青少年體內35種抗生素和4種β-受體激動劑的測定及暴露現狀分析

胡小鍵, 李振環, 謝琳娜, 付 慧, 朱 英

(中國疾病預防控制中心環境與人群健康重點實驗室, 中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所, 北京 100021)

抗生素是一類具有抑菌和殺菌活性的化合物,其被廣泛應用于臨床治療、畜牧養殖和農業生產等領域,并發揮了重要作用[1,2]。我國作為抗生素生產和消費的第一大國,2020年抗生素產量高達22.3萬噸[3]。β-受體激動劑能夠與腎上腺素β受體結合,從而激活受體產生腎上腺素樣作用,可用于治療哮喘或慢性阻塞性肺疾病。β-受體激動劑還因具有促生長作用,曾廣泛應用于增加畜牧養殖過程中的牲畜重量、提高飼料轉化率和增加瘦肉率等。隨著抗生素和β-受體激動劑用量的不斷增多,其在不同環境介質及食品中的檢出率也不斷增高[4-10],這給生態環境和人體健康均帶來了較大的風險[11]?？股睾挺?受體激動劑會通過環境暴露和食物鏈進入人體,進而造成一系列人體健康危害。此外,抗生素會導致抗性基因和耐藥性等問題的產生,其危害影響更加深遠[12]。β-受體激動劑在人體內蓄積到一定量時,會導致人體發生肌肉震顫、頭暈、心跳加快等癥狀?？股馗鶕猛痉诸?可分為人用抗生素(human antibiotics, HAs)、獸用抗生素(veterinary antibiotics, VAs)、優先作為人用抗生素(antibiotics preferred as HA, PHAs)和優先作為獸用抗生素(antibiotics preferred as VA, PVAs)。我國正在逐漸收緊VAs的限量標準及種類,并明確禁止在動物飼料和飲用水中使用β-受體激動劑。青少年階段是人體生長發育的關鍵時期,長期受到低劑量抗生素和β-受體激動劑暴露會對青少年的健康產生不良影響。目前我國關于青少年體內抗生素水平的研究較少,本研究主要針對山東省某地區青少年體內的35種抗生素和4種β-受體激動劑進行測定,旨在了解該地區青少年體內抗生素和β-受體激動劑的暴露特征,為科學管理抗生素和β-受體激動劑的使用、降低人群健康風險等方面提供重要依據。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

超高效液相色譜(I Class,美國Waters公司)-串聯質譜儀(QTRAP 6500,美國AB SCIEX公司); BY-400C型96孔離心機(北京白洋醫療器械有限公司); LW20型振蕩水浴鍋(北京萊伯泰科儀器股份有限公司); PL2002型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司); VORTEX-6型渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司); IQ7005型純水機(美國Millipore公司); EVOLUTE?EXPRESS ABN 96孔固相萃取板、ExtraheraTMHV-5000大容量自動化樣品制備工作站、TurboVap?96 Dual全自動氮吹濃縮儀(瑞典Biotage公司)。

甲醇和乙腈(質譜級,德國Merck公司);甲酸、乙酸和乙酸銨(質譜級,美國Thermo Fisher公司);β-葡萄糖醛酸酶(葡萄糖醛酸酶活力≥85 000 units/mL,含芳基硫酸酯酶活力≤7 500 units/mL,美國Sigma公司); 35種抗生素、4種β-受體激動劑的標準品及同位素內標(純度均>95%)購于天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 研究對象

選擇山東省某中學的442名青少年為研究對象,年齡分布為11～15歲;所有研究對象均為該地區的常住居民,由本人及其監護人簽署知情同意書,并配合完成生物樣本的采集及相應的調查。根據美國疾病預防控制中心(USCDC)標準[13],本研究按照身體質量指數(BMI)百分位數將青少年體重劃分成4個等級,分別為體重過輕(BMI<5%)、正常體重(5%≤BMI<85%)、超重(85%≤BMI<95%)和肥胖(≥95%)。本研究已取得中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所倫理審查委員會的許可(編號201813),且每位研究對象的個人信息均得到保密。青少年調查對象的人口學特征見表1。

表1 青少年調查對象的人口學特征

1.3 尿樣采集

采用醫用尿杯對研究對象的即時尿進行收集,之后在現場分裝成5 mL/管,并置于凍存管中,于4 ℃冰箱暫存,待樣品全部采集完成后統一低溫轉運至-80 ℃冰箱保存。同時在現場用純水模擬尿樣采集過程,設置現場空白。

1.4 尿樣檢測

1.4.1尿肌酐檢測

參考《尿中肌酐分光光度測定方法》(WS/T 97-1996)[14],利用分光光度法對尿肌酐的含量進行測定。

1.4.2抗生素和β-受體激動劑檢測

采用同位素稀釋-高通量全自動固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)對尿液中的抗生素和β-受體激動劑進行同時測定。首先在1 mL尿液樣本中加入10 μL內標(0.4 ng/μL)、200 μL乙酸銨緩沖液(1 mol/L, pH 5)和20 μLβ-葡萄糖醛酸酶,經37 ℃水浴水解12 h后,采用96孔固相萃取板對其進行前處理,獲得樣本提取液;利用氮吹儀將提取液濃縮至0.2 mL,并采用UPLC-MS/MS進行測定。具體溶液配制方法、樣品前處理方法和儀器分析條件參考《基于高通量全自動固相萃取的超高效液相色譜-串聯質譜法測定人尿中16種抗生素和4種β-受體激動劑》[15];其中,39種目標物及同位素內標的質譜參數見表2,流動相的梯度洗脫程序見表3?；前芳讎f唑、甲氧芐啶、磺胺林、磺胺氯吡嗪分別以其對應的13C同位素為內標,克拉霉素以其13C和D代同位素為內標,土霉素以四環素-D6為內標,貝西沙星、甲?；h丙沙星、8-氟代加替沙星、去甲基氧氟沙星以氧氟沙星-D3為內標,磺胺對甲氧嘧啶以磺胺甲嘧啶-D4為內標,4-(間甲苯氨基)吡啶-3-磺胺以磺胺甲噁唑-13C6為內標,頭孢克洛和氨芐西林以頭孢噻呋-D3為內標;其余25種目標物均以其對應的D代同位素為內標。

表2 39種目標物及同位素內標的質譜參數

表3 梯度洗脫程序

1.5 數據分析

將研究對象按性別、年齡和體重等級分組,計算目標物的檢出率。采用皮爾森卡方檢驗對目標物檢出率與性別、年齡和體重等級間的相關性進行分析。在調整了混雜因素后,采用Logistic回歸模型來評估目標物檢出率與不同組別間的相關性,并計算比值比(OR)。所有統計分析均使用統計軟件包R(version 4.0.5),概率值(p)<0.050定義為具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 方法學驗證

采用1.4.2節方法對35種抗生素和4種β-受體激動劑的檢測進行方法學驗證。以目標物與內標的質量濃度比為橫坐標(x)、峰面積之比為縱坐標(y),繪制標準曲線。結果表明,39種目標物在0.02～10 ng/mL范圍內線性關系良好,且相關系數均>0.997。向空白尿樣中加入低濃度(10倍信噪比所對應的濃度)標準品,配制成7個平行的加標樣品,采用上述分析方法進行測定。以3倍標準偏差所對應的質量濃度為方法檢出限(MDL)、10倍標準偏差所對應的質量濃度為方法定量限(MQL)。39種目標物的MDL和MQL分別為0.01～0.18 ng/mL和0.02～0.60 ng/mL。在實際尿液樣品中分別添加低(0.5 ng/mL)、中(2 ng/mL)、高(5 ng/mL)3個水平的39種目標物,并對加標回收率和日內、日間精密度進行考察。結果表明,39種目標物在3個加標水平下的回收率分別為83.2%～120.8%、86.2%～119.6%和86.9%～117.8%,日內精密度和日間精密度分別為2.0%～7.9%(n=6)和2.5%～8.9%(n=6)。以上實驗結果表明,本文所建立的方法能夠滿足青少年尿液中35種抗生素和4種β-受體激動劑的檢測要求。

2.2 青少年體內抗生素和β-受體激動劑的檢出率

尿液檢測結果以采用尿肌酐校正后的含量(ng/g)來表示,結果如表4所示。442名青少年中有397名青少年的體內至少檢出一種抗生素或β-受體激動劑;39種目標物中共有29種目標物被檢出,檢出率為0.2%～59.0%。四環素類、大環內酯類、磺胺類、喹諾酮類抗生素的檢出率均大于10%,檢出率分別為81.9%、42.3%、21.0%、15.8%;四環素類抗生素中檢出率最高的是強力霉素(59.0%),其次是土霉素(56.1%)和四環素(32.8%);大環內酯類抗生素中檢出率最高的是阿奇霉素(34.6%);磺胺類抗生素中檢出率最高的是甲氧芐啶(12.2%);喹諾酮類抗生素檢出率最高的是氧氟沙星(10.0%),其他抗生素的檢出率均小于10.0%。替米考星、培氟沙星、洛美沙星、8-氟代加替沙星、磺胺甲嘧啶、磺胺林、頭孢噻呋和喹烯酮共8種抗生素在所有樣品中均未檢出。在7類抗生素中,四環素類抗生素的檢出率和檢出含量最高,表明四環素類抗生素是青少年體內的首要抗生素種類。Lyu等[16]發現,四環素類和喹諾酮類抗生素是我國于土壤中發現的主要抗生素,磺胺類、大環內酯類、四環素類和喹諾酮類抗生素是我國于地表水中發現的主要抗生素。結合本研究中青少年尿樣的檢測結果可以說明,四環素類、大環內酯類、磺胺類和喹諾酮類抗生素廣泛存在于環境中,并且會通過某些途徑進入人體。

β-受體激動劑在青少年尿液中的檢出率較低,總體檢出率為2.7%。442名青少年中僅有5人檢出特布他林(1.1%)、7人檢出克倫特羅(1.6%);沙丁胺醇和萊克多巴胺在所有研究對象中均未檢出。一份關于我國β-受體激動劑使用情況的調查研究發現,盡管克倫特羅和萊克多巴胺已被禁止使用,但二者仍在城市污水中被檢出,表明我國仍存在此類藥物的使用現象[17]。結合本研究結果發現,β-受體激動劑能通過各種途徑進入人體。

對39種目標物進行混合暴露分析可以發現,同時暴露于兩種或兩種以上目標物的調查對象占總人數的55.6%;其中四環素類和大環內酯類抗生素復合暴露的檢出率最高(36.9%)。在同種類抗生素中,強力霉素和土霉素復合暴露的檢出率最高(36.4%);在不同種類抗生素中,阿奇霉素和強力霉素復合暴露的檢出率最高(19.2%)。

表4 研究對象中35種抗生素和4種β-受體激動劑的檢出率和檢出含量

表4 (續)

2.3 性別、年齡、BMI與抗生素暴露的關系

將研究對象按性別、年齡和BMI等級分組,并進行統計分析,不同組別中各類目標物的檢出率如圖1所示。按性別分組,男性青少年中39種目標物的總體檢出率為92.4%,女性青少年的總體檢出率為87.4%;其中,男性青少年體內大環內酯類和四環素類抗生素的檢出率均高于女性;由皮爾森卡方檢驗結果可知,四環素類抗生素的檢出率在男女性別間存在顯著差異(p=0.004)。Ben等[11]發現食物中的抗生素是我國人群體內抗生素暴露的主要來源。有研究[18]表明,男性青少年對食物的攝入量一般高于女性,由此推測,食品暴露可能是導致不同性別青少年體內抗生素檢出率不同的原因之一。將研究對象按年齡分成4組(11、12、13、14～15歲),采用皮爾森卡方檢驗進行統計分析。結果發現,僅有大環內酯類抗生素的檢出率在不同年齡分組間存在統計學意義(p=0.010)。將研究對象按肥胖程度分成4組(體重過輕、正常體重、超重和肥胖),并采用皮爾森卡方檢驗進行統計分析。結果發現,大環內酯類抗生素的檢出率在不同肥胖等級分組間存在統計學意義(p=0.003);隨著肥胖程度的增加,大環內酯類抗生素的檢出率也逐漸增加。有研究[19]推測,長期、低劑量的抗生素暴露會對人體腸道微生物菌群造成破壞,使得新陳代謝活動低下、脂肪含量增加,從而導致肥胖。本研究也進一步表明,大環內酯類抗生素暴露可能是導致青少年肥胖的一個因素。

采用多因素Logistic回歸模型對影響大環內酯類和四環素類抗生素檢出率的因素進行分析,結果見表5。在調整了年齡和BMI因素后,四環素類抗生素與性別間的相關性依舊存在,在男性青少年中四環素類抗生素的檢出風險是女性的2.17倍;在調整了性別和BMI因素后,與11歲組別相比,其他年齡組中大環內酯類抗生素的檢出風險更高,其中12、13歲年齡組的檢出風險差異具有統計學意義(p=0.010和p=0.004);在調整了性別和年齡因素后,與正常體重組相比,大環內酯類抗生素在肥胖組中的檢出風險最高(OR=2.35,p=0.002),且隨體重等級的增加而增大。

圖 1 不同(a)性別、(b)年齡和(c)BMI等級分組中抗生素和β-受體激動劑的檢出率Fig. 1 Detection rates of antibiotics and β-receptor agonists in groups of different (a) genders, (b) ages, and (c) BMI grades* 0.010≤p<0.050; ** p<0.010.

2.4 暴露來源初步分析

人體內抗生素和β-受體激動劑的直接來源包括臨床用藥和自我用藥,而其間接來源途徑較為復雜,各種介質中的抗生素和β-受體激動劑都有可能通過飲食、飲水、呼吸和皮膚接觸等途徑進入人體。因此,人體內抗生素和β-受體激動劑的暴露來源解析難度較大。本研究根據抗生素和β-受體激動劑目前的主要用途來初步推斷其可能的暴露來源。

按抗生素用途分類,442名青少年中PVAs的檢出率最高(85.1%),其次依次為HAs(41.0%)、VAs(12.0%)和PHVs(7.2%)。PVAs如四環素類、磺胺類、喹諾酮類抗生素具有價格低廉和抗菌譜寬等特點,在畜牧養殖中能夠加速幼崽生長、縮短飼養周期、增加經濟效益。PVAs被廣泛應用于畜牧養殖,我國多地外環境或食物中也因此頻繁檢出此類物質,本研究中檢出率最高的強力霉素和土霉素是養殖場廣泛使用的四環素類抗生素。還有研究[20]發現,葉菜對土壤中的強力霉素具有吸附和富集作用。本研究發現,青少年體內強力霉素和土霉素的檢出率最高,但二者在體內的含量卻不高(75分位含量分別為0.1 ng/g和0.6 ng/g),由此推斷食物暴露可能是青少年體內強力霉素和土霉素的主要來源。阿奇霉素、克拉霉素和羅紅霉素僅用作HVs,因此在尿液中檢測到的此類抗生素可能主要來源于臨床使用或自我用藥;但在本研究中,阿奇霉素的檢出率高達34.6%,不排除存在阿奇霉素違法用于養殖的可能,已有研究[21,22]在雞肉和魚腸道內檢出阿奇霉素。

β-受體激動劑已被禁止用于動物飼養,并被列為安全監督和常規監測的目標物質[23]。青少年體內的β-受體激動劑主要來源于食物和環境暴露,本研究中β-受體激動劑的檢出率僅為2.7%,表明我國對β-受體激動劑的管控較好,青少年經食物和環境暴露β-受體激動劑的風險較小。

3 結論

本研究采用同位素稀釋-高通量全自動固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定了青少年體內35種抗生素和4種β-受體激動劑的暴露水平,并初步了解到,青少年普遍受到低濃度抗生素暴露的影響,且不同性別、年齡和BMI等級分組中青少年的暴露風險不同。優先獸用抗生素是青少年體內的主要抗生素種類,而β-受體激動劑對青少年的暴露風險較小。本研究也存在不足之處,實驗僅針對山東省某地區的青少年展開調查,無法代表全國青少年抗生素和β-受體激動劑的整體暴露水平,且本研究屬于橫斷面調查,不能反映抗生素和β-受體激動劑長期、低劑量暴露對人體健康的影響。