胡柚皮黃酮對棕櫚酸誘導的脂肪變性肝細胞中線粒體膜電位以及自噬相關蛋白表達的影響

王 瀟 何蓓暉 姚侃男 陳芝蕓

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是全球最受關注的公共健康問題之一，近年來在我國發病率逐年上升，且有年輕化趨勢[1-2]。有部分患者會逐漸進展至肝硬化和肝癌，嚴重影響人類的健康水平和生活質量，并帶來沉重的經濟負擔[3-4]。目前除了飲食調節、運動鍛煉和對癥治療外，尚未發現有效的治療方法。胡柚皮黃酮（pure total flavonoids from citrus，PTFC）是我們從常山胡柚皮中分離純化的黃酮類化合物，由柚皮苷、新橙皮苷和柚皮蕓香苷等3 種黃酮類化合物為主要成分。前期實驗在NASH 動物模型中發現，PTFC能抑制氧化應激和脂質過氧化反應，減輕肝臟中炎癥反應，具有保護肝細胞的作用[5-6]。有研究發現，細胞中沉默信息調節因子1（SIRT1）水平影響細胞自噬活性[7]。進一步研究表明，SIRT1 可通過去乙?；瘜ψ允上嚓P蛋白功能發揮調控作用，促進線粒體自噬形成，在自噬的調節中起著關鍵性作用[8-9]。前期研究發現，PTFC 通過調控SIRT1 改善NASH 小鼠[6]。因此，本研究采用棕櫚酸（PA）誘導肝細胞建立細胞脂肪變性模型，從線粒體自噬途徑探討PTFC 抗肝細胞損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人肝癌細胞株HepG2 細胞購自上海生命科學院細胞庫；PTFC 由本單位中藥制劑室分離純化；胎牛血清、高糖DMEM 培養基購自Gibco公司（批號211100703、8121080）；0.25%胰酶購自Gibco 公司（批號2120734）；PA 購自GLPBIO 公司（批號07512）；油紅O 染料購自Sigma 公司（批號07512）；BCA 蛋白質定量試劑盒購自biosharp 公司（批號00755S）、線粒體膜電位檢測試劑盒北京索萊寶科技公司（批號M8650）、活性氧檢測試劑盒購自碧云天公司（批號S0033S）、總蛋白提取試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司（批號P1250）；P62、自噬效應蛋白（Beclin-1）抗體購自Immunoway 公司（批號00101435、00096519）；微管相關蛋白質1 輕鏈3（LC3）抗體購自proteintech 公司（批號00076446）；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus 公司）；CO2培養箱（Thermo 公司）；酶標儀（美國BioTek 公司）；凝膠成像儀（Bio-Rad 公司）。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養 細胞培養于含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養基中，在37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，當細胞80%～90%融合時，0.25%胰酶消化細胞，1∶3 傳代，進行相關實驗。

1.2.2 MTT 法檢測細胞增殖 將對數生長期的HepG2 細胞以1×105/mL 的密度，100 μL/孔接種于96 孔細胞培養板，培養24 h。去上清，加入含不同濃度（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol/L）PA 的培養液200 μL，空白對照組只加200 μL 培養液，培養24 h、48 h，培養結束前4 h 加入20 μL/孔5 mg/mL 的MTT溶液，繼續培養4 h，去上清液，加入200 μL/孔DMSO，震蕩10 min，選擇490 nm 波長，酶標儀檢測吸光值（OD），每組做6 個復孔，實驗重復3 次。

1.2.3 油紅O 染色檢測細胞脂質沉積 將對數生長期的HepG2 細胞接種于6 孔細胞培養板，37℃、5%CO2培養24 h。去上清，加入含不同濃度（0、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L）PA 的培養基，空白對照組只加培養基，繼續培養24 h。油紅O 染色，顯微鏡下觀察細胞內脂滴形成情況。根據細胞增殖實驗和油紅O 染色結果，確定PA 誘導HepG2 細胞脂肪變性的濃度。采用該濃度處理細胞，同時加入不同濃度的PTFC（0、20、40、80、160 mg/L）處理24 h，油紅O 染色，檢測細胞脂質沉積變化。

1.2.4 熒光探針檢測細胞內活性氧含量 將對數生長期的HepG2 細胞接種于6 孔培養板，37 ℃、5%CO2培養24 h。0.3 mmol/L 的PA 誘導HepG2 細胞，同時加入不同濃度的PTFC（0、40、80、160 mg/L）培養24 h。棄上清，加入1 mL PBS，搖床5 min，洗2 次。加入1 mL的DCFH-DA（10 μmol/L），37 ℃孵育30 min。棄上清，1 mL PBS 洗1 次。熒光顯微鏡下采集圖像。

1.2.5 熒光探針檢測線粒體膜電位 取對數生長期的HepG2 細胞接種于6 孔培養板，37 ℃、5%CO2培養24 h。0.3 mmol/L 的PA 誘導HepG2 細胞，同時加入不同濃度的PTFC（0、40、80、160 mg/L）培養24 h。棄上清，加入1 mL 現配的10 μg/mL 的JC-1 工作液，37 ℃孵育30 min。棄上清，培養液洗滌2 次。熒光顯微鏡采集圖像。

1.2.6 免疫印跡法檢測PTFC 對HepG2 細胞自噬相關蛋白表達的影響 取對數生長期的HepG2 細胞接種于細胞培養瓶，37 ℃、5%CO2培養24 h。0.3 mmol/L的PA 誘導HepG2 細胞，同時加入不同濃度的PTFC（0、20、40、80、160 mg/L）處理24 h。PBS 洗滌細胞，RIPA 液裂解提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳，LC3 和Beclin-1、p62 分別采用15%和10%的SDS-PAGE 膠，制備轉膜后，1%BSA封閉。一抗1∶1000 稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3次，HRP 標記的二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，ECL 顯影。凝膠成像系統采集圖片并分析。

1.2.7 統計學方法 應用SPSS 22.0 軟件進行統計分析。符合正態分布計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組資料之間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PA 對HepG2 細胞增殖的影響 不同濃度PA分別處理HepG2 細胞24、48 h 后，MTT 法檢測細胞增殖情況，結果顯示，低濃度PA 對細胞增殖無明顯影響，而當PA 濃度高于0.3 mmol/L 后對細胞增殖的抑制作用逐漸增強，見圖1。

圖1 不同濃度PA 對HepG2 細胞增殖的作用

2.2 PA 誘導HepG2 細胞脂肪變性 油紅O 染色結果顯示，正常對照組細胞內少量紅染，PA 處理組均可觀察到紅染，且PA 濃度越高紅染明顯增多，表明細胞內脂滴增多。結合MTT 結果，發現在PA 濃度為0.3 mmol/L 時，細胞增殖不會受到明顯抑制，同時細胞出現明顯的脂質沉積，故實驗選定該濃度作為誘導細胞脂肪變性劑量，見圖2。

2.3 PTFC 對肝細胞脂肪變性的影響 用不同濃度PTFC 分別作用于經0.3 mmol/L 誘導的HepG2 細胞24 h 后，油紅O 染色發現細胞內脂質含量減少，且呈劑量依賴性（P＜0.01），見圖3 和表1。

2.4 PTFC 對HepG2 細胞內活性含量的影響 實驗顯示，經PA 處理后，細胞中綠色熒光顯著增強（P＜0.01）；而用不同濃度PTFC 干預后綠色熒光強度降低，且隨PTFC 濃度增高熒光強度降低越明顯（P＜0.01），見圖4 和表2。

2.5 PTFC 對HepG2 細胞線粒體膜電位的影響 實驗顯示，經PA 處理后，細胞中紅色熒光強度減弱，綠色熒光顯著增強，導致線粒體膜電位下降。而不同濃度PTFC 干預后綠色熒光強度降低，而紅色熒光強度逐漸增強，表明PTFC 會使細胞線粒體膜電位恢復。見圖5。

2.6 PTFC 對HepG2 細胞自噬的影響 Western blot 結果顯示，經PA 處理后，Beclin-1 和LC3 蛋白表達明顯下調，P62 蛋白表達上調；而PTFC 干預后，Beclin-1 和LC3 蛋白表達明顯上調，而P62 蛋白表達下調，且隨PTFC 濃度增加作用相應增強。見圖6。

3 討 論

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是脂質代謝紊亂性疾病在肝臟中的一種臨床表現，其主要病理特征為肝細胞脂肪變性和氧化應激損傷后所致的炎癥反應，而NASH 是肝組織從單純性脂肪變性發展至肝硬化，甚至肝細胞癌的中間限速階段[1]。目前，針對NASH 尚無明確有效的治療方法。

近年來許多研究發現，線粒體功能紊亂在NASH的發生發展過程中有著重要的作用[10]。在肝臟中，線粒體不但參與脂質代謝，也是氧化應激發生的主要場所。線粒體功能障礙會引起肝細胞脂肪氧化代謝出現異常，導致細胞中活性氧簇產生增多，從而使肝臟脂肪變性和炎癥反應，造成肝細胞功能損傷和病理改變。

圖2 油紅O 染色檢測HepG2 細胞中脂質沉積（×200）

圖3 HepG2 細胞脂肪變性情況（×200）

表1 HepG2 細胞脂肪變性檢測（±s）

表1 HepG2 細胞脂肪變性檢測（±s）

注：PA 為棕櫚酸；PTFC 為胡柚皮黃酮；與對照組比較，aP＜0.01；與PA組比較，bP＜0.01

組別對照組PA（0.3 mmol/L）組PA+PTFC（20 mg/L）組PA+PTFC（40 mg/L）組PA+PTFC（80 mg/L）組PA+PTFC（160 mg/L）組孔數333333脂滴相對含量1.00±0.13 39.13±3.15a 30.17±4.41b 16.35±4.00b 6.26±1.69b 2.76±2.05b

表2 HepG2 細胞內活性氧含量檢測（±s）

表2 HepG2 細胞內活性氧含量檢測（±s）

注：PA 為棕櫚酸；PTFC 為胡柚皮黃酮；ROS 為活性氧；與對照組比較，aP＜0.01；與PA 組比較，bP＜0.01

組別對照組PA（0.3 mmol/L）組PA+PTFC（20 mg/L）組PA+PTFC（40 mg/L）組PA+PTFC（80 mg/L）組PA+PTFC（160 mg/L）組孔數333333活性氧相對熒光強度1.00±0.25 18.56±1.48a 16.21±2.52 9.13±1.12b 7.00±0.45b 5.03±1.00b

圖4 HepG2 細胞內活性氧水平檢測

自噬是維持細胞穩態的重要生理功能，也是細胞用來清除存在功能障礙線粒體的主要途徑[11]。自噬通過清除受損的線粒體并降解細胞內累積的脂質，在NASH 脂質代謝紊亂進程中發揮重要作用。研究表明，NAFLD 患者肝細胞內線粒體自噬活性下降，肝臟損傷程度與其自噬受損程度密切相關[12-14]。進一步研究顯示，在高脂飲食誘導的小鼠NAFLD 模型和PA 處理的細胞模型中，均觀察到肝細胞線粒體自噬功能障礙；使用自噬激活劑后，肝細胞脂質沉積、氧化應激反應和炎癥反應明顯減輕[15-17]。

圖5 HepG2 細胞線粒體膜電位檢測

圖6 HepG2 細胞中P62、Beclin-1 和LC3 蛋白表達

本研究采用PA 誘導HepG2 細胞建立了肝細胞脂肪變性細胞模型。我們發現PTFC 能有效減少肝細胞內脂滴沉積，改善肝細胞脂肪變性；同時減低了細胞內活性氧含量。進一步研究顯示，PTFC 能夠逆轉線粒體膜電位變化，表明PTFC 改善了線粒體功能障礙。同時我們還發現，PA 處理后HepG2 細胞中與自噬活性相關的正調控蛋白Beclin-1 和LC3 表達水平下降，相應的負調控因子P62 表達升高。而PTFC 能夠部分恢復上述蛋白表達水平。編碼Beclin-1 蛋白的基因是酵母自噬相關基因ATG6 的同系物，是參與哺乳動物自噬的特異性基因，可調控與自噬相關的信號通路。Beclin-1 和ATG14 或UVRAG 結合形成自噬復合物，啟動自噬小體的形成，所以被稱為自噬的分子開關蛋白，具有調控自噬起始并募集自噬底物至自噬小體的作用[18-19]。LC3 為自噬正調控蛋白，參與自噬體的形成，細胞中LC3 的水平與自噬泡數量呈正相關[20-21]。p62 又稱SQSTM1，在自噬溶酶體降解過程中具有關鍵作用，是調節自噬的負相關因子[19]。自噬小體形成過程中，p62 可連接LC3 和泛素化的底物結合，一起整合至自噬體中，并在自噬溶酶體中被降解，因此，隨著自噬活性增高，p62 蛋白水平下降[22]。本研究結果表明，PTFC 可能參與了自噬的調控。

以上研究結果提示，PTFC 能明顯改善肝細胞脂肪變性，調控線粒體自噬可能是PTFC 改善肝細胞脂肪變性的主要作用機制之一。因此，我們推測PTFC可能通過調控線粒體自噬，保護線粒體功能，減少活性氧，抗肝細胞脂肪變性，從而達到改善NASH 的治療效果。