諾如病毒疫苗（畢赤酵母）進入臨床研究，現處于Ⅰ/Ⅱ期臨床階段［38］。此外，遠大賽威信生命科學（南京）有限公司研發的四價重組諾如病毒疫苗（漢遜酵母）包含GⅡ.2、GⅡ.4、GⅡ.6、GⅡ.17 4 種基因型的VLP，該VLPs形態和免疫原性與天然病毒相似，可與宿主受體HBGA 結合，誘導機體產生針對諾如病毒的免疫應答。四價重組諾如病毒疫苗（漢遜酵母）于2023 年10 月11 日在我國獲批開展臨床Ⅰ期試驗。

目前，臨床上最高價NoV 疫苗是康華生物研制的由畢赤酵母表達的重組六價諾如病毒疫苗。將GⅠ.1、GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.4、GⅡ.6 和GⅡ.17 的VP1基因序列經酵母遺傳密碼子優化后，插入pPinkhc 中，分別轉入畢赤酵母中進行表達，用BMGY（buffered glycerol-complex medium）培養基，28 ℃，220 r·min-1培養，甲醇作為誘導劑［7］。純化后VLP純度達到95 %以上，電鏡檢測VLP 顆粒完整，大小均一，獲得的VLP 結構完整、性能穩定［7］。用該疫苗免疫小鼠后可誘導持久、高滴度的抗體反應，并產生特異性的阻斷抗體和T 細胞免疫反應［7］。該疫苗于2023 年2 月28 日在澳大利亞獲批進入臨床試驗，于2023 年9 月7 日在美國獲批進入臨床試驗。

2.2 病毒載體疫苗

病毒載體疫苗可以在哺乳動物細胞內進行翻譯和修飾。減毒活疫苗在各種疫苗中免疫效果最好、免疫持續時間最久，但是NoV 在體外不能大量培養，因此研發NoV 的減毒活疫苗和滅活疫苗不能實現，復制病毒載體疫苗提供了一種既不需要完整病原體參與也不需要培養病原體的活疫苗方法［1，40］。

2.2.1 處于臨床階段的病毒載體疫苗 Vaxart 公司開發的口服腺病毒載體疫苗能夠啟動腸道免疫反應，這對于預防感染腸粘膜的病原體是有利的［41］。Vaxart 公司構建了一種表達GⅠ.1 NoV 株VP1的腺病毒載體疫苗用于誘導保護性免疫和預防諾如病毒疾病，該疫苗目前處于Ⅰ期臨床研究。NoV腺病毒載體疫苗可在人腸上皮細胞中以類似于自然NoV 感染的方式表達VP1。Kim 等［42］研究發現用雙鏈RNA 作為佐劑，口服免疫該片劑疫苗時耐受性良好，并可產生全身和黏膜免疫反應。NoV毒株的基因是多樣化的，并且變異較快，單一毒株的感染只能提供短期的免疫保護［43］。此外，Vaxart 公司構建的腺病毒載體疫苗可以在同一載體上表達多種抗原，這對于預防基因多樣化的NoV具有較大的潛力［42］。

2.2.2 NoV 的病毒載體疫苗臨床前研究 Harrington 等［44］構建了表達NVCP 的委內瑞拉馬腦炎（venezuelan equine encephalitis，VEE）病毒復制子顆粒（virus replicon particles，VRPs），并通過口腔免疫小鼠，發現VRPs 可以在小鼠中誘導高水平的全身和粘膜免疫反應。然而，利用VEE 復制子載體疫苗的安全性還有待進一步研究。

王金冬等［1］發現用NVCP VP1 和VP2 以及其3′UTR 區構建重組腺病毒疫苗免疫小鼠時，其免疫效果比單獨表達VP1 的重組腺病毒載體疫苗好。然而，人類普遍存在對腺病毒的免疫，腺病毒載體疫苗的免疫效果可能受到宿主免疫反應的影響［45］。

水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）很少感染人類，因此，人體基本不存在預先對VSV 的免疫［46］。Ma 等［45］構建了一種表達NVCP VP1的減毒重組水泡性口炎病毒載體疫苗（rVSVVP1），rVSV-VP1可以引起小鼠針對NoV的高水平的體液、細胞和粘膜免疫。

新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）只編碼7種蛋白質，受宿主范圍的限制，其感染人類時高度減毒，并且基因重組發生較少［47］。Kim［40］制備了表達NoV VA387 株衣殼蛋白VP1 的重組新城疫病毒載體疫苗（rNDV），rNDV 載體疫苗在小鼠體內誘導了高水平的血清、細胞和粘膜免疫反應。

2.3 mRNA疫苗

mRNA 疫苗的原理是將編碼病原體特異性抗原的mRNA 通過一定處理后，注入人體使其通過人體的蛋白質合成系統生產出所需的抗原，該免疫方法模擬了病原體感染細胞的過程，可同時引發體液免疫和細胞免疫。與傳統疫苗相比，mRNA疫苗具有研發周期短、安全性高、水溶性好、易成藥、設計性強、可快速制備等優點。然而，mRNA疫苗研發過程中主要存在的問題有：①裸露的mRNA 不易穿過細胞膜，需要高效的遞送系統輔助；②mRNA 穩定性較差，易降解，在體內半衰期短；③mRNA 免疫原性過高，可能會引起人體強烈的炎癥反應；④翻譯效率較低。

Karikó 等［48］發現摻入修飾的核苷m5C、m6A、m5U、s2U或假尿苷可防止機體將合成的mRNA視為敵人，此發現解決了mRNA 疫苗易引起人體強烈炎癥反應的問題，這些研究成果為mRNA 疫苗的研發奠定了基礎。2023年諾貝爾生理學或醫學獎授予Katalin Karikó和Drew Weissman，以表彰他們在核苷酸堿基修飾研究領域的貢獻。目前，全球上市的mRNA疫苗主要用于預防新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19），包括Biontech 公司研發的Comirnaty 和Moderna 公司研發的Spikevax。此外，多款新型冠狀病毒mRNA疫苗獲得緊急使用授權，如沃森生物、中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院和艾博生物共同研發的沃艾可欣和斯微生物自主研發的mRNA疫苗以及石藥集團研發的SYS6006疫苗。

mRNA 疫苗在應對NoV 基因多樣、高度變異方面具有很強的優勢。目前，Moderna 公司開發的用于預防幼兒和老年人急性胃腸炎的2 款多價VLP 疫苗mRNA-1403（三價）和mRNA-1405（五價）正處于臨床Ⅰ期試驗招募階段。

2.4 P顆粒疫苗

2.4.1 NoV P顆粒疫苗 NVCP VP1的P結構域包含P1 和P2 亞結構域，其中P2 亞結構域位于病毒衣殼的表面，在進化上高度可變，存在與HBGA結合的界面［49］。P 顆粒是由12 個P 二聚體形成的八面體對稱結構，直徑約20 nm，分子量約為830 kD（圖3A）［49-51］。P顆粒能與HBGA結合，并誘導NoV特異性抗體阻斷VLP 與HBGA 受體的結合［48］。P顆粒容易在大腸桿菌中產生，非常穩定，具有高度的免疫原性，因此P 顆?？梢宰鳛镹oV 的候選疫苗［49-50，52］。在P 結構域兩端加入半胱氨酸殘基能促進P顆粒的形成，進一步修飾P結構域的C端形成一種新的亞病毒粒子，即小P 粒子［53］。小P 顆粒由6 個P 二聚體組成，呈四面體對稱，直徑約為14 nm，中心有一個空腔，具有與VLP 和P 顆粒相似的抗原性和HBGA 結合特性［53］。P 顆粒尺寸較大，可能更具免疫原性，但小P 顆粒尺寸更小，可能具有穿透獨特的組織或宿主細胞等獨特的應用［51，53］。

圖3 NoV P顆粒及其表面環[49-50]Fig.3 NoV P particles and their surface rings[49-50]

2.4.2 P 顆粒嵌合疫苗 P 顆粒的每個P 結構域單體存在3 個表面環（白色）（圖3B），這些表面環可以允許大序列插入，是外來抗原呈遞的潛在位點［50］。研究發現，將輪狀病毒VP8 蛋白插入P 結構域的表面環不影響P 顆粒的形成，并且VP8 抗原能很好地呈現在P 顆粒表面［50，54］。該研究還發現P顆粒-VP8嵌合蛋白能夠同時誘導針對輪狀病毒和NoV 的抗體，并且與游離的抗原相比，P 顆粒誘導的VP8 抗體滴度顯著增加［50］。Tan 等［50］認為P 單體的3 個環均可插入外源抗原，可通過在P 顆粒的72 個表面環上插入串聯重復序列增加拷貝數，從而增加免疫反應，或將不同的抗原插入P單體的不同表面環中，開發多價疫苗。開發以P 顆粒為載體的納米疫苗具有廣闊的前景，目前已有以P 顆粒為載體的嵌合疫苗處于臨床前研究階段。

通過將甲型流感病毒中高度保守的流感病毒基質蛋白2（M2e）抗原插入P結構域的第二個表面環制備成的NoV P顆粒-流感病毒嵌合疫苗能增強小鼠對M2e 的免疫反應，還可誘導阻斷NoV VLP或P 顆粒與HBGA 結合的抗體［55］。將NoV 和戊肝病毒的P結構域融合制備的融合疫苗誘導的抗體水平顯著高于單獨的NoV P 二聚體或單獨的戊肝二聚體誘導的抗體水平［56］。將NoV、戊肝病毒和星狀病毒的P 結構域融合，可形成針對NoV、戊肝病毒和星狀病毒的三價嵌合疫苗［57］。將HIV病毒包膜與HIV 的廣泛性中和抗體（BnAbs）結合的MPER 表位4E10 或10E8 插入NoV P 顆粒的表面環中生產的Nov PP 融合蛋白可以作為呈遞4E10或10E8表位的載體，從而誘導針對HIV-1 gp41的特異性免疫應答［58］。將β 淀粉樣蛋白的Aβ1-6 表位插入NoV P 顆粒的表面環中構建的新型阿爾茲海默癥候選疫苗可誘導小鼠產生高濃度的Aβ 特異性抗體，該疫苗避免了接種全長Aβ42 而引起的自身免疫性腦膜炎問題，并且該疫苗比截短的Aβ 小肽表位免疫效果好［59］。孫瑤等［60］將含多個磷酸化靶點的pTau（細胞骨架蛋白tau）多肽抗原表位偶聯至NoV P 顆粒上，制成了P 顆粒-磷酸化Tau表位疫苗，該疫苗在Tau相關疾病的小鼠模型P301S中降低了小鼠腦內磷酸化Tau的積累，緩解了Tau 相關的運動功能障礙，表現出較好的免疫原性、安全性和有效性。

3 展望

NoV 具有高傳播性，是引發全球性急性胃腸炎疾病的主要病原體之一，同時NoV 的多種毒株增加了人類對NoV 防控的難度，目前還沒有上市的疫苗或藥物用于NoV的預防和治療。NoV的多發性和傳播性突出了NoV 疫苗開發的必要性，本文綜述了NoV VLP 疫苗、腺病毒載體疫苗和基于P 顆粒疫苗的研發現狀，有助于發現安全有效，具有臨床應用價值的NoV疫苗。

隨著研究的不斷深入，NoV 體外難培養和動物評價模型建立困難等難題正在逐步攻克，NoV疫苗技術已經日漸成熟。NoV VLP 疫苗、腺病毒載體疫苗和基于P顆粒疫苗等多種疫苗的研發都有了突飛猛進的發展，多款疫苗的研發已經進入臨床試驗階段。盡管目前NoV 疫苗的研究有了一些突破，但仍面臨許多挑戰。首先，諾如病毒有多種基因型且變異速度快，人們在研發NoV 疫苗時，需要考慮疫苗的廣譜性；其次，人們對自然NoV 感染的免疫力是短暫的，需要考慮疫苗產生免疫力的時效性；最后，NoV疫苗的應用目前仍有一些迫切需要突破的瓶頸，例如NoV 基因組結構和NoV 發病機制需要進一步深入研究。未來，隨著現代生物學技術的不斷發展和完善，NoV 疫苗研發將提升至一個新的高度，為阻斷NoV 的傳播提供重要助力。