BRAF突變在非小細胞肺癌中的研究進展

鄧李變 楊雅嫻 黃劍

肺癌是導致癌癥相關死亡的主要原因，占全球癌癥死亡人數的1/3左右。在過去大約30年間，我國肺癌的發病率和死亡率呈顯著上升趨勢，已演變成國內增長最快、危害最大的惡性腫瘤[1,2]。我國肺癌患者中，75%-90%屬于非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）。晚期NSCLC通常采用鉑類雙聯化療，但有復發風險。

在NSCLC中，存在許多腫瘤驅動基因，如表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral proto oncogene,KRAS）、鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B（V-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B,BRAF）、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）及原癌基因1受體酪氨酸激酶（c-rosoncogene 1 receptor tyrosine kinase,ROS1）等[3]。針對這些驅動基因的靶向治療極大地改善了NSCLC患者的治療效果及治療模式，本文著重針對NSCLC中BRAF基因突變及靶向治療進展進行綜述。

1 BRAF基因

1.1BRAF基因結構 大鼠肉瘤（rat sarcoma, RAS）/快速加速纖維肉瘤（rapidly accelerated fibrosarcoma, RAF）/絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase,MEK）/細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）或絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信號通路是一個關鍵的細胞內信號通路，介導細胞增殖和存活所必需的生長信號反應[3,4]。BRAF是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與ARAF和CRAF同屬于RAF激酶家族，參與MAPK信號通路。

BRAF基因位于第7號染色體長臂上，由3個蛋白保守結構區（conserved regions, CR）組成，分別為RAS結合結構域（CR1）、調節結構域（CR2）和激酶結構域（CR3）[5]。CR1含有與Ras-GTP結合的RAS結合結構域（RAS binding domain, R BD）和富含半胱氨酸結構域（cysteine-rich domain, CRD），是RAS蛋白間互動的關鍵性環節[4]。CR2包括1個富含絲氨酸/蘇氨酸的區域，該區域具有重要的抑制性磷酸化位點，可以解除RAS結合和RAF活化[6]。CR3位于C末端的11-18號外顯子內，是蛋白激酶結構域，其磷酸化是激酶激活的必需條件[7]。CR3的N端部分參與ATP結合，它包含P環區域，對穩定ATP結合和維持無活性BRAF構象有重要作用[5]。

1.2 BRAF相關信號通路 在靜息細胞中，RAF定位于胞漿，其N端調節區域與激酶結構域相互作用，通過14-3-3二聚體與2個磷酸化絲氨酸位點（pS365和pS729）結合，維持自身抑制的單體狀態[8,9]。

當生長因子與細胞表面受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases, RTKs）結合時（EGFR是最早發現的RTK），受體-配體相互作用促進細胞內部RTK的二聚化、活化和自體磷酸化，活化的RTK通過磷酸酪氨酸殘基結合細胞質中帶有SH2或PTB結構域的蛋白，募集生長因子受體結合2（growthfactor receptor-bound 2, GRB2）和鳥嘌呤核苷酸交換因子如SOS（Son of Sevenless），促進Ras上GTP與GDP交換[10,11]。RAS-GTP可以直接與RAF蛋白結合，將RAF從細胞質中募集到細胞膜上，使RAF成為一種活性激酶。隨后，活化的RAF對其下游底物（即MEK和ERK）進行一系列磷酸化反應，啟動經典MAPK途徑的活化[12,13]（圖1）。

圖1 MAPK信號通路Fig 1 MAPK signaling pathway. RTK: receptor tyrosine kinase;RAS: rat sarcoma; GTP: guanosinetriphosphate; RAF: rapidly accelerated fibrosarcoma; MEK: mitogen extracellular kinase;ERK: extracellular signal-regulated kinase; P: phosphorylation;MAPK: mitogen-activated protein kinase.

1.3 實體瘤中的BRAF基因突變 RAS-RAF-MEK-ERK通路的失調與人類癌癥的發生有關，基因變異造成失調的MAPK信號通路通過多種機制導致癌癥的發生和發展，如促進腫瘤增殖、存活、侵襲、轉移、細胞外間質降解和血管生成等。2002年，首次在黑色素瘤中詳細說明了發生在BRAF基因V600位點（最初錯誤描述在V599位置）的點突變是致癌突變，并將其鑒定為癌基因和潛在的治療靶點[14]。

研究[15]表明BRAF突變發生在多達8%的人類癌癥中，包括黑色素瘤、結直腸癌、膠質瘤、甲狀腺癌、NSCLC、膽管癌和多種血液系統惡性腫瘤。40%-60%的黑色素瘤患者發生BRAF突變，與BRAF野生型黑色素瘤患者相比，BRAF突變的黑色素瘤患者更年輕，且更有可能轉移到大腦[16]。在轉移性結直腸癌（metastatic colorectal cancer, mCRC）中，BRAF突變發生率為5%-10%[17]，然而，挪威的一項研究[18]表示這個數字可能被低估，BRAF基因突變在mCRC發生率可高達21%。間變性甲狀腺癌（anaplastic thyroid cancer, ATC）是一種罕見的甲狀腺腫瘤，BRAFV600E突變在近40%的ATC中鑒定為驅動癌基因[19]。最近的研究[20-22]表明，BRAF變異也是中樞神經系統腫瘤、膽管癌的常見驅動變異。

1.4BRAF基因突變類型BRAFV600E是最常見且最著名的BRAF突變，15號外顯子核苷酸T1799處的胸苷轉換為腺苷，從而有效地在BRAF激酶結構域密碼子600處用谷氨酸取代纈氨酸（V600E）。BRAF基因變異大多數發生在V600密碼子附近的激活環（A環）或464-469殘基處的磷酸結合環（P環），并可分為3種亞型。I類亞型為組成型活性RAS非依賴性單體（BRAFV600E/K/D/R），這類變異能夠引起強烈的BRAF激酶活化[23]。II類突變形成活性RAS非依賴性二聚體，具有高或中等BRAF激酶活性，這類突變涉及600位點以外的密碼子（例如：K601E、L597V/Q/R、G469V/S/R/E/A、G464V）。III類為RAS依賴性二聚體，由于激酶活性受損，需要通過RAS或RTK激活額外的上游信號來擴大ERK信號傳導，這會導致致癌MAPK超活化（例如：G596R、D594Y/N/G/E、N581Y/S/I、G466V/L/E/A、D287Y）。因此，III類變異通常與MAPK途徑上游的其他基因突變一起發生（例如：NF1）。II類和III類變異統稱為非V600突變[24]。

除了15號外顯子的突變，一些NSCLC患者攜帶BRAF11號外顯子的變異，這些突變目前并非藥物作用位點[25]。

2 BRAF基因突變與NSCLC關系

2.1BRAF突變在NSCLC中的流行病學與病理特征BRAF基因突變在NSCLC中的發生率為1.5%-4%，主要發生于肺腺癌中。在中國人群中BRAF突變頻率為2.26%（5/221）[26]，韓國患者中BRAF突變頻率為1.3%（5/378）[27]。在英國的大型隊列研究[28]中，BRAF突變頻率為3.44%（185/5384），而在德國隊列[29]中，BRAF突變頻率為2.34%，BRAF突變頻率在不同人群中相差不大。癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）項目對178例肺鱗癌的綜合基因組評估顯示BRAF變異發生頻率為3%[30]，但肺鱗癌中的BRAF突變仍然是罕見的[31,32]。在NSCLC中，BRAF基因突變中最常見的是BRAFV600E，變異發生頻率為1%-2%。吸煙的肺癌患者中，BRAF通常為非V600突變，而不吸煙的NSCLC患者更可能攜帶V600突變[33]。BRAFV600E突變在男性和女性中發生的頻率相同，但在老年患者（年齡＞60歲）中更為常見[34]。有研究[35]表明，BRAF突變NSCLC患者的淋巴結轉移發生率高于非BRAF突變NSCLC患者。

攜帶BR AFV600E突變的NSCLC多為非黏液性腺癌，顯示完全或部分微乳頭狀生長模式[36]，而具有BRAF非V600E突變的NSCLC可能顯示各種形態，包括黏液成分[7]。另外，BRAF突變型NSCLC中程序性細胞死亡配體1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）的表達略高于野生型[37,38]，但也有研究[39]表示兩者之間的PD-L1表達并無差異。在BRAF突變的NSCLC中腫瘤突變負荷（tumor mutational burden, TMB）較高，但BRAF突變不影響微衛星不穩定性（microsatellite instability, MSI）和間質環境中的免疫細胞浸潤數量[39]。

2.2 NSCLC中BRAF與其他驅動基因的并存狀態BRAF突變的NSCLC患者可能同時發生其他驅動基因突變，并且在BRAFV600E和非V600E病例中共突變的數量和類型具有差異。一項大隊列研究[40]表明，SMAD4和PIK3CA的變異與BRAFV600E相關（P＜0.01），而KEAP1、NF1、MET、RICTOR、KRAS、MYC、STK11和TP53的變異更頻繁地發生在BRAF非V600E突變腫瘤中（P＜0.05）。同時發生的RAS和BRAFV600突變極為罕見，研究[41]表明與BRAFV600突變相比，攜帶BRAF非V600突變的患者更可能發生和RAS的共突變（P≤0.001）。

大約3%的NSCLC患者中，出現原發性EGFR和BRAFV600E共突變，這將導致患者對奧希替尼（Osimertinib）的耐藥，少數情況是抗EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）治療后的獲得性突變，然而目前對這類獲得性BRAF突變的發生機制尚不清楚[42,43]。

2.3 BRAF與NSCLC預后BRAF基因突變對NSCLC的預后意義尚不清楚。目前小型回顧性研究[44]報告了相互矛盾的結果，部分原因可能是BRAF突變的發生率較低。一項17,664例NSCLC患者的分析[45]表示，BRAF突變患者對一線化療的客觀緩解率（objective response rate, ORR）低于完全野生型人群（23%vs32%），但觀察到中位無進展生存期（progression-free survival, PFS）和中位總生存期（overall survival, OS）沒有差異（BRAF突變型vs野生型：中位PFS為7.5vs7.1個月；中位OS為13.8vs11.8個月）。

一項研究[41]表明，236 例被診斷為BR A F突變的NSCLC的患者中，有69例（29%）在診斷時發現了腦轉移，對其進行回顧性分析發現，與I類變異相比，II或III類突變患者更可能發生腦轉移（P≤0.01）?？傮w來說，BRAF在NSCLC預后影響方面的相關研究結果仍存在分歧，需要更多的大樣本研究來提供解決方案。

3 BRAF突變治療策略

3.1BRAF突變的NSCLC對化療不敏感 化療是NSCLC常用的治療策略之一，而BR AF突變的NSCLC從化療獲益有限。既往研究[46]發現，BRAF突變與BRAF野生型的NSCLC對鉑類聯合化療的臨床結果在PFS和OS方面無顯著差異，表明BRAF突變與化療敏感性無關。而BRAFV600E突變的NSCLC患者鉑類聯合化療比非V600E突變的患者具有更短的PFS（4.1vs8.9個月），表明BR AFV600E突變患者與BRAF野生型相比預后較差。來自法國的一項研究[47]表明，以紫杉醇為基礎的化療在一線治療方案中顯示最差的PFS，且化療方案與預后無關。雖然使用標準化療或其他化療的BRAF突變NSCLC的臨床結果證據有限，但目前的研究結果表明BRAF突變的NSCLC對化療不敏感。

3.2BRAF突變的NSCLC對免疫治療療效有限 免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）治療是另一種選擇。有研究[37]報道BRAF突變的NSCLC高表達PD-L1，所以BRAF突變型患者具有ICIs獲益的可能。但有研究[48]表明，BRAFV600突變和BRAF非V600突變的NSCLC患者進行ICIs治療后中位PFS分別為5.3和4.9個月，6個月PFS率分別為48.0%和46.1%，12個月PFS率分別為39.1%和24.6%。該項研究中，BRAFV600和非V600隊列的有效率分別為26%和35%，另一項研究[38]也表示ICIs治療在BRAF突變的NSCLC中療效有限。

然而，有報道[49]發現1例62歲女性不吸煙NSCLC患者伴有高PD-L1表達和BRAFV600E突變，使用阿替利珠單抗（Atezolizumab）聯合鉑類化療的PFS為20個月，表明聯合免疫療法可能是BRAFV600E突變不吸煙NSCLC伴有高PD-L1表達的一種治療選擇。需要進一步的臨床試驗來探究其療效。

3.3 靶向治療 現行的國際與國內指南規定，晚期NSCLC患者應至少進行EGFR和BR AF突變以及ALK/ROS1重排的檢測，來確定正確的治療策略[50]。目前批準的BRAF驅動肺癌靶向抑制劑包括達拉非尼（Dabrafenib）和維羅非尼（Vemurafenib），它們對由活性單體（即I類）突變體（主要是密碼子V600E突變體）驅動的RAS非依賴性信號傳導有效。84例NSCLC患者II期臨床試驗[51]結果表明：達拉非尼對BRAFV600E陽性的NSCLC治療有效，總體反應率為33%（95%CI: 23%-45%）。VE-BASKET研究[52]表明，62例BRAFV600E突變型NSCLC患者接受維羅非尼治療的ORR為37.1%（95%CI: 25.2%-50.3%），未經治療的患者ORR為37.5%（95%CI: 8.5%-75.5%），既往接受過治療的患者為37.0%（95%CI: 24.3%-51.3%）。中位PFS為6.5個月（95%CI: 5.2-9.0），中位OS為15.4個月（95%CI:9.6-22.8）。由于單一BRAF抑制劑的活性有限，研究者開始探索聯合治療。

NCT01336634試驗[53]評估了達拉非尼聯合曲美替尼（Trametinib）治療既往未經治療的BRAFV600E突變型轉移性NSCLC患者的活性和安全性。試驗結果表明，既往未接受治療的患者（n=36）的ORR為64%（95%CI:46%-79%），中位緩解時間（duration of response, DOR）為15.2個月（95%CI: 7.8-23.5），中位PFS為14.6個月（95%CI:7.0-22.1）。這項試驗也表明，在接受達拉非尼單藥治療或聯合治療后，疾病進展時間（time to progression, TTP）與進展后生存時間（post-progression survival, PPS）持續時間顯著延長[54]。隨訪結果表明，達拉非尼聯合曲美替尼治療具有實質性和持久的臨床益處（既往經治療患者的中位OS為18.2個月，初治患者中位OS為17.3個月），不論患者既往是否經過治療，均具有可控的安全性[55]?；谶@些良好的結果，2022年3月，雙靶治療（達拉非尼+曲美替尼）在中國獲批用于治療BRAFV600E突變NSCLC患者。2023年中國臨床腫瘤學會（Chinese Society of Clinical Oncology, CSCO）指南[56]將雙靶治療作為BRAFV600E晚期NSCLC一線治療I級推薦。

美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration, FDA）近日批準康奈非尼（Encorafenib）聯合貝美替尼（Binimetinib）治療BRAFV600E突變轉移性NSCLC。II期臨床試驗[57]報道了BRAFV600E突變型NSCLC中未治療隊列（n=59）中，ORR為75%（95%CI: 62%-85%），中位DOR和中位PFS不可估計（not estimated, NE）。而在既往治療隊列（n=39）中，ORR為46%（95%CI: 30%-63%），中位DOR為16.7個月（95%CI: 7.4-NE），中位PFS為9.3個月（95%CI: 6.2-NE）。這為BRAFV600E突變轉移性NSCLC的成年患者提供了一種新的個性化治療選擇。

3.4 BRAF靶向治療的副作用 達拉非尼聯合曲美替尼治療對多種BRAF突變腫瘤有臨床益處，但在治療期間可觀察到常見的不良事件，如發熱、疲勞和惡心以及一系列皮膚病、眼睛毒性和出血事件。NCT01336634試驗[58]中57例患者中有32例（16%）報告有嚴重不良事件，包括發熱（16%）、貧血（5%）、精神狀態混亂（4%）、食欲下降（4%）、咯血（4%）、高鈣血癥（4%）、惡心（4%）及皮膚鱗狀細胞癌（4%）。另一項研究[59]表明，使用達拉非尼聯合曲美替尼治療的患者，61.3%出現發熱，5.7%出現3/4級發熱，15.6%出現方案定義的嚴重發熱事件，發熱通常在治療早期發生，并隨著治療時間的延長而減少，劑量中斷時可以控制。對于嚴重復發性發熱患者，使用皮質類固醇是一種預防策略，以減少不必要的治療中斷[60]。

3.5BRAF突變治療耐藥機制及應對策略 盡管BRAF抑制劑在BR AF突變型NSCLC患者中顯示出臨床活性，但由于M A PK 通路的重新激活，大多數患者對這些藥物產生了耐藥性。BRAF靶向治療后BRAF本身的融合、擴增和BR A F上游激活突變［如病毒致癌基因同源物（neuroblastoma RAS viral oncogene homolog,NRAS）或KRAS突變］、下游MAPK通路改變（如MEK1/2突變或ERK突變）、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin, PI3K/AKT/mTOR）等旁路活化以及受體酪氨酸激酶（例如：EGFR、PDGFRβ、MET、ERBB3、IGFR1）的表達增加，都會導致BRAF靶向抑制劑的耐藥性[61]。

雙靶治療通過阻斷ERK信號傳導，在BRAF抑制劑中加入MEK抑制劑可以通過阻斷ERK信號來克服或延緩BRAF抑制劑獲得性抵抗力的發展。然而研究[62]表明，使用BR AF抑制劑或達拉菲尼和曲美替尼雙重阻斷后的激活突變如KRAS或NRAS也是引起耐藥的原因。NR AS上調可能促進RAF的二聚化，這將導致ERK信號傳導對藥物不敏感，導致腫瘤抗藥性[63]。達拉非尼和曲美替尼的聯合治療用于治療BRAFV600突變型NSCLC中，EGFR表達上調形成了對雙靶治療（BRAF抑制劑+MEK抑制劑或EGFR抑制劑）的抗性，研究[64]顯示使用三聯靶向治療（BRAF抑制劑+MEK抑制劑+EGFR抑制劑）可恢復細胞對治療的敏感性。

基因進化的多樣性和隨機性提示我們必須對可能發生的突變進行全面分析，以確認患者的獲得耐藥性，并指導科學界設計針對特定耐藥性的臨床試驗。

3.6BRAF非V600E突變療法研究 在肺癌患者中，大約70%的BRAF突變是非V600E突變，然而，目前還沒有針對攜帶BRAF非V600E突變的患者的靶向治療。II類突變體G469V和G469A，通過形成非RAS依賴的二聚體激活信號傳導，而達拉非尼和維羅非尼只抑制二聚體中的一個原體，所以對這些II類突變體無效[25]。PLX8394破壞BRAF同源二聚體和BRAF/CRAF異源二聚體的形成，但不破壞CRAF同源二聚體，表明它可能比II型抑制劑具有更廣泛的治療指數[65,66]。最近的模型實驗[65]表明，一些EGFR-TKIs，如吉非替尼、阿法替尼和奧希替尼，可以通過直接抑制BRAFG469V突變體來抑制肺癌生長，臨床上批準的EGFR-TKIs或可用于治療攜帶BRAFG469V突變的NSCLC患者。這項研究給我們的啟示是，雖然特異性蛋白激酶抑制劑是癌癥治療的主要策略，但一些激酶抑制劑的“脫靶”抑制也可能顯著影響癌癥治療。

4 總結

BRAF突變是癌基因驅動的NSCLC中的一個新興的靶標，BRAF基因對NSCLC的發生、發展和預后起著關鍵作用，幫助我們深入理解其分子病理機理有重要價值。隨著腫瘤治療步入以分子標志物為治療靶點的個體化醫療時代，系統性地對腫瘤復雜基因突變進行分子分型顯得至關重要。針對BRAFV600E原發突變靶向治療后耐藥、EGFR突變的NSCLC TKIs治療后BRAFV600E的獲得性突變及BRAF非V600E突變的治療策略，是未來該領域重點要解決的臨床難題；同時，探尋EGFR/BRAF/MEK信號通路上的其他有效抑制靶點，亦是針對BRAF突變的NSCLC臨床研究重點。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.