何氏育麟方治療卵巢儲備功能下降作用機制的網絡藥理學和分子對接研究

王如燁 章 勤 方曉紅

卵巢儲備功能下降（diminished ovarian reserve，DOR）是指卵巢中剩余卵母細胞數量減少、質量下降，生育能力下降、性激素缺乏等[1]，可進展為卵巢早衰，并出現一系列圍絕經期癥狀，對女性遠期心腦血管等健康造成威脅。目前對于DOR 的臨床治療主要運用激素替代治療、脫氫表雄酮、抗氧化劑補充等，但不能從根源上改善DOR 患者的卵巢功能，且有一定的副作用[2]。近年來，中醫藥在治療DOR 方面研究頗多。一項系統評價和薈萃分析發現，運用補腎調肝法治療DOR，可以有效改善患者生殖激素水平與竇卵泡數量[3]。何氏育麟方源于浙江省非物質文化遺產——浙江何氏婦科，全方由《濟陰綱目》蓯蓉菟絲丸化裁而成，包含菟絲子、覆盆子、枸杞子、當歸、川芎、熟地黃、巴戟天、肉蓯蓉、仙靈脾和蛇床子十味中藥。前期研究發現，何氏育麟方可改善DOR 患者月經周期與激素水平，改善卵巢功能，但其作用的具體機制鮮有深入研究[4-5]。因此，本研究利用網絡藥理學和分子對接的方法，對何氏育麟方治療DOR 的相關靶點、信號通路加以分析，以期從藥物-靶點-機制層面為治療DOR 提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 獲取何氏育麟方藥物相關靶點 通過中藥系統藥理學數據庫（TCM systems pharmacology，TCMSP），分別以菟絲子、枸杞子、當歸、川芎、熟地黃、巴戟天、肉蓯蓉、仙靈脾、蛇床子和覆盆子為檢索詞，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 為篩選條件，獲取以上各味中藥的活性成分和潛在作用靶點。

1.2 獲取DOR 疾病相關靶點 通過人類基因數據庫（Genecards）和人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM）獲取DOR 的潛在靶點，檢索詞為“ovarian reserve hypofunction”，同時限定搜索范圍為“Homo sapiens”，合并所有獲得的靶點，并去除重復靶點。

1.3 構建“藥物-化合物-靶點”網絡圖 將何氏育麟方中的有效成分和DOR 中的潛在靶點整理后輸入Cytoscape 3.9.0 軟件，構建可視化“藥物-化合物-靶點”網絡圖，通過軟件的分析模塊對網絡圖進行分析，以度值為篩選指標，篩選出網絡圖中的核心節點。其中度值的高低代表節點連線的多少，度值越高，其重要性越高。

1.4 構建蛋白互作網絡圖 利用疾病和藥物的共有靶點在String 數據庫中獲取蛋白互作連線網絡文件，導入Cytoscape 3.9.0 軟件，通過軟件的分析模塊對網絡圖進行分析。此外，使用CytoNCA 軟件通過接近中心度（closeness centrality，CC），介值中心度（betweenness centrality，BC） 和度值中心度（degree centrality，DC）篩選出關鍵靶點，BC、CC 和DC 應≥中位數。將這些靶點作為何氏育麟方治療DOR 的核心靶點，并構建蛋白互作網絡圖。

1.5 通路和功能富集分析 將1.4 中篩選出來的核心靶點輸入DAVID 數據庫進行基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書數據庫（Kyoto encyclopedia of genes genomes，KEGG）富集分析，物種選擇為“homo sapiens”。通過R 軟件中的“Pathview”包和KEGG 通路富集分析對靶點進行統計分析和可視化，結果以校正P＜0.05 作為篩選條件。篩選出何氏育麟方治療DOR 所涉及的主要生物學過程和有顯著性差異的信號通路。

1.6 分子對接 從PubChem 數據庫中確定化合物名稱、分子量和3D 結構，在RCS PDB 數據庫中下載活性成分所對應的3D 結構。然后利用AutoDock Vina 軟件，準備分子對接所需的配體和蛋白質，對目標蛋白晶體結構進行去除水分子、加氫、修飾氨基酸、優化能量和調整力場參數等預處理，將靶點結構與活性成分結構進行分子對接，利用AutoDock Vina軟件進行對接，最后取每個蛋白結合能最低的結果作圖，并使用Pymol 軟件對其進行可視化。

2 結 果

2.1 何氏育麟方的活性成分和潛在靶點 檢索各個數據庫，合并刪除重復成分，通過查閱文獻整理出何氏育麟方中各味中藥的重要活性成分共85 個，其中部分活性成分來源于多味中藥。隨后，從TCMSP 數據庫中檢索到何氏育麟方的1222 個潛在靶點，去除重復的靶點后，11 味中藥共獲得266 個潛在作用靶點。

2.2 何氏育麟方與DOR 的共有靶點 通過檢索GeneCards 和OMIM 數據庫，合并去除重復后共獲得1376 個疾病靶點。將266 個藥物靶點和1376 個疾病靶點輸入到venny 2.1.0，最終獲得136 個共有靶點。疾病和藥物共有靶點韋恩圖見圖1。

2.3 何氏育麟方改善卵巢功能“疾病-藥物-活性成分-靶點”網絡圖 我們利用Cytoscape 3.9.0 軟件構建了藥物-成分-靶點網絡，明確了活性成分、潛在靶點和DOR 之間的聯系（見圖2）。表1 列出何氏育麟方治療DOR 的十大關鍵活性成分。排名前5 的活性成 分 分 別 是 槲 皮 素（MOL000098）、 山 奈 酚（MOL000422）、β-谷甾醇（MOL000358）、豆甾醇（MOL000449）和木犀草素（MOL000006）。

圖1 何氏育麟方和卵巢儲備功能下降交叉靶點的韋恩圖

2.4 何氏育麟方改善卵巢功能核心靶點篩選 將疾病與藥物共有靶點導入STRING 數據庫，得到共有靶點蛋白之間相互作用的連線網絡文件，將網絡文件導入Cytoscape 軟件（Version3.9.0），得到一個包含88 個節點和716 條相互作用連線的網絡圖。之后使用CytoNCA 功能設置BC、CC 和DC＞2 倍中位數，以得到核心蛋白。第一步，DC≥13。第二步，BC、CC 和DC 分別≥40、0.428 和26（見圖3）。因此，鑒定出15個與DOR 密切相關的核心蛋白，排名前5 的分別為TP53、MAPK1、TNF、AKT1 和ESR1，見圖4。

2.5 GO 和KEGG 富集分析 基于何氏育麟方可能的靶點，運用GO 和KEGG 功能富集分析以探討何氏育麟方調節DOR 的潛在信號通路或生物過程。GO 富集分析主要包括三個方面，包括生物學過程（biological process，BP）、細胞學組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。GO富集分析中BP 主要出現在細胞增殖及調控、細胞遷移、細胞凋亡等方面。CC 主要富集在膜閥、囊泡腔、轉錄調節復合物等。MF 主要富集在細胞因子受體結合、DNA 結合轉錄因子結合、激酶結合和蛋白激酶活性等。選取BP、CC 和MF 的前10 條目進行可視化。見圖5A。

KEGG 富集分析發現了與關鍵靶點相連的代表性通路，包括癌癥通路、PI3K/AKT、AGE-RAGE、HIF-1、NF-κB 和IL-17 信號通路等見圖5B。

表1 何氏育麟方治療卵巢儲備功能下降的十大關鍵活性成分

圖2 藥物-化合物-靶點網絡

圖3 蛋白互作網絡與疾病靶點的聚類分析流程圖

圖4 核心靶點網絡圖

2.6 分子對接結果 分別選取排名前5 的核心化合物和關鍵靶點（TP53、MAPK1、TNF、AKT1 和ESR1）進行分子對接。共進行受體與配體對接25 次，其中20 組結合能≤-3 kcal/mol，約占80%；11 組結合能≤-4.5 kcal/mol，約占44%。對接結果表明，選取活性成分與靶點結合活性良好?；钚猿煞峙c靶點的結合熱能見表2。每個蛋白和活性成分結合能最低的分子對接模式圖見圖6A～E。

3 討 論

中醫學中并無“卵巢儲備功能下降”一詞，但結合其臨床表現，可歸屬于中醫“月經過少”“月經先期”“月經后期”“閉經”“不孕”等范疇。其中《傅青主女科》中所提及的“年未老而經水斷”的表現與本病最為相似?？v觀古今，許多醫家論及此病，其病因病機多由稟賦不足、后天失養、久病勞損、情志失調等導致腎精不足、天癸不生、沖任失調所致，并伴有肝郁、脾虛、血瘀等證[6]。病位在于胞宮沖任，兼顧肝脾腎三臟，病性以虛為主，兼見虛實夾雜，而虛多實少為常。治法總以補腎益氣、充養天癸為大法，并隨證而治，兼顧健脾益氣、疏肝理氣、活血化瘀等。何氏育麟方為浙江何氏婦科歷經五代傳承結晶，多用于腎虛型不孕癥等疾病中，方中菟絲子味辛而甘，善補腎精，溫而不燥；覆盆子酸溫入腎，收攝耗散之陰氣而蓄養陰精，二者相配，寓陽中求陰，陽中求陰，以子補子之意，共為君藥；巴戟天、肉蓯蓉、仙靈脾為臣，補肝腎益精血；當歸、川芎、熟地黃、枸杞子養血調血，動靜結合，補而不滯；蛇床子益腎壯陽。諸藥相伍，以滋補腎精為核心，陰陽同補，佐以養精血，血充精足，則胞宮得以溫養，臨床上?？色@不俗療效。為促進中藥復方作用機制的可視化、證據化的研究與發展，本研究采用網絡藥理學方法和分子對接技術，系統分析了何氏育麟方治療DOR 的潛在機制。

圖5 使用GO 和KEGG 數據庫進行功能研究

表2 活性成分與靶點的結合熱能（kcal/mol）

通過網絡藥理學分析，最終得到何氏育麟方活性成分主要有槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇和木犀草素等，來源于何氏育麟方中的十味中藥，其中有的活性成分來源于多味中藥，可見中藥具有多成分、多靶點及其相互配伍、共同發揮作用的特點。槲皮素、山奈酚和木犀草素均屬于類黃酮化合物，類黃酮被認為具有抗炎、抗氧化和抗誘變作用[7]。多項研究證實，槲皮素可通過增加卵巢顆粒細胞線粒體活性，降低細胞凋亡率、抑制氧化應激與炎癥反應、從而改善卵巢功能[8-9]。山奈酚可以通過PI3K/AKT 信號通路促進原始卵泡活化，并減少體外培養的綿羊前竇卵泡DNA 碎片化[10]。卵巢顆粒細胞的增殖和凋亡在促進卵泡發育功能、卵母細胞的成熟以及合成和分泌相關生殖激素等方面具有重要作用。木犀草素可以通過影響cAMP 信號通路及影響細胞中與雌二醇合成有關的芳香酶來促進卵巢顆粒細胞對雌二醇的合成及分泌[11]。β-谷甾醇可通過PI3K/AKT 信號通路促進卵巢顆粒細胞增殖，抑制細胞凋亡[12]。蛋白互作結果顯示，TP53、MAPK1、TNF、AKT1 和ESR1 是該網絡的核心靶點，通過對核心靶點進行GO 富集分析，結果表明這些核心靶點主要參與細胞增殖與調控、細胞凋亡、細胞遷移、DNA 復制、蛋白激酶調節等過程。TP53 基因家族被認為是人類生殖相關關鍵過程的調節者，其在維持卵泡池的大小等方面起著至關重要的作用，影響卵母細胞質量[13]。MAPK1 作用于卵巢顆粒細胞，在卵母細胞成熟中起關鍵作用[14]。TNF 作為一類細胞因子，其中TNF-α 的作用受到廣泛關注。有研究發現，TNF-α 參與卵泡發育、甾體生成、排卵和黃體功能等生理過程的調節，同時可以調節顆粒細胞的分化[15]。AKT1 被證實參與了卵巢細胞內代謝、凋亡、細胞周期或細胞骨架動力學的調節[16]，AKT1 的缺乏可以表現出生育能力降低和動情周期異常，卵巢中原始卵泡減少[17]。ESR1被認為是治療卵巢功能下降的候選基因，因雌激素調節了由ESR1編碼的雌激素受體-α（ER-α）在下丘腦-垂體-卵巢軸處的循環促性腺激素的釋放，與卵泡生成的調控關系密切[18]。由此可見，何氏育麟方的主要活性成分不僅參與了細胞氧化應激、細胞凋亡、細胞增殖等生物學過程，同時參與了患者生殖激素、卵巢生理過程的調控，以此發揮改善卵巢功能的作用。

圖6 何氏育麟方改善卵巢功能核心成分與關鍵靶點分子對接圖

進一步對核心靶點進行KEGG 富集分析，主要富集在癌癥信號通路、PI3K/AKT 信號通路、AGE/RAGE 信號通路。雖然關鍵基因多富集于癌癥信號通路中，但它是一個復雜的信號通路，包含PI3K 信號通路、ERK 信號通路等。而PI3K/AKT 信號通路作為富集度第二的通路，參與了多種生物學過程，是經典的線粒體凋亡途徑，也是調節細胞的增殖、生長和凋亡重要的信號通路[19]。其中何氏育麟方中如山奈酚、β-谷甾醇等活性成分皆被發現通過該通路抑制顆粒細胞凋亡，從而改善卵巢功能，可猜想PI3K/AKT 信號通路在何氏育麟方改善DOR 中起到了關鍵作用[10，12]。IL-17 信號通路在炎癥反應中具有關鍵作用[20]。而炎癥反應影響排卵前卵泡中的類固醇產生細胞，特別是內部和外部膜層、黃體和顆粒細胞[21]，從而對卵巢功能產生影響。最后，我們使用分子對接技術將何氏育麟方的前5 位活性成分和前5 個關鍵蛋白進行分子對接，共進行受體與配體對接25 次，其中20 組結合能≤-3 kcal/mol，約占80%；11 組結合能≤-4.5 kcal/mol，約占44%。對接結果表明，選取活性成分與靶點結合活性良好，驗證了本研究結果的準確性。

4 結 論

本研究通過網絡藥理學和分子對接技術，從多個方面對何氏育麟方治療DOR 的作用機制進行了分析，揭示了何氏育麟方改善卵巢功能可能的信號通路和潛在的作用靶點，為臨床治療DOR 用藥提供了一定的參考，也為進一步深入研究提供了理論依據，但鑒于研究方法的局限性，在后續需要一定的驗證。