米糠酚類物質對高脂誘導的小鼠糖代謝異常及氧化應激的改善作用

馬 勤，童 鑫，張名位，董麗紅，黃 菲，趙 東，池建偉，賈栩超，張瑞芬

（廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所 農業農村部功能食品重點實驗室廣東省農產品加工重點實驗室 廣州 510640）

隨著生活水平的提高，高脂膳食也日益流行，由此造成了肥胖癥的發生，進而引發糖尿病等慢性疾病。脂質的積累與機體的氧化應激水平密切相關，氧化應激條件下可通過激活相關代謝通路，增加脂肪的生成并減少脂肪的分解，來促進機體脂質積累[1]。此外氧化應激反應可影響骨骼肌和脂肪組織中葡萄糖的吸收，并引起胰島素抵抗[2]，因此降低體內氧化應激水平是改善脂代謝和糖尿病的重要途徑。酚類物質是植物中重要的次級代謝產物，是一種重要的抗氧化劑，可能是膳食中預防糖脂代謝紊亂的重要活性物質[3-4]。在臨床上，姜黃素、表沒食子兒茶素和咖啡因等抗氧化劑已被用于肥胖癥的預防[5-6]。流行病學研究表明增加主食中全谷物的比例能夠明顯降低肥胖、糖尿病、動脈粥樣硬化等慢性疾病的發病風險[7-8]。隨著對全谷物認知的加深，越來越多的科研人員對全谷物進行開發利用以替代精制谷物。糙米作為一種典型的全谷物，富含酚酸、膳食纖維、γ-谷維素等生物活性物質，且大部分存在于麩皮層[9]。目前有研究表明米糠酚類物質具有改善脂代謝的作用，然而其改善糖代謝的活性作用及其機制尚不清楚。通過動物實驗探究米糠酚類物質對高脂膳食引起的糖代謝異常及氧化應激的影響，對引導民眾健康飲食具有一定的意義。

HPLC 分析顯示糙米中富含對香豆酸、阿魏酸、表兒茶素、原兒茶酸、芥子酸等酚酸類物質；藥理學研究發現其具有抗氧化、抗炎、降血脂、護肝等活性[10-12]。富含酚類物質的紅米可通過ACAT-2、HMG-CoA 還原酶和SREBP-2 降低肝臟膽固醇合成，并通過CYP7a1 和CYP8b1 促進高膽固醇飲食小鼠肝臟膽固醇降解，從而發揮降低膽固醇的作用[13]。課題組前期研究發現米糠酚類物質通過AMPK 信號通路降低肝臟中脂質的生物合成，促進脂肪酸的氧化分解，從而調節脂代謝[14]。米糠酚類物質可通過抗氧化活性減少自由基損失，從而改善β 細胞功能障礙，促進胰島素分泌[15]。

米糠酚類物質具有抗氧化的作用已廣泛報道，且有研究證實其具有改善脂代謝的作用并能調節胰島細胞的功能，然而其是否與改善機體氧化應激相關尚不清楚。本研究采用高脂膳食誘導的小鼠模型，研究米糠酚類物質對其糖脂代謝的影響，重點探討其對脂肪組織細胞形態、體內相關激素水平及氧化應激水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮米糠，廣州荔泉食品有限公司；HPD-300大孔樹脂，滄州寶恩吸附材料科技有限公司；6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠購于中山大學實驗動物中心（許可證號為SYXK（粵）2012-0081）；胰島素ELISA 試劑盒，Crystal Chem 公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽（GSH）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒，南京建成生物工程研究所；Infinite M200pro 酶標儀，TECAN 公司；Nikon Eclipse Ci 顯微鏡，Nikon 公司；ACCUCHEK Mobile 血糖儀，德國Roche 公司。

1.2 米糠酚類物質的制備

米糠酚類物質參考前期研究的方法制備[10]。采用超臨界二氧化碳的方法進行脫脂得到脫脂米糠，采用冷的80%的丙酮水溶液對脫脂米糠中酚類物質進行提取，提取液濃縮后過HPD-300 大孔樹脂，純水洗脫后，采用70%乙醇洗脫，洗脫液經旋轉蒸發儀濃縮，并經冷凍干燥后得到米糠酚類物質粉末。采用Folin-Ciocalteu 比色法測定米糠酚類物總酚含量，采用HPLC-DAD 檢測米糠酚類提取物中酚類物質的構成及其含量。所得總酚含量為82.5%，對香豆酸、蘆丁、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸是含量最高的5 種化合物，其含量分別為（86.18 ± 3.16），（81.75± 1.38），（81.87 ± 1.12），（68.74±3.15），（58.36±2.44）mg/g[10]。

1.3 動物飼養

80 只C57BL/6J 小鼠于溫度（23±2）℃，相對濕度40%～60%的條件下適應飼養1 周后，隨機分為4 組（n=20）：正常組（NC 組）、高脂組（HF 組）、低劑量組（HF+LP 組）和高劑量組（HF+HP 組）。其中NC 組飼喂正常飼料，HF 組、低劑量組和高劑量組均飼喂高脂飼料，低劑量組和高劑量組分別灌胃200 mg/（kg·d）和400 mg/（kg·d）劑量的米糠酚類物質（RBPE），NC 組和HF 組灌胃相同體積的蒸餾水作為對照。

飼喂16 周后，小鼠禁食12 h，眼眶取血，3 000×g 離心15 min 后，取上清保存于-80 ℃冰箱備用。處死小鼠后取肝、脾、腎、附睪脂肪及腎周脂肪并稱重，計算臟器指數。取部分新鮮附睪脂肪組織固定于4%多聚甲醛溶液中，用于組織染色。其余臟器分裝保存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 組織染色

新鮮附睪脂肪組織經4%多聚甲醛固定24 h后，脫水、包埋切片后，用蘇木素-伊紅染色，并于顯微鏡下觀察拍照。

1.5 血糖、胰島素水平測定

小鼠禁食、不禁水12 h 后，眼眶取血，采用羅氏血糖儀測定空腹血糖；參照試劑盒說明書的方法測定血清胰島素和瘦素水平。

1.6 葡萄糖耐量測定

小鼠處死前1 周，禁食、不禁水12 h，腹腔注射葡萄糖溶液（2.0 g/kg）后，斷尾取血，采用羅氏血糖儀分別測定0，0.5，1.0，1.5，2.0 h 的血糖水平，并計算血糖曲線下面積（AUC）。

1.7 血清及肝臟氧化應激水平測定

根據試劑盒操作說明書測定血清和肝臟MDA、SOD、GSH、GSH-px 和CAT 的水平。

1.8 數據處理

所有數據以“平均值±標準偏差（SD）”表示，采用SPSS 18.0 軟件進行單因素方差分析，P＜0.05表示為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 RBPE 對高脂喂養小鼠體質量和臟器指數的影響

由圖1 可知，各組小鼠體質量均隨著飼喂時間的延長而增長，其中HF 組小鼠的體質量增長幅度最大，低劑量和高劑量的RBPE 可以減緩高脂膳食引起的體質量增加，而差異不顯著。由表1可知，與正常飲食相比，高脂膳食可以顯著提高小鼠肝臟、附睪脂肪、腎周脂肪、腎臟和脾臟的臟體比（P＜0.05）。RBPE 可以劑量依賴地降低肝臟、附睪脂肪和腎周脂肪的臟體比（P＜0.05）；高劑量的RBPE 膳食可以顯著降低腎臟的臟體比，而低劑量的RBPE 對脾臟的臟體比沒有顯著影響。這些結果表明RBPE 可以降低高脂膳食引起的小鼠內臟脂肪的積累。

圖1 RBPE 對小鼠的體質量的影響Fig.1 Effect of RBPE on body weight of mice

2.2 RBPE 對高脂喂養小鼠血糖的影響

各組小鼠血糖水平及其口服葡萄糖耐量下曲線面積如圖2 所示。與NC 組相比，HF 組小鼠空腹血糖水平顯著升高，而低劑量和高劑量RBPE均可以顯著降低高脂小鼠的空腹血糖水平（P＜0.05），提示RBPE 可以有效改善高脂膳食引起的小鼠血糖水平升高。葡萄糖耐量可反應胰島β 細胞功能以及機體對血糖的調節能力[16]。結果顯示，腹腔注射葡萄糖后各組小鼠血糖均迅速升高，于0.5 h 達到最大值并緩慢下降。2 h 時，NC 組和RBPE 處理組小鼠血糖水平均恢復至正常水平，而HF 組小鼠血糖仍處于較高水平?？崭固悄土壳€下面積（AUC）結果顯示，高脂膳食明顯導致糖耐量受損，而RBPE 對高脂引起的糖耐量受損具有一定的改善作用（P＜0.05）。這些結果表明RBPE 對高脂引起的小鼠糖代謝異常具有改善作用。

圖2 RBPE 對小鼠糖代謝的影響Fig.2 Effect of RBPE on glucose metabolism in mice

2.3 RBPE 對高脂喂養小鼠胰島素水平和附睪脂肪組織形態的影響

胰島素抵抗是2 型糖尿病的重要特征，機體表現為高胰島血癥，而胰島素敏感性降低[17]。血清胰島素測定結果如圖3a 所示，與NC 組相比，HF組小鼠胰島素水平顯著升高（P＜0.05），而高劑量RBPE 干預可顯著降低高脂小鼠的血清胰島素水平（P＜0.05）。脂肪組織在糖尿病的發展過程中發揮重要作用，其可以通過調控PKCε 介導脂肪飲食誘導的胰島素抵抗，而當存在和缺乏PKCε 時，脂肪細胞在形狀和大小上會表現出差異[18]。因此進一步探究了RBPE 對小鼠附睪脂肪組織形態的影響。結果如圖3b 所示，與NC 組相比，HF 組小鼠附睪脂肪細胞顯著增大，而經RBPE 干預鼠附睪脂肪細胞的體積明顯減小。這些結果表明RBPE 對高脂引起的小鼠高胰島血癥具有一定的抑制作用。

圖3 RBPE 對小鼠胰島素水平（a）和附睪脂肪組織形態（b）的影響Fig.3 Effect of RBPE on insulin level（a）and histopathological observation of epididymal fat tissue（b）

2.4 RBPE 對高脂喂養小鼠氧化應激水平的影響

SOD、CAT 和GPx 是內源性抗氧化酶，可以清除細胞內的氧自由基。GSH 是一種主要的內源性抗氧化劑，能中和細胞內的自由基和活性氧化合物。SOD、CAT、GPx 和GSH 在維持機體氧化還原穩態中發揮重要作用；MDA 為脂質過氧化的終產物，可反映機體氧化損傷程度[19-20]。各組小鼠血清SOD 活力和MDA 含量如表2 所示，與NC 組相比，HF 組小鼠SOD 的活力顯著降低，MDA 的含量顯著升高（P＜0.05）。與高脂膳食相比，RBPE 膳食可以顯著提高SOD 的酶活力，并降低血清MDA的含量（P＜0.05）。肝臟是調節血糖代謝的重要器官。各組小鼠肝臟的氧化應激水平如表2 所示，與正常飲食相比，高脂膳食顯著降低肝臟SOD、CAT和GSH-px 等抗氧化酶的活力，降低抗氧化物GSH 的含量，并促進過氧化產物MDA 的產生（P＜0.05）。與HF 組相比，RBPE 組小鼠的SOD、CAT和GSH-px 等抗氧化酶的活力顯著提高，MDA 含量顯著下降，且抗氧化物GSH 的含量顯著升高（P＜0.05）。這些結果表明RBPE 可以顯著降低高脂膳食引起的小鼠體內氧化應激水平。

表2 RBPE 對小鼠血清和肝臟氧化應激水平的影響Table 2 Effect of RBPE on oxidative stress in serum and liver

3 討論與結論

本研究發現米糠酚類物質可以顯著減少高脂小鼠臟器脂肪積累，降低空腹血糖水平，改善小鼠的葡萄糖耐受性，調節小鼠糖代謝紊亂。Justo 等[12]的研究也表明米糠酶解提取物可以減輕高脂誘導的小鼠的血糖升高、胰島素抵抗、血脂異常以及脂肪組織的形態改變。Jung 等[11]探究了米糠酚酸類物質和阿魏酸對db/db 小鼠的影響，結果表明兩者均可以顯著降低小鼠血糖水平。本研究中米糠提取物酚類物質含量超過80%，其主要成分為對香豆酸、蘆丁、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸。研究表明咖啡酸、阿魏酸、沒食子酸和原兒茶酸可顯著降低高果糖飲食誘導的大鼠血糖、胰島素和瘦體水平，減少血清炎癥因子的含量[21-22]。這些研究結果一致表明米糠酚類物質具有改善糖代謝的作用。

米糠酚類物質體外抗氧化作用已被廣泛報道，研究顯示其具有清除ABTS、DPPH、過氧化自由基（ORAC 法）的作用[23-25]。Saji 等[26]發現米糠酚類物質可以顯著抑制過氧化氫誘導的RAW 264.7細胞內活性氧生成，降低細胞內MDA 水平。Xiao等[27]研究表明米糠酚類物質可以通過減輕線粒體功能障礙，降低酒精誘導的小鼠體內氧化損失，從而發揮護肝的作用。然而米糠酚類物質對高脂誘導的小鼠體內氧化應激作用尚不清楚。本研究表明米糠酚類物質可以提高高脂小鼠SOD、CAT 和GSH-px 等抗氧化酶的活力，降低MDA 的含量，并提高抗氧化物GSH 的含量，降低高脂引起的氧化應激反應。蘆丁可以降低高脂小鼠肝臟MDA 的水平，提高GSH 含量，并提高SOD 和GPx 等抗氧化酶的活性[28]。Shen 等[29]研究表明米糠酚類物質的主要成分對香豆酸可以通過Nrf 信號通路抑制活性氧的生成，從而改善高脂小鼠的糖脂代謝。這些研究提示米糠酚類物質改善高脂小鼠氧化應激的作用，可能是對香豆酸、蘆丁、阿魏酸等酚類物質協同作用的結果。

本研究發現米糠酚類物質可以顯著改善高脂小鼠的糖代謝紊亂，其機制可能通過提高機體SOD、CAT 和GSH-px 等抗氧化酶的活力，促進GSH 等抗氧化物質的合成，并降低氧化產物MDA的產生從而降低小鼠體內氧化應激水平。