牛蒡根對單純型肥胖大鼠護肝、降脂及肝源性血糖異常的改善作用

馬愷揚，馮 進，宋欣欣，2，高 蓉，盛偉喜，2，李 瑩*

（1 江蘇省農業科學院農產品加工研究所 南京210014 2 南京農業大學食品科技學院 南京210095 3 南京醫科大學公共衛生學院 南京 211166）

肥胖已成為現代社會的主要健康問題之一，特別是現代人群飲食不規律以及缺乏鍛煉等導致的單純性肥胖現象日益嚴重[1]。單純性肥胖主要是由于攝入的食物熱量大于消耗所需熱量或機體代謝異常導致的體內脂肪積累過多引起的超重，并伴隨著人體生理病變的發生，如糖尿病、脂肪肝等[2]。肝臟是脂質代謝的主要場所，單純性肥胖引起的脂肪，如甘油三脂等囤積導致肝臟發生脂肪變性[3]，長期的脂肪變性引發肝臟損傷[4]。除此之外，肝臟是合成糖原的主要場所之一，肝實質損傷導致肝臟細胞功能受損，合成糖原的能力下降，進而使機體血糖水平升高并加重胰腺負擔，長期以往造成肝源性糖尿病的發生和發展[5]。

近年來，研究發現植物源功能食品或中草藥具有較好的減肥、護肝和降血糖作用[6-7]，且相對護肝的藥物如非諾貝特等毒性更小，更利于長期服用以達到治療或預防的預期效果。牛蒡根是一種食藥同源的新資源食品，因含有豐富的膳食纖維、多酚類等活性物質而具有多種藥理活性，如抗氧化、降血糖等[8]。研究發現牛蒡根具有減肥的作用[9]，對血脂和體質量均具有一定的抑制作用[10-11]，這表明牛蒡根對肥胖和脂質代謝具有調控功能，并且有研究發現牛蒡根提取物具有顯著改善肝臟甘油三酯和膽固醇水平的作用[12]。目前牛蒡根對肝臟的保護作用研究較少，尤其鮮見對單純性肥胖引起的肝源性糖尿病的研究。

本實驗建立高糖、高脂飲食誘導的單純性肥胖大鼠模型，通過灌胃牛蒡根粉研究對單純性肥胖大鼠的肝臟的保護功能以及對肝源性血糖水平異常的改善作用，為牛蒡根作為功能性食品原料，在護肝、降脂及肝源性糖尿病的預防方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛蒡根，購于江蘇徐州豐縣，牛蒡根粉經超微粉碎獲得；甘油三酯（TG）測定試劑盒、總膽固醇（TCHO）檢測試劑盒、油紅O 染色試劑盒、谷丙轉氨酶（ALT）試劑盒、谷草轉氨酶（AST）試劑盒，南京建成生物研究所；蘇木素一紅染色試劑盒，北京索萊寶生物科技。

高熱量飼料：維持飼料60.58%、蔗糖15%、豬油15%、酪蛋白8.76%、磷酸氫鈣0.66%，江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司提供，生產許可證：蘇飼證（2019）01008。

1.2 儀器

微孔板酶標儀（EPOCH），BioTek；生化檢測儀（BK-200），OLABO；光學顯微鏡（ECLIPSE 80i），Nikon。

1.2 動物實驗設計及方法

Sprague-Dawley（SD）大鼠（5 周齡），許可證號：SYXK（蘇）2020-0006，購于上海SLAC 實驗動物有限公司。實驗大鼠在南京醫科大學動物中心飼養，屏障環境溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%。嚴格按照南京醫科大學機構動物護理和使用委員會的指導方針飼養。本研究中使用動物的倫理批準號為DWRL2020056。實驗周期為8 周。

研究發現500～1 000 mg/kg bw/d 劑量的牛蒡根有顯著的減肥作用[10]，該劑量對肝臟的保護無明顯作用，作為日常食用的食品，劑量的選擇可以擴大。最終分別選擇7.5 g/kg bw/d 和15 g/kg bw/d作為低劑量組和高劑量組。50 只大鼠按體質量隨機分為2 組，10 只大鼠給予維持飼料作為空白對照組，40 只給予高熱量飼料作為模型組。每周記錄給食量、撒食量、剩食量，稱量體質量1 次。喂養2 周后，給予高熱量飼料的大鼠按體質量排序，淘汰體質量增加較低的1/3 肥胖抵抗大鼠。將30 只大鼠分為3 組：對照組（CON 組）、造模組（HSHFD組）、低劑量組（L-ALP 組）和高劑量組（H-ALP組）。HSHFD 組和牛蒡根粉干預組保持高糖高脂飲食。牛蒡根粉干預實驗持續42 d，劑量組灌胃牛蒡根粉（7.5 g/kg bw/d 和15 g/kg bw/d），空白對照組繼續維持正常飲食，實驗總共持續56 d，具體流程如圖1 所示。在此期間，檢測食物攝入量和體質量。之后，用1%戊巴比妥鈉（0.5 mL/100 g bw）麻醉，解剖取腎周圍脂肪、睪丸周圍脂肪，并分別稱重，計算脂體比。摘取大鼠肝、脾、腎、胰腺組織，稱重，于-80 ℃保存備用。

圖1 高糖高脂誘導的單純性肥胖大鼠動物實驗流程圖Fig.1 Flow chart of animal experiment in simple obese rats induced by high sugar and high fat

1.3 大鼠血液生化指標檢測

大鼠麻醉后，尾部取血，采用生化儀檢測以下血液生化指標：谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、葡萄糖（GLU）、游離脂肪酸（NEFA）、膽固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDLC）、低密度脂蛋白（LDL-C）、胰島素。

1.4 蘇木精和伊紅染色與油紅O 染色

對肝組織和胰腺組織的冷凍切片進行蘇木精和伊紅（H &E）染色。切片用蘇木素室溫染色至細胞核變藍，轉入伊紅溶液室溫染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，通風處晾干，胰腺HE 染色切片中性香脂密封，室溫下儲存。在HE 染色條件下，脂類均會被染色過程中使用的二甲苯等有機溶劑溶解而成空泡或空斑樣，空泡樣脂滴輪廓清晰。為了證明脂類成分，對肝臟切片進行油紅O 染色，晾干后的肝臟HE 染色切片加入油紅O 染色5～10 min，異丙醇除去多余染液，用蒸餾水清洗3 次，通風處晾干。染色后的肝臟切片用中性香脂密封，室溫儲存。所有拍攝均為光學顯微鏡拍攝，放大倍數為200 倍。

1.5 肝臟中甘油三脂和膽固醇的檢測

取大鼠肝臟組織勻漿處理，按甘油三酯和膽固醇檢測試劑盒說明書操作，采用比色法在波長510 nm 處用酶標儀檢測OD 值，計算甘油三酯和膽固醇含量。

1.6 數據分析

采用SPSS 20.0 統計軟件進行數據分析，多組間的比較采用單因素方差分析。兩組間的差異顯著性比較用t 檢驗。雙側P ＜0.05 表示差異具有統計學意義。實驗數據用“平均值±標準差”（xˉ ±s）表示。

2 結果與分析

2.1 牛蒡根粉對高糖、高脂飲食所致大鼠體質量增加與食物攝取的影響

動物實驗如圖1 所示。由表1 可知，與對照組相比，HSHFD 組體質量在整個實驗周期呈現增長的趨勢。在大鼠灌胃牛蒡根粉的第4 周，牛蒡根粉干預的L-ALP 組和H-ALP 組相對于HSHFD 組增長速度顯著變緩（P＜0.05），且在第6 周結束時H-ALP 組體質量與對照組體質量接近。第6 周結束后，各組大鼠增加的體質量總和，HSHF 組顯著高于對照組，L-ALP 組與H-ALP 組增加的體質量總和相較于HSHF 組，顯著減少且增量接近對照組（P＜0.05），這一結果與體質量變化趨同（圖2a）。這表明高劑量牛蒡根粉在一定程度上抑制了肥胖大鼠體質量增加。在大鼠實驗周期內檢測每周大鼠攝食量的變化，圖2b 所示，整個實驗周期對照組和HSHFD 組食欲無顯著性差異，而在牛蒡根粉干預后，L-ALP 組與H-ALP 組大鼠攝食量與HSHF 組相比均呈顯著下降趨勢（P＜0.05），特別是H-ALP 組在第1 周時出現攝食量顯著減少的現象（P＜0.05），這表明牛蒡根粉可能通過抑制大鼠食欲，來減少大鼠的攝食量。單純性肥胖主要是熱量攝入高于自身消耗所致。實驗結束后統計各組大鼠熱量攝入，如圖2c 所示HSHFD 組大鼠攝入熱量顯著高于對照組，而牛蒡根粉干預組相較于HSHF 組攝入熱量均顯著降低（P＜0.05）。以上結果表明，牛蒡根能顯著降低大鼠體質量，抑制單純性肥胖大鼠熱量攝入。

表1 牛蒡根粉對大鼠體質量的影響Table 1 Effects of Arctium lappa L.root powder on body weight of rats

圖2 牛蒡根粉對大鼠體質量增量、攝食量及攝入熱量的影響Fig.2 Effects of Arctium lappa L.root powder on body weight gain，food intake and calorie intake in rats

2.2 牛蒡根粉對高糖高脂誘導的大鼠體內脂肪及血脂的影響

如圖2c 所示，牛蒡根可以抑制肥胖大鼠熱量的攝入，這有利于減少體內能量過剩及脂肪囤積。第6 周實驗結束，解剖各組大鼠后，其體內脂肪如表2 所示。HSHF 組體內脂肪質量顯著高于對照組，牛蒡根干預的L-ALP 組與H-ALP 組的體內脂肪質量顯著低于HSHF 組（P＜0.05），脂體比、性旁脂肪及腎旁脂肪與體內脂肪趨同，表明牛蒡根有顯著減少體內脂肪囤積的作用。體內脂肪囤積是體內脂質代謝異常所致，提示牛蒡根對血脂有調節作用。血清生化結果如圖3a、3b、3c 所示，HSHFD 組LDL-C、TG、CHOL 水平較對照組顯著增加（P＜0.05），而牛蒡根干預的L-ALP 組與HALP 組結果顯示LDL-C、TG、TC 水平較HSHFD組顯著降低（P＜0.05），且H-ALP 組的TG 水平相較于HSHFD 組下降1 倍，甘油三酯與游離脂肪酸呈正相關性，如圖3e 所示。H-ALP 組的NEFA 水平相較于HSHFD 組顯著下降（P＜0.05），其中HDL-C 水平在所有實驗大鼠組中無顯著變化，如圖3d 所示。以上結果表明，牛蒡根具有抑制肥胖大鼠體內脂肪囤積，降低體內血脂的作用，特別是對體內甘油三酯具有較強的調節作用。

表2 牛蒡根粉對大鼠體內脂肪的影響Table 2 Effects of Arctium lappa L.root powder on body fat in rats

圖3 牛蒡根粉對大鼠脂質相關血清生化水平的影響Fig.3 Effects of Arctium lappa L.root powder on lipid-related serum biochemical levels in rats

2.3 牛蒡根粉對高糖、高脂誘導的肥胖大鼠肝臟脂肪變性及肝臟損傷的改善作用

肝臟是體內脂質代謝的關鍵場所，肝臟功能的完整性決定著體內脂肪代謝程度[13]。如圖3 所示，牛蒡根對體內血脂有調節作用，這表明牛蒡根可能影響肥胖大鼠的肝臟功能。大鼠實驗6 周后解剖得到各組大鼠肝臟，進行形態評價，如圖4 所示。通過與對照組相比，HSHFD 肝臟形態更加腫大，肝臟邊緣鈍化，表面散發油脂狀光澤。牛蒡根干預肥胖的L-ALP 組與H-ALP 組與HSHFD 相比體積明顯減小，肝臟邊緣銳化，油脂狀光澤減少，整體形態趨于正常，特別是H-ALP 組形態與對照組近乎一致。對各組大鼠肝臟組織切片進行HE 油紅O 染色，結果如圖5 所示。通過共聚焦顯微鏡觀察發現，HSHFD 組大鼠的肝臟病理切片較正常對照組的肝細胞腫脹，油紅染色脂滴明顯增多。與HSHFD 組相比，L-ALP 組與H-ALP 組大鼠肝組織整體結構明顯改善，油紅染色脂滴明顯減少，且細胞排列的較規則，特別是H-ALP 組的肝臟細胞以肝靜脈為中心呈放射狀整齊排列。以上結果表明，牛蒡根具有顯著改善脂肪變性的作用，并有抑制脂肪肝形成的作用。

圖4 牛蒡根粉對肥胖大鼠肝臟形態的影響Fig.4 Effects of Arctium lappa L.root powder on liver morphology in obese rats

圖5 牛蒡根粉對肝臟脂肪變性的影響（標尺：100 μm）Fig.5 Effects of Arctium lappa L.root powder on hepatic steatosis（bar：100 μm）

肝臟脂肪變性是甘油三酯長期積累在肝臟細胞中形成的病態現象，長期脂肪變性不但增加形成脂肪肝的風險，還會造成脂毒性[14]。對肝臟組織勻漿檢測TG 和CHOL，結果如圖6a、6b 所示，HSHFD 組大鼠肝臟相較于對照組的TG 與CHOL含量有極顯著的差異（P＜0.001），L-ALP 組（P＜0.05）與H-ALP 組（P＜0.01）相對于HSHFD 組呈現顯著降低的趨勢，其中H-ALP 組的TG 含量降至對照組水平，這表明牛蒡根可以降低肥胖大鼠肝臟的脂毒性。肝臟脂毒性是造成肝臟損傷的重要因素，大鼠血清生化結果，如圖7a、7b 所示，HSHFD 組大鼠血液中谷丙轉氨酶（ALT）（P＜0.05）和谷草轉氨酶（AST）（P＜0.01）水平顯著高于對照組，L-ALP 組與H-ALP 組相對于HSHFD 組大鼠血液中ALT、AST 水平則呈現顯著降低的趨勢，均降低到對照組水平。ALT 與AST 是肝臟中的標志性酶，當肝臟損傷時這兩種酶會釋放進入血液中，兩種轉氨酶的水平代表肝臟的損傷程度。從以上結果可知，牛蒡根具有降低肥胖大鼠肝臟脂毒性的作用，且可以減輕肝臟損傷，具有一定的護肝功效。

圖6 牛蒡根粉對大鼠肝臟甘油三脂、膽固醇水平的影響Fig.6 Effects of Arctium lappa L.root powder on on triglyceride and cholesterol levels in rat liver

圖7 牛蒡根粉對大鼠肝臟損傷的影響Fig.7 Effects of Arctium lappa L.root powder on liver injury in rats

2.4 牛蒡根粉對肥胖大鼠肝臟損傷伴隨的血糖變化的調節作用

肥胖具有抑制肝臟合成糖原的能力，直接導致血糖水平升高。牛蒡根粉可以挽救肝臟損傷，這意味著牛蒡根粉可能調節肝源性血糖異常。各組大鼠血液葡萄糖生化指標如圖8 所示，HSHFD組大鼠血糖水平顯著升高（P＜0.01），而牛蒡根粉干預的L-ALP 組與H-ALP 組可以顯著降低肥胖大鼠血糖水平（P＜0.05），且H-ALP 組血糖水平降至對照組水平。這一結果表明牛蒡根粉可以調節肝臟損傷伴隨的血糖異常升高。

圖8 牛蒡根粉對大鼠血糖水平的影響Fig.8 Effects of Arctium lappa L.root powder on blood glucose level in rats

牛蒡根對血糖水平的調節作用，提示可能對胰腺病理狀態有改善作用。通過胰腺HE 染色驗證牛蒡根粉對肥胖大鼠胰腺組織的作用。如圖9所示，對照組的大鼠胰腺組織完整，胰島結構飽滿，具有排列緊密的完整β 細胞，胰島與外分泌腺界限清楚。而HSHF 組大鼠的胰島結構不完整，β細胞近乎破損，無正常細胞形態，胰島邊界不均勻，內部呈現空泡浸潤，且相對完整的胰島呈萎縮的趨勢，這表明高糖、高脂飲食對肥胖大鼠的胰腺造成負擔和實質性損傷。給予高低劑量的牛蒡根粉干預后可明顯減輕胰腺組織的病理形態，表現為胰島完整且接近對照組形態，且胰島中β細胞排列相對緊密，內部空泡浸潤現象得到改善，胰島形態相對HSHF 組邊界清晰且結構豐滿。以上結果表明牛蒡根粉可以改善高糖、高脂飲食誘導的大鼠胰腺病理狀態，可能通過減輕肝臟損傷調節血糖水平，減少胰腺負擔，避免胰島萎縮。

圖9 牛蒡根粉對大鼠胰腺病理切片的影響（標尺：100 μm）Fig.9 Effects of Arctium lappa L.root powder on pathological sections of rat pancreas（bar：100 μm）

胰島素是體內唯一一種降低血糖的激素。為了探究牛蒡根降低肥胖大鼠血糖的作用是否與胰島素有關，在動物實驗第21 天和第42 天時檢測大鼠胰島素水平及胰島素抵抗指數[15]（胰島素抵抗指數=），實驗結果如表3 所示。各組大鼠胰島素水平及胰島素抵抗指數在實驗周期內沒有明顯變化，且胰島素抵抗指數在2.69 左右，沒有明顯的胰島素抵抗現象。以上結果表明：實驗周期內高糖、高脂飲食誘導的肥胖大鼠沒有影響大鼠胰島素水平，牛蒡根可能主要通過減輕肝臟損傷抑制肝源性血糖升高。

表3 牛蒡根粉對大鼠胰島素水平、胰島素抵抗指數的影響Table 3 Effects of Arctium lappa L.root powder on insulin level and insulin resistance index in rats

3 討論與結論

牛蒡根富含多酚、多糖、膳食纖維等，是一種具有多種活性功能的植物源食品原料[16]，對肥胖、糖尿病、高脂血癥等有一定的有益作用[17]。牛蒡根被中國定義為新資源食品，安全無毒，作為功能食品原料進行開發具有極大的潛力[18-19]。牛蒡早在日本、歐洲等國家備受青睞，但牛蒡的研究仍處于探索階段，甚至功能的挖掘也并不深入。如表1、表2和圖2 所示，牛蒡根具有抑制體質量增長，減少外周脂肪組織的作用，且具有較好的降脂作用，如圖3 所示，甘油三酯和膽固醇水平得到改善。肝臟是脂質代謝的主要場所，這表明牛蒡根對肝臟有一定的影響。本實驗確實驗證了這一觀點，如圖5、圖7 所示，牛蒡根粉可以改善肝臟的脂肪變性，減少脂毒性進而減輕肝臟損傷，對肝臟具有保護作用。牛蒡中多酚類物質含量豐富，本課題之前的研究發現牛蒡中綠原酸的生物利用度較高[20]，研究發現綠原酸對代謝性脂肪肝病具有一定的改善作用[21]，所以牛蒡根的護肝功效可能與牛蒡中綠原酸等活性物質息息相關。

肝臟是人體脂質代謝的主要場所，同時也是合成糖原的關鍵部位。肥胖引起的肝臟損傷可以導致體內血糖水平的失衡，這種伴隨肝實質損傷的肝源性血糖異常的發生往往是糖尿病初期的普遍現象，隨著病理進程加快逐漸演變成糖尿病[22]。不同于1 型糖尿病，肝源性糖尿病可以通過改善肝實質病理狀態可逆性干預治療，肝臟損傷及時得到改善可以有效調節血糖異常，預防糖尿病的發生[23]。本研究表明，如圖7、圖8、圖9 所示，高糖高脂飲食誘導的大鼠發生明顯的肝臟損傷，這也導致血糖水平顯著升高，牛蒡根粉改善肝臟損傷后，血糖水平明顯得到恢復，且胰腺組織切片形態也有明顯的改善。然而肥胖大鼠胰島素并沒有明顯變化，這可能與胰島負擔加重以保持胰島素水平有關，然而這也表明牛蒡根主要是通過減輕肝臟損傷來調節肝源性血糖異常，并且胰島素抵抗現象在實驗周期內也沒有出現，這可能與高糖高脂飲食造模的肥胖大鼠胰島素相關信號分子傳遞沒有受到干擾有關[24]。

根據實驗結果發現牛蒡根粉可以抑制大鼠的攝食，如圖2b 所示，這表明牛蒡根粉可能具有抑制食欲的作用。抑制食欲也將是未來重要的研究方向，食欲增強是引起單純性肥胖的重要因素[25]，牛蒡根可能通過抑制食欲改善肥胖，食欲與中樞息息相關[26]，這表明牛蒡根可能對中樞神經系統有一定的調節作用?？偠灾?，本研究發現牛蒡根在高糖高脂飲食誘導的肥胖大鼠肝臟損傷以及對肝源性血糖異常方面具有良好的改善作用。牛蒡根粉灌胃可抑制單純性肥胖大鼠體質量增加以及血脂水平異常，改善肝臟脂肪變性，減輕肝臟損傷，并有效調節肝源性血糖異常。這些發現意味著牛蒡根粉具有抑制肥胖、護肝、降脂并調節肝源性血糖水平的作用，為牛蒡根開發針對減肥、護肝、降糖的功能性食品提供了方向，也為挖掘牛蒡根中潛在的具有防治慢性脂質代謝疾病功能的活性物質提供了理論依據。