牛腸道大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

鄭啟銘，梁纖纖，李曉卓，李 月，劉文鍇，韓翔舒，馮繼紅，翟少華*，夏 俊*

（1.新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830000；2.新疆草食動物新藥研究與創制自治區重點實驗室，烏魯木齊 830000；3.新疆畜牧科學院獸醫研究所/新疆畜牧科學院動物臨床醫學研究中心，烏魯木齊 830000；4.農業農村部草食動物疫病防控重點實驗室（省部共建），烏魯木齊 830000；5.石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832061；6.新疆維吾爾自治區呼圖壁縣農業農村局，新疆 昌吉 831100）

細菌性疾病引起的犢牛腹瀉，其多數由大腸桿菌、沙門氏菌、彎曲桿菌、產氣莢膜梭菌等腸道致病菌引起[1]，其中大腸桿菌是引起腹瀉的主要病原菌。犢牛大腸桿菌病又稱犢牛白痢，在臨床上是一種常見疾病，一年四季均可發生，一般在氣溫多變的冬末春初發病率較高。感染途徑主要是通過消化道，子宮和臍帶。該病一旦發生，病死率很高，有時可達100%，牛羊發病時呈地方流行性[1]。犢牛感染后主要臨床表現為體溫升高、腹瀉、脫水等急性腸炎癥狀。腹瀉糞便的狀態多變，有腐臭味，且會黏附在犢牛尾部和后肢。病牛精神沉郁，繼而發生脫水和酸中毒[2]。輕度感染的犢?？赡茏杂?，嚴重感染的犢牛如果不及時治療，幾天內就會死亡。

大腸桿菌根據致病性分型為腸致病性大腸埃希菌（EPEC）、產志賀毒素大腸埃希菌（STEC）、產腸毒素大腸埃希菌（ETEC）、腸聚集性大腸埃希菌（EAEC）、腸出血性大腸埃希菌（EHEC）、侵襲性大腸埃希菌（EIEC）等[3]。各種致病類型的大腸桿菌中的毒素和黏附素等毒力因子是導致牛發生腹瀉等癥狀的主要原因。黏附素性菌毛是產腸毒素性大腸桿菌特有的一類菌毛，主要包括K88（F4）、K99（F5）、987P（F6）及F41，其中以K99 和F41 最為常見[4]。本研究對新疆昌吉地區某牛場腹瀉犢牛的分離菌株進行致病性試驗、耐藥性分析，為該地區牛場治療犢牛腹瀉提供用藥依據，同時為該地區致病性大腸桿菌的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

采自新疆昌吉市某牛場腹瀉犢牛糞便樣品（包括稀便、血便），共30份。

1.1.2 主要試劑

BHI 液體培養基、馬丁肉湯瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、革蘭氏染色試劑盒、DL2000 核酸Marker、200 μL 移液器、100 μL 移液器、10 μL 移液器、藥敏紙片。50×TAE 電泳液按本實驗室常規方法配置，1×TAE：用規格100 mL 的量筒稱取20 mL 的50×TAE，再加入980 mL 的蒸餾水混勻，使其稀釋到1×TAE備用。

1.1.3 試驗動物

清潔級昆明雄鼠10 只，35 日齡，體重大致在22～25 g，購自新疆疾病預防與控制中心實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離

將每份糞便樣品加入5 mL BHI 液體培養基過夜培養后，采用固體平板劃線法將菌液接種于麥康凱瓊脂培養基中，經37 ℃恒溫培養箱過夜培養后，挑取粉紅色單菌落接種于5 mL BHI液體培養基進行純化，置于37 ℃恒溫搖床培養18 h并觀察細菌生長情況。

1.2.2 革蘭氏染色及鏡檢

移液器取適量純化培養后的細菌培養液，依據革蘭氏染色試劑盒的染色步驟進行革蘭氏染色，染色完成后經顯微鏡鏡檢觀察細菌形態特征。

1.2.3 細菌及毒力基因鑒定

1.2.3.1 引物設計與合成 參考文獻進行設計引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物合成后按照所提供的引物合成單進行各引物稀釋，將上、下游引物稀釋成10 μM濃度，稀釋完后將其置于-20 ℃冰箱中保存備用。引物序列見表1。

表1 引物列表

1.2.3.2 PCR 擴增 使用大腸桿菌鑒定引物用于PCR 鑒定，經鑒定為大腸桿菌后再使用K88、K99、F41 毒力基因引物進行PCR 鑒定。采取25 μL 的常規反應體系，上、下游引物各1 μL，2×Taq MasterMix12.5 μL，模板1 μL，水9.5 μL，瞬離后混勻置于PCR擴增儀中進行PCR擴增。擴增條件為：95 ℃預變性3 min，之后94 ℃循環變性30 s，退火溫度為58 ℃，復性20 s，72 ℃延伸1 min，共進行30個循環，72 ℃終延伸5 min，最后于4 ℃保存。

1.2.4 致病性試驗

10 只小鼠隨機分為試驗組及對照組，每組5 只。試驗組小鼠腹腔注射分離菌株菌液，每只0.2 mL；對照組小鼠腹腔注射無菌PBS，每只0.2 mL。

1.2.5 藥敏試驗

采用K-B 紙片法對分離菌株進行抗菌藥物敏感試驗。用移液器吸取200 μL 細菌培養液，之后均勻涂布于馬丁肉湯瓊脂培養基上，待吸收完全后，將藥敏片等距放置于培養基上進行藥敏試驗。于37 ℃恒溫箱培養18 h后判定其結果，藥敏結果判定按CLSI標準。

2 結果與分析

2.1 細菌分離

細菌在麥康凱瓊脂培養基上為邊緣整齊、表面光滑的圓形或橢圓形粉紅色菌落，見圖1。革蘭氏染色鏡檢可見單個存在的紅色革蘭氏陰性短桿菌，見圖2。

圖1 麥康凱瓊脂培養基培養結果

圖2 革蘭氏染色鏡檢圖片（100×）

2.2 細菌及毒力基因鑒定

進行大腸桿菌及毒力基因的PCR檢測后，結果顯示有效擴增出大小為200 bp和543 bp的目的條帶，見圖3、圖4，分離菌株為攜帶毒力基因K99的大腸桿菌。

圖3 細菌大腸桿菌PCR鑒定結果

圖4 細菌毒力基因PCR鑒定結果

2.3 致病性試驗

試驗組小鼠腹腔注射菌液4 h后，陸續開始出現精神沉郁、排黏液性糞便、被毛粗亂等癥狀，12 h后開始陸續死亡。對照組5只全程健康狀況良好，無死亡。

2.4 藥敏試驗

藥敏試驗結果顯示，該分離株對多黏菌素B 中介；對青霉素、氨芐西林、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢哌酮、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、四環素、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、環丙沙星、左氧氟沙星等抗菌藥物耐藥，見表2、圖5、圖6。

圖5 藥敏試驗1

圖6 藥敏試驗2

表2 藥敏試驗結果

3 討 論

犢牛腹瀉是基層牛場常見的流行病，多發于冬末春初等氣溫多變的季節。根據犢牛腹瀉的發病原因及發病特點，可將其分為消化不良腹瀉與傳染性腹瀉。消化不良性腹瀉常呈現散發性，一般出現一過性腹瀉，對牛場養殖不會造成較大的損失。傳染性腹瀉又可分為病毒性腹瀉、細菌性腹瀉、寄生蟲性腹瀉以及混合感染性腹瀉。其中較常引起細菌性腹瀉的病菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、彎曲桿菌、產氣莢膜梭菌等腸道致病菌[5]。這些致病菌中，大腸桿菌為引起犢牛腹瀉最主要的致病菌。以產腸毒素性大腸桿菌最為常見，導致犢牛發生腹瀉的原因主要為產腸毒素大腸桿菌所攜帶的毒素及黏附素基因，主要包括K88（F4）、K99（F5）、987P（F6）及F41，其中以K99 和F41 最為常見[6]。此次在牛源腹瀉糞樣中檢出的E.coli攜帶的毒力因子為K99，通過致病性試驗結果表明此次分離菌株有致病性。

對本次分離出的K99 菌毛大腸桿菌進行藥物敏感試驗，結果顯示該分離菌株對青霉素、氨芐西林、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢哌酮、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、四環素、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、環丙沙星、左氧氟沙星等抗菌藥物均耐藥。以上十七種抗菌藥物涉及八類，但均顯示不同程度的耐藥。該分離菌株只對多黏菌素b 中介。楊艷麗[7]等研究發現新疆地區牛源E.coli 對喹諾酮類藥物諾氟沙星、環丙沙星、左氧氟沙星均產生不同程度的耐藥性。許淑蕓[8]等的研究顯示石河子地區牛源E.coli 對β-內酰胺類藥物頭孢唑林、阿莫西林、青霉素、頭孢他定等抗生素耐藥性較高。郭慶勇[9]等的研究顯示伊犁某牛場的糞源大腸桿菌不同生長階段均對氨基糖苷類及β-內酰胺類抗生素耐藥。本試驗檢測分離的E.coli 也對各類抗菌藥物表現出不同程度的耐藥性，與三人的研究結果基本一致，同時對四環素類、林可酰胺類及大環內酯類同樣存在耐藥性，這一現象可能是由于該地區牛場使用這些抗菌藥物較多。本次分離菌株的耐藥性試驗可為該牛場犢牛細菌性腹瀉防控工作提供用藥選擇依據，并為制定合理的抗菌治療方案提供參考。

綜上所述，在防控細菌流行病時，由于抗菌藥物濫用易導致致病菌耐藥性增加從而給牛場防控疫病的工作開展造成困難。在治療細菌流行病時，應根據細菌藥敏試驗結果選擇有效抗菌藥物[10]，并且制定合理的治療方案，杜絕無理論依據和臨床指癥的抗菌治療。目前市面上已經有效果較好的大腸桿菌疫苗及K99滅活苗，在防控大腸桿菌腹瀉病時可選擇滅活苗，有效做到未病先防。

4 結 論

本次從該牛場分離到的攜帶K99 毒力基因的大腸桿菌菌株，對小鼠有一定的致病力，并且藥物敏感試驗結果表明其對青霉素、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢哌酮、鏈霉素等多種抗菌藥物耐藥。提示該地區導致犢牛腹瀉的大腸桿菌耐藥嚴重，防治過程中應根據藥物敏感試驗結果選藥，并規范使用。此外，也提示大腸桿菌疫苗的開發或引進作為防控犢牛大腸桿菌病的另一個途徑應該得到重視。