miR-214-5p通過DNMT1介導的AXIN2基因DNA甲基化修飾在皮膚基底細胞癌中的作用機制

熊斯穎, 邵 蕾, 楊 艷, 高愛莉, 揭麗云

(1廣州市皮膚病防治所皮膚科, 廣州 510095; 2畢節市第二人民醫院皮膚科, 貴州 畢節 551700)

皮膚基底細胞癌(Cutaneous basal cell carcinoma,BCC)是一種常見的皮膚惡性腫瘤,約占所有皮膚惡性腫瘤的70%[1-2]。近年來,在我國的發病率呈逐年升高趨勢[3]。眾所周知,長期暴露于紫外線照射是發生BCC的重要危險因素[4]。但并非所有的BCC患者都曾接受過長期紫外線照射,這表明有其他因素參與BCC的發病機制。研究顯示,遺傳、環境、免疫等因素在BCC的發生、發展中發揮著至關重要的作用[5-6]。最近,表觀遺傳學已被證實在多種疾病的發生機制中扮演著重要角色,受到了諸多學者的關注。DNA甲基化是研究最多的一種表觀遺傳修飾機制,在維持細胞功能、染色質結構改變及遺傳印記等多種生物學過程中具有重要意義[7]。研究顯示,軸抑制蛋白2(Axis inhibition protein 2,AXIN2)基因啟動子區DNA甲基化與多種癌癥的發生、發展有關[8-10]。小分子核糖核酸(microRNA,miRNA)在轉錄和轉錄后基因調控中發揮重要作用。研究表明,miR-214-5p在癌癥中表達異常,且其對下游靶蛋白DNA 甲基轉移酶1(DNA methyltransferase,DNMT1)具有負向調控作用,而AXIN2基因啟動子區DNA甲基化率受到DNMT1的調控[11]。因此,本研究在BCC患者中開展了關于miR-214-5p是否通過DNMT1介導AXIN2基因啟動子區DNA甲基化率改變參與BCC的發病機制中,為疾病的預防和靶向治療提供新視角。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集2022年1月-2023年6月在廣州市皮膚病防治所就診治療的102例BCC患者作為研究對象,其中男性65例,女性37例,年齡34～83周歲,平均年齡(65.52±5.73)歲,皮損直徑(5.03±0.62)cm,組織學分型為結節型44例,非結節型58例,發生轉移26例,無轉移76例。提取患者癌組織和癌旁正常組織標本,離體后立即用石蠟包埋保存備用。納入標準:(1)經組織病理學診斷為BCC;(2)年齡≥18周歲;(3)臨床病理資料完整;(4)患者自愿參與研究。排除標準:(1)患有其他部位腫瘤;(2)合并嚴重心、腦、肺、肝、腎功能不全;(3)患有自身免疫性疾病、血液系統疾病或神經系統疾病。本研究所有程序符合赫爾辛基宣言,經醫院倫理委員會的批準(審批號:gzsp202241),所有患者均自愿參與研究,并簽署了知情同意書。

1.2 試劑與儀器Trizol提取試劑盒(艾德萊生物,批號:RNO401);逆轉錄試劑盒(美國 Fermentas公司,批號:K1622);實時熒光定量PCR試劑盒(諾唯贊生物,批號:0111-02);實時熒光定量PCR儀(美國伯樂公司,型號:CFX384Touch);SYBR Green試劑盒(日本寶生物,批號:AJ51622A);實時熒光定量PCR所需引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;QIAGEN試劑盒(德國Hilden公司,批號:133159);EZ DNA MethylationTM-GOLD試劑盒(美國zymo公司,批號:d5005);人皮膚基底細胞癌A-431細胞由上?？道噬锟萍加邢薰咎峁?合成miR-214-5p模擬物(mimic)、抑制物(inhibitor)及其陰性對照(mimic NC和inhibitor NC)由上海吉瑪制藥公司提供。

1.3 方法

1.3.1 焦磷酸測序檢測AXIN2基因甲基化率 用QIAGEN試劑盒提取BCC癌組織和癌旁正常組織基因組DNA,紫外線分光光度法檢測DNA濃度,-80℃冰箱儲存備用。使用EZ DNA MethylationTM-GOLD試劑盒對400 ng基因組DNA進行亞硫酸氫鹽轉化。過濾DNA亞硫酸氫鹽轉化率<98%的樣品。通過瓊脂糖電泳分離目標CpG區的PCR擴增子,用QIAquick凝膠提取試劑盒純化,依據說明書使用Illumina Hiseq/Miseq 2000檢測AXIN2甲基化率。AXIN2甲基化擴增:正向引物序列5′-AGGCTGTCATGGCTGTAGTGCA-3′,反向引物序列5′-ACACCTTCCCTGAGGATGCC-3′。對擴增產物進行焦磷酸法測序,計算甲基化率。

1.3.2 實時熒光定量PCR檢測AXIN2基因、DNMT1基因mRNA和miR-214-5p相對表達水平 使用SYBR Green試劑盒測定AXIN2、DNMT1基因mRNA和miR-214-5p的表達水平。β-肌動蛋白和U6作為內參,AXIN2、DNMT1、miR-214-5p和β-肌動蛋白的引物序列見表1。采用RQ=2-ΔΔCT法計算結果并記錄。

表1 引物序列設計

1.3.3 基因的靶向關系驗證 Targetscan數據庫顯示,miR-214-5p和DNMT1基因具有靶向調控結合位點。因此,使用雙熒光素酶報告基因實驗驗證兩者之間的靶向關系。

1.3.4 miR-214-5p對基底細胞癌A431細胞的處理 用含10%胎牛血清的DMEM培養基,37℃、5% CO2培養A431細胞。分別將miR-214-5p mimic、inhibitor、mimic NC和inhibitor NC轉染至對數生長期的A431細胞中,48 h后檢測DNMT1基因mRNA表達水平和AXIN2基因甲基化率。

2 結果

2.1 不同臨床病理特征BCC患者癌組織AXIN2基因甲基化率的比較不同性別、年齡、皮損直徑、組織病理分型的BCC患者癌組織中AXIN2基因甲基化率比較差異無統計學意義(P>0.05),而發生轉移患者癌組織中AXIN2基因甲基化率相較于無轉移患者顯著上升,差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 不同臨床病理特征BCC患者癌組織AXIN2基因甲基化率的比較

2.2 癌組織和癌旁正常組織AXIN2基因甲基化率和mRNA水平的比較BCC癌組織和癌旁正常組織的AXIN2基因甲基化率分別為(6.24±1.21)%、(4.08±0.73)%,兩組間比較差異有統計學意義(t=5.128,P<0.001),見圖1A;BCC癌組織和癌旁正常組織的AXIN2基因mRNA相對表達水平分別為(0.87±0.15)、(1.56±0.28),兩組間比較差異有統計學意義(t=7.826,P<0.001),見圖1B。BCC癌組織的AXIN2基因甲基化率與其mRNA表達水平間呈負相關(r=-0.793,P<0.001)。

注: A, AXIN2基因甲基化率; B, AXIN2基因mRNA水平。

2.3 癌組織和癌旁正常組織的DNMT1基因mRNA和miR-214-5p表達水平比較BCC癌組織和癌旁正常組織的DNMT1基因mRNA表達水平分別為(2.46±0.57)、(1.71±0.26),兩組間比較差異有統計學意義(t=4.838,P<0.001),見圖2A。BCC癌組織的DNMT1基因mRNA水平與AXIN2基因甲基化率呈正相關(r=0.814,P<0.001),而與AXIN2基因mRNA表達水平呈負相關(r=-0.795,P<0.001)。BCC癌組織和癌旁正常組織的miR-214-5p表達水平分別為(0.62±0.11)、(1.13±0.16),兩組間比較差異有統計學意義(t=5.426,P<0.001),見圖2B。癌組織的miR-214-5p表達水平與DNMT1基因mRNA表達水平間呈負相關(r=-0.747,P<0.001)。

注: A, DNMT1基因mRNA水平; B, miR-214-5p水平。

2.4 miR-214-5p和DNMT1基因的靶向關系驗證生物信息學Targetscan數據庫顯示,miR-214-5p和DNMT1基因具有潛在靶向結合位點,且雙熒光素酶報告基因實驗結果表明,DNMT1是miR-214-5p的靶基因,見圖3。

注: A, miR-214-5p和DNMT1靶向結合位點; B, 與miR-214-5p-mimic組比較,***P<0.001。

2.5 轉染后的細胞DNMT1基因mRNA水平的比較與mimic NC (1.02±0.11)、 inhibitor (1.63±0.18)和inhibitor NC(1.01±0.14)比較,miR-214-5p mimic的DNMT1基因mRNA水平(0.62±0.09)顯著降低,差異有統計學意義(P<0.001);而inhibitor的DNMT1基因mRNA水平相較于其他三組顯著上升,差異有統計學意義(P<0.001),見圖4。

注:與其他三組比較, ***P<0.001。

2.6 轉染后的細胞AXIN2基因甲基化率的比較與mimic NC(3.26±0.47)%、inhibitor(5.79±0.83)%和inhibitor NC(3.31±0.42)%比較,miR-214-5p mimic的AXIN2基因甲基化率(2.13±0.32)%顯著降低, 差異有統計學意義(P<0.001); 而inhibitor的AXIN2基因甲基化率與其他三組相比顯著升高,差異有統計學意義(P<0.001),見圖5。

注:與其他三組比較, ***P<0.001。

3 討論

BCC是一種好發于面頸部、手部等暴露部位的惡性腫瘤,嚴重危害患者的生命健康和生活質量[12-13]。本研究通過分析發現,AXIN2基因甲基化率與BCC的發生、發展有關,這有助于闡明BCC的發病機制,為其臨床治療靶標的發現提供參考。AXIN2是Wnt/β-catenin信號通路的負調控因子。研究表明,Wnt/β-catenin信號通路的異常激活使得c-myc和Cyclin D1轉錄增強,對細胞增殖、分化、遷移、凋亡等多種細胞生物學功能具有調控作用,該通路已被證實在多種癌癥的發生、發展中起關鍵作用[14-15]。乳腺癌組織中,AXIN2基因啟動子甲基化陽性率(40.5%)相較于癌旁組織(19.0 %)顯著升高,且癌組織中的AXIN2甲基化表達水平與淋巴結轉移、雌激素受體及孕激素受體表達狀態有關[8]。結腸癌組織中,AXIN2基因甲基化率顯著增高,且與疾病的進展有關[9]。Kandimalla等[10]研究結果顯示,AXIN2甲基化率升高與II期結腸癌復發密切相關,可作為結腸癌不良預后的生物標志物。本研究結果顯示,BCC癌組織的AXIN2基因甲基化率顯著高于癌旁正常組織,而基因mRNA相對表達水平顯著低于癌旁正常組織,且BCC癌組織的AXIN2基因甲基化率和mRNA相對表達水平呈負相關。此外,發生轉移患者癌組織中AXIN2基因甲基化率顯著高于無轉移患者。提示AXIN2基因甲基化率升高可能通過下調基因表達參與到BCC的發生機制中。

基因甲基化率受DNA甲基轉移酶家族調控,DNMT1作為該家族的重要成員之一,在基因甲基化率調控中起著關鍵作用。Targetscan數據庫分析結果表明,DNMT1與miR-214-5p具有靶向結合位點。本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗結果也驗證了miR-214-5p與DNMT1的靶向關系。因此,DNMT1是miR-214-5p的靶基因。miR-214-5p已被證實可參與到多種癌癥的發生、發展中[16-17]。Cao等[16]的研究顯示,miR-214-5p對胰腺癌細胞的遷移和侵襲具有調控作用,可作為胰腺癌靶向治療的生物學標志。Zhang等[17]的研究發現miR-214-5p可通過靶向ROCK1抑制人骨肉瘤細胞的增殖和侵襲。本研究結果顯示,miR-214-5p在BCC患者中的表達水平降低,而DNMT1表達水平升高。提示miR-214-5p可能通過靶向DNMT1表達參與BCC的發病機制中。為進一步明確miR-214-5p通過DNMT1介導的AXIN2基因DNA甲基化修飾在BCC中的作用機制,本研究使用miR-214-5p轉染A431細胞結果顯示,miR-214-5pmimic的DNMT1表達水平和AXIN2基因甲基化率相對于其他三組顯著下降,而inhibitor的DNMT1表達水平和AXIN2基因甲基化率相對于其他三組顯著上升。表明BCC中miR-214-5p表達水平下調,上調DNMT1的表達水平,使AXIN2基因甲基化率升高。

綜上所述,miR-214-5p可通過靶向作用于DNMT1,影響AXIN2基因的DNA甲基化率,調節AXIN2基因表達,參與到BCC的發病機制中。