基于高效液相色譜-串聯質譜測定孕婦血清中7種全氟和多氟化合物及新生兒神經行為評價

王梓皓, 梁鳳至, 陳學蓉, 吳 萍, 吳 微

(湖北中醫藥大學檢驗學院, 湖北 武漢 430065)

全氟和多氟化合物(PFASs)是一類新興的環境內分泌干擾物,常被用于表面活性劑[1]、洗滌劑[2]、防火泡沫[3]、皮革制品和食品包裝的制造等[4]。PFASs的半衰期很長,其從產品中釋放后可廣泛分布于空氣、水、土壤中[5-7]。除此之外,PFASs也廣泛存在于各種食品中(如蔬菜、乳制品、飲料、雞蛋、肉類制品、魚類和貝類),而飲食攝入也是人類接觸PFASs的另一重要途徑[8-10]。由于PFASs中的C-F鍵具有較強的穩定性,PFASs表現出極強的持久性,并具有生物蓄積性和毒性[11]。研究表明,PFASs在人體血液和肝臟中所檢測到的含量最高[12,13]。血清蛋白是PFASs結合的主要目標物,這可能是因為PFASs具有生物富集性[14]。然而,目前PFASs的檢測基質大多局限于水、食品、紡織品等,有關血液樣品中PFASs的檢測方法較少。因此,建立血液中多種PFASs的快速、準確定量檢測方法,對監測人群PFASs的暴露水平具有重要意義。

孕婦作為特殊人群,其宮內遭遇的環境應激可以決定子代出生后的疾病風險[9,15]。日本的一項研究表明,孕婦體內全氟壬酸(PFNA)的含量與新生兒的體長呈負相關[16]。上海市疾病預防控制中心針對本轄區的一項調查發現,孕期全氟辛酸(PFOA)暴露會干擾孕婦體內的甲狀腺水平,且孕婦體內的PFOA含量與新生兒的出生體重呈負相關[17]。陳晨春[18]通過調查1 000多對廣西地區的孕產婦與新生兒發現,孕期全氟辛烷磺酸(PFOS)的暴露水平與胎兒宮內生長受限(intrauterine growth restriction, IUGR)呈正相關。除此之外,有關孕期PFASs暴露與新生兒神經行為發育影響的研究較少。

針對以上問題,本課題組建立了基于高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)檢測孕婦血清中7種(PFASs)的分析方法。該方法采用液液萃取作為樣品前處理方法,使用內標法定量。依托于已經建立的出生隊列,將該法應用于孕婦血清中PFASs的監測,追蹤并評估新生兒的神經行為發育,分析孕期PFASs暴露對新生兒神經發育的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Xevo TQ-S Micro高效液相色譜-質譜聯用儀(美國Waters公司); XH-B渦旋混勻器(江蘇康健醫療用品有限公司); KQ-500VDE數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); H2050R冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司); QYN100-1水浴氮吹儀(武漢泰仕德科技有限公司)。

超純水儀(美國Millipore公司);甲醇、甲酸(均為HPLC級,美國Thermo Fisher公司);甲基叔丁基醚(MTBE)、四丁基硫酸氫銨(TBAS)(均為HPLC級,美國Sigma-Aldrich公司);碳酸鈉(純度≥99.5%)、碳酸氫鈉(純度≥99.8%)和乙酸銨(純度≥99.0%)(國藥集團)。

7種PFASs標準品和3種同位素內標單標溶液均購于加拿大威靈頓實驗室。7種PFASs標準品:PFOA、PFOS、PFNA、全氟癸酸(PFDA)、全氟己烷磺酸(PFHxS)、全氟庚基磺酸(PFHpS)、全氟辛烷磺酰胺(PFOSA),溶劑均為甲醇,質量濃度均為5 μg/mL; 3種同位素內標單標溶液:13C4-PFOS、13C4-PFOA、13C4-PFHxS,溶劑均為甲醇,質量濃度均為2 μg/mL。其中,PFOSA、PFHxS以13C4-PFHxS為內標,PFHpS、PFOA以13C4-PFOA為內標,PFDA、PFOS和PFNA以13C4-PFOS為內標。

1.2 標準溶液的配制

混合標準工作溶液:分別吸取200 μL PFASs標準品(5 μg/mL)至同一5 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成質量濃度為200 ng/mL的混合儲備液,于4 ℃保存待用。用甲醇對混合儲備液進行逐級稀釋,配制成系列質量濃度(0.1、0.5、2、10、50、100、200 ng/mL)的混合標準工作溶液,并于4 ℃保存。

混合內標工作液:先分別吸取500 μL的3種同位素內標單標溶液至同一10 mL容量瓶中,用甲醇定容至10 mL,配制成質量濃度為100 ng/mL的內標儲備液;再用甲醇依次稀釋成質量濃度為1.0、10、50 ng/mL的混合內標工作液,并分裝為1 mL/支,于-20 ℃保存待用。

表1 7種PFASs及3種同位素內標的質譜參數

1.3 問卷調查及樣本采集

本課題基于湖北省鄂州市婦幼保健院建立的出生隊列展開研究,該隊列以2019年招募的孕婦作為研究對象;在孕婦首次產檢時,由護士對孕婦進行面對面問卷調查,以獲得孕產婦的社會人口學信息。收集孕婦在孕晚期時(28～36周)的血液樣本(10 mL),以4 000 r/min離心15 min,之后取出上層血清,置于-20 ℃冰箱中凍存,然后轉入-80 ℃冰箱中長期保存。樣本采集期間共收集456名孕婦孕晚期的血清樣本。隨訪期間,排除流產、引產、信息不完整及子代失訪者等情況,共有379名新生兒完成了新生兒神經行為評估。本研究已得到湖北中醫藥大學倫理委員會批準(No. 2021-IEC-015),招募志愿者均已簽署知情同意書。

1.4 樣品前處理

將采集的血清樣本從-80 ℃冰箱中取出,放置在4 ℃冰箱中過夜,充分解凍后再轉移至室溫。先將5 μL混合內標工作液加入至15 mL聚丙烯離心管中,然后再依次加入200 μL血清樣品、2 mL碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(pH 9.2)、1 mL TBAS,超聲處理20 min;之后向離心管中加入4 mL MTBE,置于渦旋混勻器上充分振蕩2 min,然后超聲20 min,以4 000 r/min離心15 min。用聚丙烯材質吸管將有機相上清液轉移至新的離心管中,向原離心管中再次加入4 mL MTBE,重復上述操作,合并兩次上清液,于50 ℃恒溫氮吹至干,再加入200 μL甲醇復溶,置于渦旋混勻器上充分振蕩2 min,以4 000 r/min離心15 min,最后將上清液轉移至進樣小瓶中直接用于上機檢測。

1.5 分析條件

色譜柱:Waters ACQUITY HPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動相:A相為甲醇,B相為2 mmol/L乙酸銨水溶液。梯度洗脫程序:0～5 min, 60%A; 5～10 min, 60%A～80%A; 10～12 min, 80%A～90%A; 12～15 min, 90%A; 15～20 min, 90%A～10%A。流速0.4 mL/min;進樣體積10 μL;柱溫40 ℃;樣品室溫度10 ℃。

離子源:電噴霧電離(ESI)源,負電離模式;掃描模式:多反應監測(MRM)模式;毛細管電壓:0.5 kV;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣溫度:550 ℃;脫溶劑氣流量:1 000 L/h;碰撞氣:氬氣。其他質譜參數見表1。

1.6 研究對象基本信息

納入此次研究的共有379對孕產婦及其子代新生兒,其中男性新生兒的比例(52.8%)和體重((3 423.4±452.8) g)均略高于女性新生兒(47.2%, (3 326.4±602.8) g)。孕婦的平均孕齡為27.3歲,孕產婦的居住地區以城區為主(77.5%),學歷大多為高中(37.2%)和大專(39.1%),家庭年收入以10萬～20萬居多(46.4%),且大多數孕婦為頭胎妊娠(67.5%),居住房屋建筑類型主要為鋼筋混凝土(61.0%),人均住房面積為10～20 m2(44.9%),相關信息見表2。

1.7 新生兒神經行為評價

依據北京協和醫院鮑秀蘭教授修訂的20項新生兒神經行為測定法(neonatal behavioral neurological assessment, NBNA)[19],于孕婦分娩第3天(即新生兒出生72 h內),由兒科醫師對新生兒的神經行為進行評估。NBNA的評估內容包括行為能力(6項)、被動肌張力(4項)、主動肌張力(4項)、原始反射(3項)和一般反應(3項),共20項指標,每項指標有3個評分水平(0、1、2分),NBNA滿分為40分,本實驗中共有379名新生兒完成了神經行為評價。

1.8 實驗室樣本質量控制

樣本由統一的調查員專職采集并登記,運輸過程中確保無污染。整理問卷及實驗室檢測數據,采用EpiData 3.1軟件建立數據庫,以平行雙盲的方式錄入數據,并對數據進行一致性檢驗和詳細的邏輯糾錯。實驗試劑均為HPLC級或MS級試劑;前處理過程中使用的滴管、離心管等均為一次性材料,以避免PFASs污染。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

按照1.5節分析條件,對待測物的母離子、子離子和碰撞能量等參數進行優化。先通過HPLC分離和一級質譜全掃描獲得每種待測物的保留時間和母離子,然后優化碰撞能量獲得子離子,最后采用MRM模式對待測物進行定性和定量分析。7種PFASs及3種同位素內標的總離子流色譜圖見圖1,相應的質譜參數見表1。

圖 1 7種PFASs及3種同位素內標的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of the seven PFASs and three isotope internal standards

2.2 方法學評價

2.2.1線性范圍、檢出限與定量限

配制質量濃度為0.1、0.5、2、10、50、100、200 ng/mL的系列混合標準工作溶液并進樣分析,以目標物與對應內標的定量離子峰面積之比為縱坐標(y)、目標物的質量濃度為橫坐標(x,ng/mL),繪制標準曲線。結果如表3所示,7種PFASs在0.1～200 ng/mL內線性關系良好,相關系數(r2)均≥0.993;以3倍信噪比計算方法的檢出限(LOD)、10倍信噪比計算定量限(LOQ), 7種PFASs的LOD為0.006～0.020 ng/mL, LOQ為0.020～0.066 ng/mL。

2.2.2回收率和精密度

在空白胎牛血清中分別添加低、中、高3個水平(1、10、50 ng/mL)的7種PFASs,進行加標回收試驗,每個加標水平進行6次平行試驗,并計算加標回收率和相對標準偏差(RSD)。如表4所示,7種PFASs在3個加標水平下的回收率分別為84.6%～116.8%、85.7%～112.5%和84.6%～107.8%,對應的RSD分別為5.8%～16.8%、3.8%～18.2%和6.7%～18.0%。實驗結果說明,該方法準確可靠,能夠用于實際樣品的檢測。

表3 7種PFASs的線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限和定量限

表4 7種PFASs在胎牛血清中的加標回收率和相對標準偏差(n=6)

2.3 與其他方法的比較

由于PFASs的種類較多,且血清基質較為復雜,一次檢測血清中多種PFASs的方法并不多見[20,21]。Shafique等[21]基于氣相色譜-串聯質譜(GC-MS/MS)建立了血清中多種PFASs的分析方法,但所得到的回收率波動較大。Mazzoni等[22]開發了一種基于在線凈化-液相色譜-串聯質譜同時測定血清中兩種全氟烷基磺酸鹽(PFOS、PFHxS)、3種全氟烷基羧酸鹽(PFOA、PFNA、PFDA)和一種全氟烷基磺酰胺(N-MeFOSA)的分析方法,6種目標物的回收率為84.0%～120.1%,LOD為0.16～0.34 ng/mL,但該方法在操作過程中需要兩根色譜柱,且在線處理步驟較為復雜,樣品用量大,因此推廣性有限(見表5)。本方法可檢測的PFASs種類多,準確度與精密度高,且試劑用量少,適用于人群中多種PFASs的快速分析測定。

表5 本方法與其他文獻方法的比較

2.4 孕婦血清中PFASs的暴露水平

456份孕婦血清樣本中,暴露水平最高的是PFOA,中位數水平為19.4 ng/mL,檢出率為100%;其次為PFOS,中位數水平為7.5 ng/mL,檢出率為100%; PFHpS的中位數水平為5.62 ng/mL,檢出率為98.5%; PFDA的中位數水平為2.01 ng/mL,檢出率為97.6%; PFNA的中位數水平為1.92 ng/mL,檢出率為100%; PFHxS的中位數水平為1.20 ng/mL,檢出率為100%; PFOSA的中位數水平為0.55 ng/mL,檢出率為97.4%。PFOA是血清中PFASs的最主要貢獻者,其暴露水平最高的原因可能是其半衰期較長且使用廣泛。研究發現,在食品包裝、服裝、家具、電器、炊具、化妝品等日常生活品中,PFOA的含量遠高于其他PFASs[24]。此外,動物實驗表明,血清中的白蛋白是PFASs的主要靶標,而PFOA與白蛋白的結合能力要強于其他PFASs,從而導致其在血清中的蓄積最高[25]。

2.5 新生兒神經行為評分

本研究中,379名新生兒的行為能力(滿分12分)、被動肌張力(滿分8分)、主動肌張力(滿分8分)、原始反射(滿分6分)、一般反應(滿分6分)及NBNA總分(滿分40分)分別為11.12±0.62、7.37±0.62、7.50±0.50、5.48±0.52、5.41±0.48和37.03±1.27分。如表6所示,性別分層分析結果顯示,女性新生兒的行為能力(P=0.013)、主動肌張力(P=0.009)和原始反射(P=0.026)均高于男性新生兒。

表6 新生兒神經行為測定結果(n=379)

2.6 孕期PFASs暴露對新生兒各功能區得分的影響

由于血清中PFASs的水平呈偏態分布,在隨后的分析中將PFASs的水平值作對數轉換,使其呈正態分布,再采用線性回歸分析方法來探究孕期PFASs暴露與新生兒神經行為間的關系。

在對總人群的各個混雜因素進行調整后發現,孕期母體體內的PFOS每增加一個自然對數(ln)水平,新生兒的主動肌張力及一般反應分別降低0.36分(95%置信區間(CI): -0.64～-0.08,P=0.036)和0.34分(95% CI: -0.61～-0.07,P=0.040);孕期母體體內的PFNA每增加一個ln水平,新生兒的被動肌張力和NBNA總分分別降低0.38分(95%CI: -0.74～-0.01,P=0.042)和0.37分(95% CI: -0.68～-0.06,P=0.042); PFDA每增加一個ln水平,新生兒的行為能力降低0.28分(95% CI: -0.54～-0.01,P=0.044);而PFHxS每增加一個ln水平,新生兒的NBNA總分上升0.27分(95% CI: 0.05～0.48,P=0.038),詳細結果如圖2所示。美國[26]和日本[27]的兩項研究使用貝利嬰幼兒發展量表第3版(BSID-Ⅲ)來評估新生兒的神經行為發育,結果顯示,孕婦產前暴露PFOS和PFNA與新生兒的認知行為下降和語言功能評分降低有關;雖然這兩項研究與本次研究所使用的評分方法不一致,但均能說明孕期PFASs暴露對兒童神經行為發育有負面影響。

2.7 孕期PFASs暴露對新生兒神經行為影響的性別差異

經性別分層后,孕期PFASs暴露對新生兒神經行為的影響如表7所示。在對各項混雜因素進行調整后,PFOS每增加一個ln水平,男性新生兒的主動肌張力及一般反應分別降低0.54分(95% CI: -0.73～-0.35)和0.50分(95% CI: -0.88～-0.13); PFNA每增加一個ln水平,男性新生兒的被動肌張力和NBNA總分分別降低0.67分(95% CI: -1.20～-0.14)和0.45分(95% CI: -0.91～-0.01); PFDA每增加一個ln水平,男性新生兒的行為能力降低0.44分(95% CI: -0.71～-0.17);而PFHxS每增加一個ln水平,男性新生兒的NBNA總分上升0.41分(95% CI: 0.02～0.80);同時,該性別分層研究未觀察到PFASs與原始反射之間的統計關聯。

在對各項混雜因素進行調整后,孕期母體PFASs暴露對女性新生兒神經行為的影響較小。如表7所示,僅觀察到PFOA與一般反應之間呈負相關關系(回歸系數(regression coefficient,β)=-0.27; 95% CI: -0.51～-0.02),而PFDA與行為能力之間呈正相關關系(β=0.46; 95% CI: 0.40～0.52)。這一結果與丹麥的一項出生隊列研究類似,即PFASs對男性新生兒身長、體重、認知發育等方面的影響大于女性新生兒[28]。原因可能是孕期PFASs暴露會干擾母體甲狀腺相關激素(如促甲狀腺激素、游離三碘甲狀腺原氨酸)的合成及轉運,甲狀腺相關激素的分泌又會影響兒童的神經行為發育;而由于性別差異,不同性別新生兒對甲狀腺激素的敏感度不同,導致PFASs對神經行為的影響存在性別差異[29]。

圖 2 孕期PFASs暴露對新生兒各功能區得分的影響Fig. 2 Effects of PFASs exposure during pregnancy on the scores of newborn functional areas * Significant difference (P<0.05). All models were adjusted for maternal age, pre-pregnancy BMI, living zone, mother’s schooling time, annual household income, parity, residential building type and average living space.

表7 孕期PFASs暴露對不同性別新生兒神經行為的影響

3 結論

本研究建立了測定孕婦血清中7種PFASs的高效液相色譜-串聯質譜法,該方法檢出限低,回收率及精密度良好,且樣品用量少。將該方法應用于已建立的出生隊列,結果顯示,孕婦血清中PFOA的暴露水平最高;同時,我們隨訪并測定了子代新生兒的神經行為評分,結果證實,孕期PFOS、PFNA和PFDA的暴露與新生兒NBNA的評分呈負相關。對子代新生兒進行性別分層分析后發現,孕期PFASs暴露對男性新生兒的神經行為影響更為明顯。由于本研究只采集了孕婦孕晚期的血清樣本,未能探索孕早期及孕中期PFASs暴露對新生兒神經發育的影響,無法確定孕婦暴露PFASs的敏感窗口期。今后可通過動物模擬實驗,探究PFASs神經發育毒性的敏感窗口期及其致病機制。