農田土壤中生物炭定量方法研究進展

謝彥海，陳翰博，高玉蓉，陸扣萍，王海龍

（1.佛山科學技術學院 食品科學與工程學院，廣東 佛山 528225；2.佛山科學技術學院 環境與化學工程學院，廣東 佛山 528000；3.浙江農林大學 資源與環境學院/碳中和學院，浙江 杭州 311300）

生物炭還田是實現農田土壤固碳的有效措施。生物炭施入土壤后，大部分芳香性碳在土壤中極為穩定，但仍有少部分不穩定碳如脂肪族碳、氧化態碳會迅速礦化［1］。目前生物炭的穩定碳匯貢獻尚未得到有效核定，對農田土壤中生物炭的定量方法研究仍處于起步階段。在大田土壤中，通過測定生物炭在土壤中的殘留量可直觀地反映其固碳效果，對研究其穩定性、空間遷移規律和對土壤有機質的影響具有重要意義。廣義上，生物炭屬于黑炭類物質的一種，因此本文基于土壤中黑炭的定量方法，綜述了現有的適用于生物炭的4 大類定量方法，包括熱氧化法、化學氧化法、苯多羧酸分子標記法和光學法，如圖1 所示，并比較了各種定量方法的優缺點，旨在為研究者快速準確地選擇生物炭定量方法提供一定的技術參考。

圖1 土壤生物炭定量方法

1 土壤生物炭定量方法

1.1 熱氧化法

如圖2 所示，熱氧化法主要包括燒失法、熱重-差示掃描量熱法、化學熱氧化法和加氫熱解法。該類方法利用生物炭與非生物炭有機碳、無機碳在熱穩定性方面的差異進行定量［2-3］。主要有兩種形式：一是將包含生物炭在內的所有碳質材料熱氧化，通過損失重量來推測生物炭在土壤中的含量。二是把所有非生物炭的有機碳熱氧化，而使大部分生物炭得以保留，最后進行碳元素分析［4］。

圖2 熱氧化法

燒失法最初用于測試土壤有機質，KOIDE 等［5］將其改進用于土壤生物炭定量，該方法使用帶有控溫系統的馬弗爐加熱純生物炭、純土壤和生物炭及土壤混合物，將3 類樣品中的所有有機和無機碳全部熱氧化，通過氧化前后的質量損失來估算生物炭含量（純生物炭燒失量=生物炭及土壤混合燒失量-純土壤燒失量）［5-6］，純生物炭與純土壤燒失量可以在生物炭施入土壤前分別測得，或施入后從土壤中分離兩者進行測試［7］。熱重-差示掃描量熱法通過識別熱氧化過程中各類物質在質量和熱流量上的差異來區分土壤中不同組分。其中，熱重分析儀可記錄各溫度段下的不同組分的質量損失［3］，而差示掃描量熱儀能夠識別加熱時生物炭產生的特殊放熱峰，且峰的相對高度即熱流量與樣品中的生物炭含量呈顯著線性正相關關系［8］，結合熱重特征和放熱峰曲線可以較為精確地區分生物炭和土壤有機碳，并推導出其含量［9-10］?；瘜W熱氧化法實質是化學氧化法與熱氧化法的聯用，但以熱氧化為主，其中Chemical Thermal Oxidation-375 是第1 個廣泛應用于土壤中黑炭量化的化學熱氧化法［11］，CTO-375 一般在285～375℃有氧條件下進行2～24 h 的熱氧化處理以除去土壤中非生物炭的有機碳，隨后采用鹽酸等弱酸原位去除土壤無機礦物，最終殘余物被收集用于全碳分析［12］。加氫熱解法是在高壓氫氣環境下，輔以硫化鉬催化劑進行慢速熱解，將不穩定有機碳完全分解，并使用元素分析儀對最后殘留物進行總碳定量［13］。

1.2 化學氧化法

化學氧化法利用土壤中各組分的不同化學穩定性，使用化學氧化劑去除土壤中的非生物炭組分［2］，如圖3 所示，主要包括3 個步驟：無機礦物去除、有機碳氧化和碳元素測定。根據使用氧化試劑的不同，化學氧化法還可分為：重鉻酸鉀法、過氧化氫法、硝酸法和次氯酸鈉法。

圖3 化學氧化法

重鉻酸鉀法由LIM、CACHIER［14］和SONG 等［15］最先用于檢測土壤和沉積物中的黑炭，其與測定傳統土壤有機質的重鉻酸鉀外加熱法不同的是，該方法在去除礦質后，使用更低濃度的重鉻酸鉀-硫酸混合溶液和更溫和的加熱條件，僅將非生物炭有機碳氧化，最后對干燥的氧化殘余物進行碳元素分析或13C 核磁共振測定［15-17］。過氧化氫是去除土壤有機碳的有效氧化劑，也常用于生物炭穩定性測試，但在生物炭定量中難以去除芳香縮合度較高的干擾物質［18-19］。硝酸法由KURTH 等［20］提出后經MAESTRINI and MIESEL［21］改進完善，其采用弱硝酸氧化土壤中的非生物炭有機碳，但未得到廣泛應用。次氯酸鈉法使用次氯酸鈉與醋酸混合溶液氧化有機碳，用超純水洗去鹽分，最后通過元素分析或13C 核磁共振測定生物炭含量［22］。

1.3 苯多羧酸分子標記法

苯多羧酸（Benzene Poly-Carboxylic Acids，BPCAs）分子標記法最初由GLASER 等［23］開發，用于土壤與沉積物中黑炭的量化，該技術已得到廣泛使用并逐步改進完善［24-25］。該方法利用硝酸在高溫高壓條件下將含生物炭土壤中所有有機碳消解，隨著生物炭稠環芳烴的裂解，與不同個數的羧酸基團結合氧化形成BPCAs 分子，BPCAs 分子的特殊結構可作為量化生物炭的分子標記物［23-24］。與越多的羧基結合，苯多羧酸分子結構越復雜，芳香縮合度越高，則其標記的可靠性也相應提升。

如圖4 所示，根據最終檢測方式的不同，分子標記法可分為氣相色譜法、液相色譜法和元素分析法3 種。氣相色譜法主要包括5 個步驟：酸消解、氧化、凈化、衍生化以及氣相色譜儀與火焰離子化檢測器連用（Gas chromatography-Flame ionization detector）測定BPCAs 含量［23，26-27］。生物炭并不能被完全氧化為BPCAs 分子，尤其是制備溫度較高（＞800℃）的生物炭，因此BPCAs 總量需乘以轉換系數2.27 得到生物炭含量［12］。在氣相色譜法的基礎上，DITTMAR［28］開發了一種利用高效液相色譜儀與二極管陣列檢測器相結合（High-performance Liquid Chromatography-diode Array Detection）的分析技術，該技術多被用于海洋中溶解性黑炭的定量。其省略了氣相色譜法耗時的衍生化和各種清洗過程，降低了人工處理帶來的誤差，被證明是一種更準確、更快速的生物炭定量方法［27，29］，近年來該方法也被用于土壤中黑炭的定量［30-31］。盡管氣相色譜法和液相色譜法的回收率相對較高、變異系數較小，但該類方法需昂貴且專業的儀器和耗時繁瑣的操作步驟，不適于常規分析大量土壤樣品。因此，KOSCHKE 等［32］和LLORENTE 等［33］提出了一種改進的快速元素分析法，即在硝酸氧化和酸洗后，直接使用元素分析儀測量殘留物的碳含量，并乘以轉換系數，其中氧化前后樣品的質量對于定量至關重要。

圖4 苯多羧酸分子標記法

1.4 光學法

光學技術常用于生物炭形態的表征，基于生物炭與土壤各組分間不同的光學性質，如光譜特征、吸光性和透光性等，也能估算生物炭在土壤中所占比例。光學法主要包括中紅外光譜法、13C 核磁共振法、顯微鏡法和熱光學反射法/透射法。

中紅外光譜法已被廣泛用于測定土壤有機碳和其他土壤特性的表征［34］，該方法通過檢測芳香鍵并結合偏最小二乘回歸（Partial Least Squares Regression）的多元數據分析技術來預測生物炭含量，然而這多適用于半定量研究［4，35-36］。固態13C 核磁共振技術可在分子尺度上識別不同碳源官能團的相對比例，核磁共振信號的峰值強度與各種碳源的化學位移呈正相關關系，因此可以提供有關生物炭芳香結構的定量信息［37］，但核磁共振多與化學氧化法相結合［22，38］。顯微鏡法應用于土壤樣品中生物炭顆粒的計數和分布估算，需根據其粒度選擇適宜的顯微鏡，如光學、掃描電子或透射電子顯微鏡，并借助網格計數托盤進行觀察，最后通過相對面積推斷生物炭在土壤中的分布情況［39-40］。熱光學反射法/透射法通過監測加熱過程中濾光片上樣品的反射率或透射率，獲得土壤有機碳和生物炭的吸光特性，最初被廣泛用于大氣氣溶膠中碳含量的測定［41］，HAN 等［42］將其應用于土壤或沉積物中生物炭的測定，該方法先在純氦氣氛圍下持續升溫將非生物炭有機碳熱解，剩余穩定的黑炭組分在2%氧氣與98%氦氣氛圍中，550℃、700℃和800℃溫度下也被分解，最后均被還原為甲烷并通過火焰離子檢測器測定，同時獲得所有碳組分裂解時的反射率和透射率。

2 土壤中影響生物炭定量的潛在干擾物質

土壤中干擾定量的物質主要包括傳統的土壤有機質如動植物殘體及其降解產物腐殖質、非生物炭耐火性有機物和土壤礦物等［43-44］。這些含碳物質、無機礦物的成因雖與熱解碳不同，但具有相似的結構和特性，例如高含碳量、高芳香性、低明度等［45］，這類物質的存在會造成生物炭含量的高估。同時，在排除干擾物質的過程中，過度氧化可能也會造成生物炭損失而引起低估。

在涉及熱氧化的方法中，部分動植物殘體等有機質在升溫過程中炭化，形成新的炭化產物是造成生物炭含量高估的因素之一［2，22］。木質纖維素、半纖維素等植物分解底物結構復雜，具有疏水性和芳香性［46］，降解過程緩慢，是土壤中相對穩定的有機碳。腐殖物質占據土壤有機質80%以上，包括富里酸、胡敏酸和胡敏素，這些腐殖質包含大量芳香成分［47-49］。若去除不完全，易被視為生物炭組分。

自然界中的非生物炭耐火性有機物包括類黑素、頁巖（干酪根）和煤炭等。類黑素是美拉德反應形成的一種結構復雜、耐降解的高分子聚合物，由碳水化合物與氨基化合物如氨基酸、蛋白質等在加熱條件下通過縮合作用形成［45］。類黑素與天然有機質具有相似的化學成分，極易在有機質加熱過程中形成，具有較高的芳香度，易被視為生物炭組分，對涉及熱氧化的定量方法影響較大。頁巖是一種在世界范圍內廣泛分布的沉積巖，其中碳質頁巖、黑頁巖有機質含量較高，在經過長時間的風化、搬運作用后成為土壤的一部分［50］，頁巖中的干酪根是其有機碳的主要成分，是一種分散在沉積巖中的難溶性大分子有機質，與礦物緊密結合，具有良好的生物化學穩定性和一定的芳香性，與生物炭等黑炭類物質有類似的特性［45，47，51］。煤炭天然存在于較深的地層和少數地表土壤中［52］，與干酪根類似，包含的地質成因有機碳也具有高碳含量、芳香性結構、高芳香縮合度等特點，在顏色、H/C、O/C 以及NMR 圖譜等方面，煤炭，尤其是煙煤和褐煤，與富含黑炭的材料非常相似［45，47］。在許多臨近工業生產、煤礦開采復墾的農田土壤環境中，土壤中可能存在的煤炭顆粒會影響生物炭的定量。對于靠近城市道路的農田土壤，煤焦瀝青路面磨損后形成的瀝青和煤焦油顆粒容易被風、地表徑流等帶入土中，也會引起生物炭估量的偏差［53］。

多數定量方法對土壤無機礦物都較為敏感，尤其是土壤碳酸鹽和硅酸鹽［54-55］。碳酸鹽是碳酸根與金屬離子結合的鹽類，是土壤無機碳的主要成分，土壤中的碳酸鹽會被錯誤地識別為生物炭，與碳酸根結合的金屬離子如Ca2+、Mg2+、Fe2+也會給定量帶來一定誤差。土壤有機質易與硅氧四面體結合形成包裹有機物的有機-礦物復合體，在這種礦物的保護下，硅酸鹽礦物夾層中包裹的有機物抗氧化性能增強，這不利于土壤有機碳的去除［56-57］。

3 不同定量方法的優缺點

如表1 所示，熱氧化法、化學氧化法、苯多羧酸分子標記法、光學法這4 大類定量方法優缺點各異，可根據生物炭性質、具體環境介質特點和現有試驗條件進行選擇或聯用。

表1 不同定量方法優缺點

燒失法對儀器和試劑等試驗條件要求最低，僅需馬弗爐和電子天平，操作步驟簡單，測試回收率的斜率接近1（0.960）［5-6］。但燒失法的局限性是需獲得純土壤和純生物炭樣品的燒失率，這意味著要分離土壤和一定數量的生物炭，這在耕作后的農田土壤中難以實現，雖有研究表明生物炭的燒失率并不會隨著其在土壤中的老化而發生改變［5］，但在不同土壤環境、氣候條件、甚至更長的自然老化時間下，不同原材料和熱解條件制備的生物炭的燒失率能否維持不變有待進一步驗證。最后，必須確保燒失法的熱解溫度足以熱降解所有生物炭，這與生物炭自身熱穩定性相關。熱重-差示量熱掃描法土樣需求量少，具有快速、操作簡便的優點，但在熱解過程中，部分物質會轉化為氣體逸出，回收率一般較低于實際值，需輔以校正系數［9］；其次，不同物質放熱峰信號的重疊也會影響定量［8］。加氫熱解雖然解決了熱氧化法中有機質碳化這一問題，大約87.8%的黑炭能夠在加氫熱解中得以保留［60］，但復雜的加氫熱解裝置阻礙了其推廣應用?；瘜W熱氧化法操作過程簡單，受外界影響小，平均回收率在26～86%之間，但多適用于高芳香縮合度的生物炭，如在熱氧化過程中沒有充足的氧氣，極易形成新炭化的有機質干擾定量，此外，該方法可能會過度氧化低溫制備的生物炭［2，61-62］?；瘜W氧化法對實驗條件要求較低，受環境干擾物質影響小，測定工具簡單，成本較低，回收率能達約82%［38］，但多次提取轉移和清洗過程可能會損失生物炭顆粒而導致低估。此外，化學氧化法周期過長，操作耗時，當測試大量土壤樣品時工作量較大。經研究證實，重鉻酸鉀與硫酸混合溶液和其他氧化劑相比，對生物炭的消耗最小，同時能氧化大部分非生物炭有機碳［47］。盡管如此，生物炭也并不能完全耐受重鉻酸鉀的氧化，大概有80%的生物炭能夠在氧化中得以保存［20，63］，為了避免過度氧化，試劑濃度、氧化溫度和氧化時間還能根據生物炭自身穩定性進行調整。相比于其他方法，苯多羧酸（BPCAs）分子標記法有著更高的回收率，可達90%以上［23-24］，同時能夠提供生物炭芳香縮合度等特征信息［64］。其中液相色譜法比氣相色譜法穩定性更好，相對于氣相色譜法（變異系數16～23%），液相色譜法有著更小的變異系數（<5%）和更高的BPCAs 分子產量。然而，該方法步驟復雜、預處理繁瑣，需要特殊設備和精密儀器。此外，其他干擾物質如腐殖酸、干酪根和煤炭等也可能在氧化中形成小部分BPCAs 分子而導致高估［65］，元素分析法雖然便捷，但并未得到廣泛應用，仍需大量研究支撐其可行性。顯微鏡法可直觀地觀察到生物炭的形態（粒度、表面特征和顆粒分布），但網格計數對于定量大面積土壤中生物炭的分布十分局限，量化結果變異性較大。熱光學反射法/透射法是變異性最小的定量方法［62］，但此方法難以區分土壤中生物炭和類黑素、煤炭物質，且樣品的明亮度和均勻性也會對該方法造成干擾。中紅外光譜法結合偏最小二乘回歸分析具有經濟快速、不破壞土壤樣品的優點，但需要大量的數據支撐。核磁共振法一般與化學氧化法聯用，成本較高且無法單獨區分生物炭成分。

4 小結與展望

目前，生物炭已普遍用于土壤固碳、土壤改良等領域，但專門用于土壤生物炭的定量方法極少。從實際角度出發，找到精確、便捷并適于常規分析的定量方法將有助于生物炭的應用推廣，對更深入地研究生物炭與土壤系統的相互作用也具有重要意義。根據目前研究發展情況，提出以下看法和建議：

（1）在4 類方法中，屬于熱氧化法的燒失法和化學熱氧化法、化學氧化法中的重鉻酸鉀法以及BPCAs 分子標記法中的元素分析法均具有可觀的回收率，無需精密的測定儀器，操作便捷，有較好的改進前景，比較適于常規定量分析。而光學法回收率偏低，多用于半定量研究和表征，其中光譜技術常與其他方法聯用，可作為提高定量精度的輔助手段。針對燒失法，需經過長期的土壤定位試驗，確定新鮮生物炭與在土壤中經過長時間自然老化后的生物炭的燒失率是否有所不同；重鉻酸鉀法可通過調整試劑濃度、氧化時間和氧化溫度縮短過長的試驗周期；BPCAs 分子標記法中改進的元素分析法雖然簡化了其繁瑣復雜的預處理，回收率與氣相色譜法相當，但仍需通過大量試驗驗證其準確性。

（2）生物炭均勻施入土壤后，生物炭顆粒會在地表徑流的沖刷下滲、翻耕和風力搬運等外力作用下發生遷移，在土壤中形成空間異質性。因此，無論選用任何一種定量方法，合理采集土壤樣品對定量的準確性至關重要，必須進行全面、均勻、具有代表性的土壤采樣。土壤中生物炭的量化實質是有效區分生物炭與土壤中其他影響定量的干擾物質，包括傳統的土壤有機碳如動植物殘體及其降解產物腐殖質等、非生物炭耐火性有機物和土壤礦物。生物炭精確定量的難點即是將這些干擾物質盡可能去除的前提下減少生物炭自身的損耗。

（3）雖然眾多研究者們已開發了多種土壤黑炭定量方法，并都具有較為可觀的回收率，但由于黑炭這一燃燒連續體在土壤中的形式復雜多樣，加之各類方法對檢測黑炭連續體各組分的側重有所不同，不同方法量化結果差異較大且難以相互比較，目前尚未有統一的標準定量方法。土壤生物炭定量方法研究仍然處于起步階段，在篩選出合適的定量方法后，應采用標準的參考物質對不同定量方法進行測試，并設置統一的評價指標如回收率、變異系數等進行比較研究，這是未來生物炭量化方法研究的重點之一。