海南省某奶牛場“兩病”凈化效果監測分析

韓 榮，朱建明，趙華林

（1.新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052；2.海南志勤畜牧業技術研究院，海南 三亞 572000）

奶?！皟刹　笔侵覆剪斒暇『团＝Y核病，兩者均為我國二類動物疫病[1]。世界動物衛生組織（OIE）列為B 類動物疫病。布魯氏菌?。ú疾。┦且环N由布魯氏菌引起的人畜共患傳染病，也被稱為“馬耳他熱”或“波浪熱”[2]。它在臨床上的特征是母畜發生流產和不孕，而公畜則發生睪丸炎、附睪炎和關節炎[3]。牛結核病是一種慢性傳染病，由牛結核桿菌引起，也會在人畜之間傳播[4]，其臨床特點是產乳量迅速下降，懷孕母?？赡馨l生流產，體溫可上升到40 ℃以上，呈稽留熱、呼吸極度困難，最后窒息而死[5]。海南省目前沒有發現牛種布魯氏菌，主要是羊種3 型和豬種3 型[6-7]，未發現牛結核病[8]。牛布病診斷方法主要是通過血清學技術，虎紅平板凝集試驗（RBT）進行初次篩查、試管凝集試驗（SAT）做確診；牛結核病檢測方法主要為免疫學檢測，即牛結核菌素皮內變態反應（PDD）。

隨著海南建設“自由貿易港”和“國際旅游島”的快速發展，牛肉及牛奶制品需求量猛增，保證畜產品安全和高質是海南畜牧業在新時代面臨的緊迫要求。同時海南省屬我國的無規定動物疫病區重點建設省份之一[9-10]，防控和凈化奶牛場“兩病”是建設“無疫區”的重點內容。持續開展奶牛場“兩病”監測對保證海南奶牛養殖業健康發展和公共衛生安全具有重大意義。加大對奶牛主要疫病的凈化，將為海南畜牧業建設動物多病種無疫區提供基礎保障。

1 材料與方法

1.1 牛場背景

海南省某牛場于2017 年從澳大利亞引進娟珊牛500 頭。通過自繁自育，現有育成牛229 頭、生產母牛168頭、犢牛90頭，均未免疫接種牛布魯氏菌病、牛結核病疫苗。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

布魯氏菌病虎紅平板凝集抗原、布魯氏菌病陽性血清、布魯氏菌病試管凝集試驗抗原、提純牛型結核菌素、虎紅反應板，均購自哈藥集團生物疫苗有限公司。

1.2.2 主要儀器

恒溫培養箱、微量加樣器、游標卡尺、5 mL注射器、微量振蕩器、冰箱、離心機。

1.3 試驗方案

1.3.1 布病檢測

采集奶牛血樣，按照國標《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB/T 18646-2018）[11]操作先進行RBT 初次篩查，然后將初篩為陽性個體再進行SAT 復檢。確診為布病陽性的奶牛為陽性個體；陽性個體所在的場群為陽性污染場群。對陽性場開展全群采樣檢測，撲殺陽性個體，隔離飼養其余健康牛，以后每月進行一次隨機采樣檢測；連續三個月未檢測到布病陽性后，將該場設定為假設健康場群，對其進行常規監測。

1.3.2 牛結核檢測

按照國標《動物結核病診斷技術》（GB/T18645-2020）[12]進行操作，通過PDD 檢測牛結核病，對初檢陽性的牛60 d后復檢，對復檢陽性的牛進行撲殺與無害化處理。

1.4 樣品采集

常規消毒后，采集6月齡的母牛與產后半月至1個月的犢牛靜脈血樣2～5 mL。

1.5 檢測方法

1.5.1 虎紅平板凝集試驗（RBT）

（1）提前1 h從冰箱取出被檢血清、布魯氏菌標準陰、陽性血清和虎紅平板凝集實驗抗原，平衡到和室溫一致；

（2）將30 uL 被檢血清和30 uL 虎紅抗原加在一次性虎紅反應板內，使用滅菌槍頭快速混勻，4 min內讀取結果；

（3）每批次試驗同時用陰性、陽性血清各一份作對照；

（4）結果判定：在標準陰性血清不出現凝集，標準陽性血清出現凝集時，試驗成立，方可對受檢血清進行判定。出現肉眼可見的凝集反應判定為陽性，記為“+”，無凝集現象且反應混合液呈均勻粉紅色者判定為陰性，記為“-”。

1.5.2 試管凝集試驗（SAT）

（1）提前1 h從冰箱取出被檢血清，布魯氏菌病陽性血清和試管凝集抗原，平衡到和室溫一致；

（2）取6 支試管放于試管架上，依次編號，1 號管為血清對照管，2～5 號為試驗管，6 號為抗原對照管；

（3）血清稀釋：1號管加2.3 mL生理鹽水；2號管不加，第3～6號管各加入0.5 mL生理鹽水。取受檢血清0.2 mL，加人1號管內，并混合均勻；從1號管中吸0.5 mL 混合液加入2號管并充分混勻，以此類推，做倍比稀釋，到第5號管棄去混勻液0.5 mL；

（4）試管凝集抗原做10倍稀釋：即1 mL抗原加9 mL生理鹽水混勻；從2號管開始各加入0.5 mL，加入抗原之后血清的最終稀釋倍數為：從2號管開始為1:25、1:50、1:100、1:200、1:400；

（5）標準比濁管的配置:取5 支試管依次編號；取2 mL 生理鹽水和（4）中抗原稀釋液2 mL 加入燒杯中混勻；1號管加1 mL生理鹽水，2號管加0.25 mL抗原稀釋液和0.75 mL生理鹽水，3號管加0.5 mL抗原稀釋液和0.5 mL 生理鹽水，4 號管加0.75 mL 抗原稀釋液和0.25 mL 生理鹽水，5 號管加1 mL 抗原稀釋液；

（6）將加樣后的試管充分搖勻置37 ℃培養箱20～24 h，取出室溫下放置1 h，檢查并記錄結果；

（7）結果判斷：1號血清對照管清亮無沉淀，6號抗原對照管均勻渾濁，在兩種對照管都成立的情況下將試驗管與標準比濁管作比較，如果試驗管透明度與1號比濁管相近，菌體呈傘狀沉淀或塊狀沉淀，標記為“++++”呈100%凝集；試驗管透明度與2號比濁管相近，菌體呈傘狀沉淀，標記為“+++”呈75%凝集；試驗管與3號比濁管相近，菌體呈較薄傘狀沉淀，標記為“++”呈50%凝集；試驗管與4號比濁管相近，管底有不明顯的傘狀沉淀，標記為“+”呈25%凝集；如果試驗管不透明無沉淀，標記為“-”呈陰性。

1.5.3 牛結核菌素皮內變態反應（PDD）

（1）提前1 d在牛頸中部上1/3處剪毛或剃毛，三月齡以內的犢牛在肩胛部作試驗，用游標卡尺測量術部中央皮皺厚度，作好詳細記錄；

（2）用生理鹽水稀釋每毫升含10萬國際單位后使用。不論牛只大小，一律皮內注射0.1 mL；

（3）注射后72 h 后，觀察局部有無熱痛腫脹等炎性反應，并用游標卡尺測量術部皮皺厚度，作好詳細記錄；

（4）凡判斷為可疑反應的牛，即刻在另一頸部以同一批結核菌素進行第二次注射，再經72 h后觀察反應；

（5）判斷標準：陽性反應，局部有炎性反應，皮厚差等于或大于4.0 mm；可疑反應，局部炎性反應較輕，皮厚差在2.1～3.9 mm；陰性反應，無炎性反應，皮厚差在2.00 mm以下。

2 結果與分析

2.1 布病檢測結果

2.1.1 檢測

2020-2023 年采集牛血樣共2 104 份。其中，RBT 初篩陽性73 份，平均個體陽性率為3.5%；SAT試驗確診陽性0份，陽性率為0，見表1。表明該奶牛場未檢出布魯氏菌病。

表1 奶牛場布病血清學檢測結果

2.1.2 時間分布

如表1 所示，該奶牛場的RBT 陽性率2020 年為5.7%，2021 年為3.3%，2022 年為2.3%，2023 年為1.8%，呈逐年下降趨勢，表明該牛場布病凈化工作效果顯著。

根據布魯氏菌病初檢結果，一個月后重新采集73頭RBT陽性奶牛的血清，再次進行布魯氏菌病RBT 初篩與SAT 確診。結果顯示，RBT 陽性依然為73 頭，SAT 確診陽性依然為0 份。綜上表明該奶牛場為未患布魯氏菌病牛場。

2.2 牛結核檢測結果

2020—2023 年，總計對2 063 頭奶牛進行PDD 試驗檢測。結果顯示，疑似PDD 陽性奶?？傆?0頭，見表2。對初檢疑似PDD 陽性的80 頭奶牛60 d 后進行PDD 復檢，結果顯示，陽性頭數均為0，表明該牛場為未患牛結核病牛場。

3 討 論

目前海南省對奶?！皟刹　眱艋裱皺z測-撲殺-監測-凈化”原則。從2020-2023年監測數據顯示，海南該牛場未發現“兩病”病例，達到了凈化標準，表明該牛場已初步建成奶?！皟刹　眱艋瘓?。

在凈化監測中，RBT 檢測初篩的陽性率為3.5%，而SAT 檢測確診的陽性率為0%，此情況與劉坤洋等[11]研究報道相一致。本研究顯示，RBT檢測很容易受到特異性抗體的影響呈假陽性。因此在檢測中應當保證樣品新鮮，避免樣品反復凍融和溶血等因素的干擾。而SAT具有較高的特異性和敏感性[12]，能更準確的檢測出布病。PDD 疑似陽性率為3.8%，復檢陽性率為0%，此情況與李文文和雷程紅等[13-14]研究報道相一致。本研究表明，感染其他分支桿菌而致敏的動物沒有特異性，因此不能判斷病情，同時因病情嚴重而導致免疫反應低下的動物也易出現假陽性。此外，提純結核菌素質量、劑量、判定標準及操作等因素的影響也易產生誤差[15]。如荷蘭英特威的結核菌素，每頭牛的劑量為3 000IU[16]，而國產為10 000IU[17]，國際獸疫局規定為3 250IU，不低于2 000IU[18]。國內結核菌素檢疫劑量遠遠超過國際標準劑量，這就導致了結核病陽性和疑似病例的數量增加。因此，本研究嚴格按照說明書劑量檢疫，對于初檢判為疑似反應的80頭奶牛距上次檢疫60 d后復檢，結果陽性0頭，陽性率為0，由此可見，該牛場未患有牛結核病。

4 結 論

海南該奶牛場2020-2023年連續4年未檢出布魯氏菌病和牛結核病，凈化工作成效明顯，表明該奶牛場已進入凈化維持階段，已建成海南省首個奶?！皟刹　眱艋瘓?。針對海南奶牛場的實際氣候環境和飼養管理狀況，該牛場將繼續提高疫病防控執行力度，每年至少進行兩次針對奶牛布魯氏菌病和牛結核病的有效檢測，保障當地奶牛業穩定發展。