基于環境DNA 的長江中華鱘分布特征探究

周權，杜浩，王潔，邵蕓，閆振廣*

1.環境基準與風險評估國家重點實驗室，中國環境科學研究院

2.中國水產科學研究院長江水產研究所

中華鱘(Acipenser sinensis)是我國一級水生野生保護動物，屬于鱘形目(Acipenseriformes)、鱘科(Acipenseridae)、鱘屬(Acipenser)。中華鱘作為古老而珍稀的軟骨硬磷魚類，在生物進化、地球變遷等方面具有重要的學術研究價值，而且中華鱘的歷史比現代長江還要悠久，可謂地質年代的活化石，有人將中華鱘比作“水中大熊貓”，是長江流域重要的鱘類旗艦物種[1]。中華鱘曾廣泛分布于我國黃海北部海洋島至海南省萬寧市近海，甚至遠至海外[2]，但是近年來中華鱘資源量急劇下降，1988 年中華鱘被列為國家一級重點保護動物，并進入瀕危物種名單[3]，2010 年，中華鱘被世界自然保護聯盟（International Union for Conservation of Nature，IUCN）發布的物種紅色目錄列為CR（極危）等級物種。中華鱘的瀕危情況受自身種群質量、人類活動及環境變化等多方面的綜合影響[4]，人類活動和環境變化對中華鱘的脅迫更呈現出了多樣性與復雜性[5]。中華鱘屬于底棲性魚類，有洄游習性，在淡水中出生，在海洋中成長發育至性成熟后，洄游到淡水河流中產卵，繁殖期后再返回海洋。研究發現，長江中華鱘種群接近性成熟的個體在6—8 月進入長江口進行溯河生殖洄游，于次年10—11 月到達長江上游和葛洲壩下產卵場[6]。在空間分布上，中華鱘在洄游過程中多分布于江水的中下層，沿主河槽遷移，偶爾有向上層或露出水面遷移的現象[7]。

監測中華鱘的方法多樣，可以利用聲吶、水下攝影、食卵魚解剖等方法觀測中華鱘的具體個體，還可以通過地理信息系統（GIS）和遙感系統（RS）調查中華鱘[8]，也可以利用放流標記追蹤技術、衛星標記技術研究放流的中華鱘分布情況[9]。目前中華鱘監測常用的方法為分子檢測方法，包括基于核苷酸微衛星開發的聚合酶鏈反應（PCR）[10]、利用微衛星DNA 探索中華鱘繁殖行為[11]，以及通過線粒體DNA 研究中華鱘遺傳多樣性[12]。但是這些方法都需要觀測到中華鱘個體，甚至取得其組織樣品，取樣困難并且調查成本高昂。如何在流域尺度上開展中華鱘監測仍然是難題[13]。

長江大保護中關于禁漁的要求使得對長江魚類進行無損監測更加迫切，近年來，環境DNA（eDNA）技術越來越多地被用于生物多樣性研究[14]。eDNA檢測是一種對生物體無損的環境友好型監測技術，eDNA 是指來自目標物種的生物外遺傳物質，它允許在不直接觀察或捕獲整個生物體的情況下，通過生物體脫落的細胞和糞便等釋放到環境中的DNA 檢測到物種的存在或最近的存在[15]，這些DNA 可能是來自各種來源的線粒體或核DNA，包括脫落的部分生物體組織、尿液、黏液、卵子或精子等，可以以細胞和細胞外形式存在[16]。因此eDNA可以實現對生物體的無創監測，還可以提高監測特異性和敏感性，這些特點都十分適合研究長江中華鱘。eDNA 技術于2008 年首次用于追蹤美國牛蛙的分布，此后被廣泛用于檢測兩棲動物和魚類[17]。與傳統的人工形態學調查方法相比，eDNA 方法具有省時省力等優勢[18]，既可以用于調查一定區域內的生物類群遺傳信息[19]，又可以對外來種或入侵種的擴散趨勢進行監測，目前已經有研究嘗試將eDNA 技術納入水生態安全監測體系[20]。這些研究進一步表明了用eDNA技術調查和研究中華鱘的可行性。

目前，利用eDNA 對長江魚類進行研究已有不少探索[21]，其中已有學者利用eDNA 方法研究中華鱘的分布特征。如探討宜昌—南京江段中華鱘eDNA 的季節性分布特征[22]、長江口特定區域內中華鱘的種群特征[23]，以及宜昌江段中華鱘的月度變化特征[24]等。由于中華鱘洄游時大部分在中下層水域游動，不同水層中華鱘eDNA 的豐度可能因此有差異，目前有關在長江水體中分層采集中華鱘eDNA 的研究鮮有報道，在長江流域不同區域同時開展中華鱘eDNA 采樣及豐度對比分析的研究也少見。筆者篩選評估了文獻報道的中華鱘eDNA 引物，并用篩選后的特異性引物擴增了從中華鱘產卵場（宜昌江段）至長江入?？诘? 個點位的中華鱘eDNA，分析了不同點位以及不同水層中檢測到的中華鱘eDNA 的差異，以期為后續基于eDNA 開展中華鱘種群研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織樣品DNA 提取

中華鱘、長江江豚（Neophocaena asiaeorientalis）、達氏鱘（Acipenser dabryanus）的肌肉組織采集自中國水產科學研究院長江水產研究所，青魚（Mylopharyngodon piceus）、草魚（Ctenopharyngodon idella）、鰱（Hypophthalmichthys molitrix）和鳙（Aristichthys nobilis）購自市場。取保存完好的上述7 種動物的肌肉組織30 mg，采用TIANGEN 公司的海洋動物組織基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型），依據使用說明書分別提取動物基因組DNA，主要步驟如下：56 ℃水浴條件下加入緩沖液溶解組織樣品，溶解完全后加入后續緩沖液和無水乙醇處理，轉移至吸附柱上加多種緩沖液離心，最后滴加洗脫緩沖液TE 洗脫DNA，將所得DNA 樣品保存于?80 ℃備用，作為下一步特異性引物篩選的模板。

1.2 特異性引物篩選

以“中華鱘”“達氏鱘”“引物”“環境DNA”“eDNA”“基因”“擴增”等為關鍵詞，檢索中國知網（CNKI）和Web of Science 文獻數據庫，得到4 組中華鱘特異引物（表1），對這些引物進行擴增特異性驗證及篩選，以供建立中華鱘eDNA 擴增方法參考。

表1 文獻發表的中華鱘基因擴增引物Table 1 Literature published on Acipenser sinensis gene amplification primers

合成表1 中引物，以江豚、中華鱘、達氏鱘和青魚、草魚、鰱、鳙組織提取到的DNA 樣品為模板，用不同的引物進行PCR 擴增，通過凝膠電泳比較分析PCR 產物特異性。使用2×Fast HiFi PCR MasterMix（GeneZe）進行PCR 擴增，25 μL 擴增體系包括稀釋成50 ng/μL 的模板1 μL，每個引物各0.5 μL（10μmol/L），12.5 μL 的2×Fast HiFi PCR MasterMix。反應條件為94 ℃預變性5 min。熱循環包括：94 ℃變性30 s；參照不同引物報道的擴增條件，選擇對應的退火溫度，引物1～4 分別為50、56、55、50 ℃，擴增30 s；72 ℃延伸1 min，共進行35 個循環；最終72℃延伸5 min。將PCR 產物用1.5%～2.0%的瓊脂糖凝膠檢測，根據所測PCR 產物的電泳圖譜和回收到的樣品濃度對這4 組引物進行特異性檢測。

1.3 環境DNA 樣品采集

2022 年9 月，選擇長江流域中有中華鱘和長江江豚調查報道的4 個相關區域進行eDNA 樣品的斷面采樣。采樣斷面包括長江中游葛洲壩下中華鱘產卵場附近的宜昌江段區域〔斷面南側采樣點（111.293 7°E，30.681 1°N）、斷面北側采樣點（111.295 5°E，30.683 3°N）〕，長江中游岳陽市洞庭湖湖口附近區域〔斷面西側采樣點（113.102 1°E，29.404 2°N）、斷面東側采樣點（113.105 4°E，29.399 7°N）〕，長江中下游分界九江市鄱陽湖湖口附近區域〔斷面西側采樣點（116.217 8°E，29.745 8°N）、斷面東側采樣點（116.221 6°E，29.744 7°N）〕，以及上海崇明島和長興島之間靠近長江入?？诟浇鼌^域〔斷面南側采樣點（121.737 5°E，31.422 8°N）、斷面北側采樣點（121.761 7°E，31.455 5°N）〕。4 個采樣點的具體分布見圖1。

圖1 4 個采樣區域特征和采樣點位分布Fig.1 Characteristics of four sampling areas and distribution of sampling points

在每個采樣斷面分左右岸分別使用采水器采集水下0.5 m 作為表層水樣和水下15 m 作為底層水樣，在每個采樣點采集1 份5 L 水樣，采集器在使用前進行漂洗和消毒，采集人員佩戴一次性手套，取樣后更換。共計采集16 個點位的eDNA 樣品，具體點位編號和命名：Y1（宜昌北側表層），Y2（宜昌北側底層），Y3（宜昌南側表層），Y4（宜昌南側底層）；D1（洞庭湖湖口東側表層），D2（洞庭湖湖口東側底層），D3（洞庭湖湖口西側表層），D4（洞庭湖湖口西側底層）；P1（鄱陽湖湖口東側表層），P2（鄱陽湖湖口東側底層），P3（鄱陽湖湖口西側表層），P4（鄱陽湖湖口西側底層）；S1（長江入?？诒眰缺韺樱?，S2（長江入?？诒眰鹊讓樱?，S3（長江入?？谀蟼缺韺樱?，S4（長江入?？谀蟼鹊讓樱?。水樣使用真空泵現場抽濾，將5 L 水樣 的eDNA 抽濾至1 張0.45 μm 孔徑的PES 濾膜（Pall Corporation）上，過濾同樣體積的純凈水作為陰性對照。將濾膜裝于5 mL 凍存管中，冷凍運輸回實驗室，儲存于?80 ℃超低溫冰箱，之后盡快進行DNA 提取。

1.4 環境DNA 提取和PCR 擴增

使用QIAGEN 公司的DNeasy? PowerWater?Kit 試劑盒提取濾膜DNA 樣本，具體過程：將5 L 水樣過濾得到的濾膜剪裁，加入裂解液后在渦旋振蕩器上振蕩，離心取上清液加入后續溶液處理，轉移至離心柱上，離心柱用多種緩沖液洗滌后加入100 μL的洗脫液洗脫得到eDNA 樣品，將提取的eDNA 樣品置于?80 ℃冷凍保存。不同采樣點的樣品分開保存，避免交叉污染。

以4 個點位提取的eDNA 樣品為模板，選取經組織樣品篩選得到的特異性較高的引物，用相同條件擴增，同樣取50 ng 的eDNA 樣品作為模板，使用步驟2 中特異性引物的擴增體系和擴增條件進行PCR 擴增。PCR 產物使用TaKaRA MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（TaKaRa）膠回收試劑盒回收目的片段。

1.5 測序和數據分析

已有研究表明，根據中華鱘基因設計的引物可以很好地區分中華鱘和長江中的常見魚類，但是會檢測到一些親緣較近的鱘魚，可以通過測序將不同種類的鱘魚區分出來[22]。本研究采用高通量測序的方法檢測中華鱘的eDNA，有效避免長江中其他鱘類eDNA 的干擾。

將成功擴增的片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司，連接測序接頭建庫后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小，使用Qubit3.0 熒光定量儀將所有樣本按照1∶1 的等體積混合進行文庫濃度測定。使用Illumina Miseq?平臺（美國）進行高通量測序，測序原始數據文件經堿基識別（base calling）分析轉化為原始測序序列（sequenced reads）。去除引物接頭序列測序后，將得到的PE reads 根據overlap關系進行拼接，將成對reads 拼接成1 條序列，根據各樣本barcode 序列和引物序列拼接后數據中分割出各樣本數據，并校正序列方向，區分樣本后，對序列質量進行質控、過濾，最后得到各樣本測序結果。

操作分類單元（OTUs）是在系統發生學或群體遺傳學研究中，為了便于分析人為給某一個分類單元（品系、屬、種、分組等）設置的統一標志。從各樣本測序結果中提取非重復序列，所有樣本去冗余序列合并后去除沒有重復的單序列；按照97%相似性對非重復序列進行OTUs 聚類，在聚類過程中去除嵌合體，最終得到OTUs 的代表序列。將所有優化序列比對至OTUs代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列，從而完成OTUs 聚類。利用BLAST（basic local alignment search tool）將序列與NCBI（National Center for Biotechnology Information）數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行比對，篩選出序列的最佳比對結果，并對比對結果進行過濾，以相似度大于97%的序列注釋OTUs 以用于后續分類，進一步驗證引物的特異性，分析中華鱘eDNA 分布特征。

2 結果

2.1 引物特異性評估

通過瓊脂糖凝膠電泳對不同引物的擴增產物進行比較，對比檢測結果發現，表1 中的2 號引物的特異性最強，該引物的巢氏PCR 第1 輪擴增結果見圖2。通過觀察不同組織在100～600 bp 范圍內的擴增產物可以發現，使用其外引物即可得到特異性的鱘類PCR 產物（第1～4 泳道），擴增條帶大小與2 號引物第1 輪擴增產物310 bp[22]大小相吻合。由圖2可知，中華鱘肌肉和肝臟組織擴增的PCR 產物條帶（第1 泳道和第2 泳道）最清晰；達氏鱘的肌肉和肝臟組織也能被擴增出較為明顯的產物條帶（第3 泳道和第4 泳道），但不如中華鱘的特異性強；而2 號引物對于江豚和青魚、草魚、鰱、鳙組織的基因擴增條帶很模糊，說明2 號引物適合于鱘類基因的擴增，特別對中華鱘基因的擴增效果良好。

圖2 長江中華鱘引物特異性評估2 號引物凝膠電泳圖譜Fig.2 Primer specificity evaluation gel electrophoresis pattern of primer No.2 of Chinese Sturgeon

2.2 環境DNA 提取、擴增和測序

將所得濾膜樣品進行DNA 提取后，成功提取總計16 個點位的eDNA 樣品。以提取的環境樣品為模板，使用篩選得到的2 號引物，成功擴增回收純化得到中華鱘的目的基因片段。樣品測序的稀釋曲線見圖3。16 條曲線對應16 個采樣點位編號，隨測序得到的reads 數增加，各樣品OTUs 種類數均到達平臺期，判斷本次測序深度適宜。

圖3 不同點位eDNA 測序樣品的Alpha 指數稀釋性曲線Fig.3 Alpha exponential dilution curves of sequenced samples at different sampling points

2.3 eDNA 檢測到的中華鱘分布情況

將測序得到的序列進行聚類得到OTUs 后，通過比對NCBI 數據庫對序列進行注釋，成功注釋出4 種長江現有鱘類，分別是中華鱘、達氏鱘、雜交鱘（Acipenser_dabryanus×Acipenser_schrenckii）和史氏鱘（Acipenser schrenckii）。各點位獲得的鱘類OTUs中所含的reads 數量見圖4 和表2。

圖4 各采樣點位檢測獲得的鱘類OTUs 所含reads 數Fig.4 Number of reads contained in sturgeon OTUs detected at each site

表2 各點位檢測到的鱘類OTUs 所含reads 數Table 2 Number of reads contained in sturgeon OTUs detected at each site 個

由表2 可以看出，在16 個點位中，達氏鱘僅在個別點位有少量檢出，史氏鱘在各點位都有少量檢出，各點位的雜交鱘reads 檢出量最多。中華鱘reads 在各點位均有檢出，其中宜昌江段斷面最多，洞庭湖湖口斷面最少，16 個點位中，Y1 點位水樣中中華鱘reads 檢出量最高，D2 點位水樣的中華鱘reads 檢出量最低。就4 個區域來說，宜昌江段斷面的中華鱘reads 數量最多，每個樣品平均檢出46 767個；其次是鄱陽湖湖口斷面，平均檢出35 607 個；最少的是洞庭湖湖口斷面，平均檢出13 500 個。各區域相比，長江入?？跀嗝嫦啾榷赐ズ跀嗝嫫骄?11.07%；鄱陽湖湖口斷面與長江入?？跀嗝嫦啾绕骄?4.96%；宜昌江段斷面與鄱陽湖湖口斷面相比平均多31.34%。最多的宜昌江段斷面數量是最少的洞庭湖湖口斷面數量的3.46 倍。

同時，對比表層和底層樣品中測得的中華鱘eDNA 數據（圖5）可知，洞庭湖湖口斷面檢出的中華鱘eDNA 表層比底層總計多5 倍以上，表層和底層的差異最為明顯；宜昌江段斷面兩側點位檢出的中華鱘eDNA 表層與底層相差2.87%，2 種水深檢出的eDNA 差異較??；鄱陽湖湖口斷面表層比底層總體上少21.99%，是所有區域中唯一表層比底層檢出中華鱘eDNA 少的區域；長江入?？跀嗝姹韺颖鹊讓涌傆嫸嗔?8.7%，表層中華鱘eDNA 的檢出量較高。從4 個斷面整體上看，表層水樣中檢出的中華鱘eDNA 比底層水樣多了19.13%，其中，部分斷面表層和底層水樣間差異十分明顯，而有的斷面不同水層檢出的eDNA 差異則較小?？梢钥闯鲈诖蠖鄶禂嗝?，不同水深條件下中華鱘eDNA 的檢出量存在一定差別。

圖5 不同點位表層和底層水樣檢出中華鱘eDNA 情況Fig.5 eDNA of Chinese Sturgeon detected in the surface and bottom water samples at different sampling points

3 討論

3.1 eDNA 檢測中華鱘分布的可行性及其優勢

中華鱘的穩定有效監測是保護中華鱘的重要手段之一，在目前長江大保護[27]和10 年禁漁的背景下[28]，要利用中華鱘組織樣本對中華鱘的遺傳多樣性、分布情況或者種群特征進行研究，只能依靠偶然獲得的少量個體樣本[13]，該方法可以得到的序列遺傳信息較少，且樣品來源不穩定。而使用eDNA 對中華鱘[29]進行無損且高效的檢測是行之有效的方法。

利用eDNA 可以調查生物多樣性[30]或者珍稀動物[31]，eDNA 已經用于大范圍檢測魚類種群分布[32]，甚至用于研究大型水生動物鯨鯊的遺傳多樣性[33]。我國也有利用eDNA 調查長江上游珍稀魚類[34]和長江中下游旗艦物種江豚的分布特征[35]等成功案例，前人研究為使用eDNA 監測中華鱘奠定了一定的基礎[22,24]。本研究選取了從葛洲壩到入?？诘拈L距離江段中的歷史產卵場、兩大通江湖泊湖口和長江入?？? 個典型區域的斷面，分表、底兩層進行取樣，在時間上選取了臨近中華鱘繁殖期之前，中華鱘向葛洲壩下產卵場移動這一中華鱘活動較為活躍的9 月進行采樣，可以在一定程度上揭示繁殖期前的中華鱘種群分布情況。

3.2 eDNA 檢測到的中華鱘分布情況

研究中，通過組織樣品篩選得到了有較高特異性的中華鱘基因擴增引物，并成功從4 個采樣點的表層和底層的環境樣品中，擴增得到中華鱘的目的基因序列，表明篩選出的特異性引物能有效檢測中華鱘的eDNA。除成功擴增出中華鱘目的基因序列外，測序還得到了之前報道存在于長江中的雜交鱘的大量eDNA 和少量的史氏鱘以及極少的達氏鱘eDNA，檢測結果與長江歷史調查中的鱘類物種一致[36]。測序結果顯示雜交鱘在各點位eDNA 的檢出量均明顯高于中華鱘，表明作為外來物種的雜交鱘可能在長江中廣泛存在。前人對長江魚類的研究中也有不少中華鱘的觀測記錄，其中2017 年7—10 月底在長江口區域，皆檢測到了中華鱘幼體[37]；在對宜昌葛洲壩下游中華鱘產卵場的調查中，也曾長期監測到中華鱘在該水域的活動[38]；對洞庭湖和鄱陽湖的魚類調查研究中，也觀測到中華鱘的出現[39-40]。這些報道均與本研究揭示的4 個區域檢測到的中華鱘eDNA 相一致，表明了eDNA 技術在檢測中華鱘分布特征方面的可行性。

本次調查時間為9 月，檢出的中華鱘序列在宜昌江段豐度最高，推測是因為中華鱘即將進入繁殖期（11 月）[6]，開始頻繁出現在宜昌；鄱陽湖口中華鱘序列數高于入?？?，可能是因為中華鱘游入長江產卵時間為6—8 月，調查時中華鱘已經大部分游過長江口。從調查點位表層和底層樣品的檢出結果對比可以發現，中華鱘eDNA 在表層水樣和底層水樣的檢出有明顯差別，這可能是因為中華鱘在洄游過程中，多分布于江水的中下層，偶爾移至上層[7]，因此不同水深檢出中華鱘eDNA 的差異性也值得關注。而在對于eDNA 采樣的空間結構相關研究中也發現，在空間上更全面地采樣可以揭示物種更加精細的分布模式[41]。建議在今后的長江中華鱘eDNA 調查中可采用混合或者立體采樣，這樣比單一空間位點的采樣能夠更加全面地采集到中華鱘的信息。

本文通過水生動物組織篩選得到特異性引物，從測序結果上看，其可能是適用于長江現有鱘類的通用引物，僅從產物電泳結果上看不易嚴格區分鱘類，但可以通過測序將長江中的鱘類區分開。后續研究可以通過繼續開發新的特異引物，或者依靠長江鱘類分布的區域性特征和區域的歷史調查結果，更加精確地區分引物，并通過高通量測序對長江鱘類進行準確識別。

4 結論

（1）從4 對中華鱘相關引物中篩選得到了有較高特異性的中華鱘基因擴增引物，從環境樣品中檢測出中華鱘eDNA 并成功測序驗證。

（2）使用篩選得到的特異性引物共測得了包含中華鱘在內的4 種長江鱘類基因，通過測序很好地區分了4 種鱘類，其中雜交鱘的eDNA 檢出量最高，中華鱘其次，達氏鱘的eDNA 檢出量最低。作為長江外來物種的雜交鱘可能在長江中廣泛存在，中華鱘eDNA 的檢測結果也與之前報道的中華鱘的形態學觀察較為吻合。

（3）中華鱘eDNA 在宜昌江段檢出量最高，可能是因為中華鱘即將進入繁殖期，開始出現在宜昌河段準備繁殖。中華鱘eDNA 在表層水樣和底層水樣的檢出量有一定差別，后續中華鱘eDNA 調查采用混合或者立體采樣可能會比單一空間位點的采樣能夠得到更加豐富的eDNA 信息。還可以通過開發新的特異引物，或者與其他調查方法相結合的方式開展更全面的調查研究，以保護中華鱘。