枯草芽孢桿菌發酵對豆類中酚類物質及抗氧化活性的影響

唐雙慶，魯慧琪，李秀麗，邱怡君，王 敏，徐 媛，王紅波，2*

（1 江漢大學生命科學學院 食品營養與安全研究中心 武漢430056 2 湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術研究中心 武漢 430056）

豆類不僅含有碳水化合物和蛋白質等營養成分，還含有多酚、多肽和低聚糖等生物活性成分[1]。植物多酚是廣泛存在于植物體內的次生代謝物，主要存在于植物的果、皮、根、葉等組織器官中，具有抗氧化、抗糖尿病、降低膽固醇、護肝以及抗心腦血管疾病等功效，植物多酚已引起食品研究領域的廣泛關注[2-5]。發酵豆制品是我國居民喜食的傳統豆類食品，微生物發酵可提高豆類的營養特征和生物活性功能[6]。目前，枯草芽孢桿菌、乳酸菌和少量真菌等微生物菌種可應用于豆類發酵[7]?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）常用于食品和動物飼料產品的加工?？莶菅挎邨U菌所產納豆激酶在體內、外均具有溶栓活性，且對機體無毒性，經枯草芽孢桿菌發酵的豆類食品營養價值和生物活性能得到顯著改善[8]。Sanjukt 等[9]研究表明枯草芽孢桿菌發酵大豆和黑豆，其總酚含量分別從1.93 mg GAE/g 和1.64 mg GAE/g 增至7.9～8.4 mg GAE/g和6.9～7.5 mg GAE/g，且大豆的DPPH 自由基清除率從1.3 mg AAE/g 增至29.9 mg AAE/g。Limón等[10]研究發現菜豆經枯草芽孢桿菌發酵后，可溶性酚類含量在48 h 和96 h 分別提升96%和126%，且氧自由基清除能力從170 mg TE/g 最高增至540 mg TE/g。自由基的氧化應激對生物細胞具有毒害作用，抗氧化活性物質有利于清除氧化自由基，酚類物質含量與抗氧化能力顯著相關[11]。國內外現有研究報道多集中在微生物發酵對1～5種常見豆類酚類含量及抗氧化活性的比較研究，而研究豆類種類偏少，且不同酚類物質含量變化研究也不充分。本研究評價枯草芽孢桿菌ATCC 6051 發酵對綠豆、蠶豆、豇豆、紅豆、菜豆、豌豆、大豆以及扁豆總酚含量，19 種多酚類物質組成和抗氧化活性的影響，為中國傳統發酵豆類食品的開發和推廣提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8 種豆類（綠豆、蠶豆、豇豆、紅豆、菜豆、豌豆、大豆、扁豆），湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術研究中心。菌種枯草芽孢桿菌ATCC 6051 保藏于江漢大學食品營養與安全研究中心。

6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、蘆丁、2，4，6-三（2-吡啶基）-1，3，5-三 嗪（2，4，6-Tri（2-pyridyl）-1，3，5-triazine，TPTZ），北京索萊寶公司；氫化肉桂酸等19 種標準品，美國Sigma 公司；2，2’-聯氮雙-（3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸）二胺鹽（2，2’-Azinobis（3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），麥克林公司；LB（Luria-Bertani）肉湯培養基，海博生物技術有限公司；沒食子酸等分析純級試劑均購于國藥集團。

1.2 儀器與設備

YRE-201D 旋轉蒸發器（配有SHZ-DⅢ循環水式真空泵），予華儀器有限責任公司；SPX-150B-Z 型生化培養箱，上海博訊實業有限公司；Freezone 6 Plus 冷凍干燥機，LABCONCO；Vanquish 超高液相色譜-質譜聯用（配電噴霧離子源以及TraceFinder 數據處理系統）、Multiskan Go 1510 全波長酶標儀，Thermo 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化 制備LB 肉湯和固體培養基，于121 ℃條件下滅菌15 min。將凍藏于-80 ℃條件下的Bacillus subtilis ATCC 6051 菌種接種劃線，于37 ℃下培養24 h 后，挑取單菌落進行振蕩培養，得到種子液。

1.3.2 發酵處理 參考Li 等[12]和Saharan 等[13]的發酵方法。將8 種豆類分別磨成粉末狀，每種豆粉稱取10 g，置入潔凈發酵瓶，轉移至滅菌鍋，滅菌條件為121 ℃/15 min，冷卻后，按照5%體積分數接入種子液，發酵溫度設置為37 ℃，發酵時間設置為7 d。發酵結束后，將樣品置于-80 ℃冰箱冷凍干燥12 h，于-20 ℃儲存待測。

1.3.3 酚類物質提取 參考王何柱等[14]酚類物質提取方法。稱取1 g 凍干樣品于試管中，加入80%丙酮溶液20 mL，劇烈振蕩10 min，取上清液通過0.22 μm 濾膜過濾，重復此操作2 次。收集濾液蒸干至10 mL，加入蒸餾水定容至25 mL，置于-20℃下冷藏待分析。

1.3.4 總酚含量測定 參考Hung 等[15]總酚含量測定方法。配制不同濃度沒食子酸標準溶液。取0.5 mL 標準溶液或樣品溶液，加入0.5 mL 福林酚試劑，搖勻，靜置30 s，加入3 mL 10 g/100 mL Na2CO3溶液，蒸餾水定容至5.0 mL，黑暗條件下反應30 min。在波長760 nm 處測定吸光度值，繪制標準曲線。結果用毫克沒食子酸當量每克干重豆粉表示（mg GAE/g dw）。

1.3.5 酚類物質組成分析 利用超高液相色譜-質譜聯用（外標法定量）測定酚類組成。色譜條件和質譜條件參考文獻[16]～[18]的方法。色譜條件：色譜柱：Waters HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：A 相為超純水，B 相為乙腈（A、B 相均含有0.1%乙酸）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40℃；進樣量：2 μL；流動相洗脫梯度程序如下：0.0 min 水∶乙腈（90∶10，V/V）；2.0 min 水∶乙腈（90∶10，V/V）；6.0 min 水∶乙腈（40∶60，V/V）；8.0 min 水∶乙腈（40∶60，V/V）；8.1 min 水∶乙腈（90∶10，V/V）；12.0 min 水∶乙腈（90∶10，V/V）。質譜條件：采用電噴霧離子源，鞘氣：40 arb；輔助氣：10 arb；離子噴霧電壓：-2 800 V；溫度：350 ℃；離子傳輸管溫度：320 ℃。掃描模式：單離子檢測模式；掃描方式：負離子。樣品酚類物質含量對照標準品濃度計算得出。

1.3.6 抗氧化活性測定

1.3.6.1 DPPH 清除活性測定 參考白周亞等[19]DPPH 自由基清除活性測定方法。配制DPPH 溶液和Trolox 系列標準溶液。按照以下方式添加A0、A1和A2待測液進行測定：A0為1 mL DPPH 中加入1 mL 蒸餾水，A1為1 mL 標準液或樣品溶液中加入1 mL 無水乙醇，A2為1 mL 標準液或樣品溶液中加入1 mL DPPH 溶液，搖勻，于黑暗條件下靜置30 min，于波長517 nm 處分別測定A0、A1和A2吸光度值。豆類提取物DPPH 自由基清除活性以清除率表示。DPPH 清除率按公式（1）計算：

1.3.6.2 ABTS+清除活性測定 參考Moghadam等[20]ABTS+自由基清除活性測定方法。提前制備ABTS+清除活性測定工作液，配制不同濃度的Trolox 標準溶液，調整ABTS+工作液吸光度至0.700±0.001。按照以下方式添加Ai和A0待測液進行測定：Ai為100 μL 標準溶液或樣品溶液中加入1 mL ABTS 稀釋液，A0為100 μL 甲醇中加入1 mL ABTS 稀釋液，于黑暗條件下靜置10 min，于波長734 nm 處分別測定Ai和A0吸光度值，繪制標準曲線。豆類提取物ABTS+自由基清除活性以每克干重豆粉所含Trolox 當量的微摩爾數表示（μmol TE/g dw）。ABTS+清除率按公式（2）計算：

1.3.6.3 鐵離子還原能力測定 參考唐雙慶等[21]鐵離子還原能力測定方法。提前制備FRAP 工作液，使用前預熱至37 ℃。配制不同濃度FeSO4·7H2O 標準溶液。分別取100 μL 標準液或樣品溶液，加入1.8 mL FRAP 工作液，混勻，37 ℃水浴反應10 min，于波長593 nm 處測定吸光度值，繪制標準曲線。豆類提取物鐵離子還原能力以每克干重豆粉所含硫酸亞鐵當量的微摩爾數表示（μmol FE/g dw）。

1.3.7 數據分析 試驗均設置3 組重復，結果按照“平均值±標準差”表示。采用SPSS 26 分析數據的顯著性和相關性，Origin Pro 2021 繪圖。

2 結果與分析

2.1 豆類總酚含量變化

圖1 為發酵前、后8 種豆類總酚含量變化。發酵前扁豆、豌豆、綠豆、大豆、蠶豆、菜豆、紅豆和豇豆總酚含量依次為（1.16±0.05），（1.39±0.17），（1.55±0.06），（1.58±0.11），（1.85±0.13），（2.85±0.13），（4.63±0.30），（5.56±0.59）mg GAE/g dw，豇豆和紅豆總酚含量較高，豌豆和扁豆總酚含量較低。發酵綠豆、豇豆、紅豆、菜豆、蠶豆、豌豆、大豆和扁豆總酚含量分別達到（4.23±0.54），（3.86±0.24），（5.75±0.58），（4.50±0.15），（4.14±0.19），（6.16±0.55），（5.14±0.06），（4.64±0.55）mg GAE/g dw。發酵豇豆總酚含量下降了30.58%，可能由于枯草芽孢桿菌在發酵過程中多酚氧化酶活力較高，導致酚類化合物被氧化分解，豇豆總酚含量降低[22]。發酵紅豆、菜豆、蠶豆、綠豆、大豆、扁豆和豌豆總酚含量分別增加24.19%，57.89%，123.78%，172.90%，225.32%，300.00%和343.17%。發酵豆類總酚含量增加與枯草芽孢桿菌發酵過程產生β-葡萄糖苷酶有關，這種酶可以水解以共軛形式存在的酚苷的β-葡萄糖苷鍵，使之成為相應的酚苷元，從而增加游離總酚含量[23]。Jhan 等[24]研究也發現發酵紅豆總酚含量從（2.59±0.01）mg GAE/g 增加至（3.63±0.03）mg GAE/g。Ali 等[25]研究發現發酵綠豆、大豆和蠶豆總酚含量增加。

圖1 8 種豆類發酵前、后總酚含量變化Fig.1 Changes in the total phenol content of 8 kinds of beans before and after fermentation

2.2 豆類酚類物質組成分析

圖2 為19 種酚類物質標準品離子流色譜圖。表1 為發酵前、后8 種豆類19 種酚類化合物含量。發酵豇豆、蠶豆、綠豆、豌豆、菜豆、紅豆、大豆和扁豆游離苯丙氨酸含量分別增加了706.92%，806.94%，878.97%，1041.82%，1489.77%，1645.47%，1 910.11%和4 077.23%，發酵大豆具有最高的苯丙氨酸含量，達到（174.88±9.09）μg/g。苯丙氨酸是一種人體必需氨基酸，發酵過程中微生物分泌水解蛋白酶是游離苯丙氨酸含量提高的原因[26]。3，4-二羥基苯甲酸、苯甲酸和對香豆酸是常見的防腐劑[27]，發酵后8 種豆類3，4-二羥基苯甲酸和苯甲酸含量上升，對香豆酸含量下降，發酵紅豆3，4-二羥基苯甲酸含量最高達到（14.96±0.78）μg/g，發酵大豆苯甲酸含量最高達到（5.19±0.82）μg/g。3，4-二羥基苯甲醛、丁香醛和香草醛3 類醛類化合物在微生物發酵過程中，易被氧化生成相應的酸類化合物，發酵后均未被檢出。兒茶素、表兒茶素、水楊酸和芥子酸是8 種豆類中具有抗氧化功能的酚酸[28-29]。發酵能影響豆類中兒茶素、表兒茶素、水楊酸和芥子酸的含量。發酵紅豆和豇豆中兒茶素、表兒茶素含量增加，分別達到（21.64±2.77）μg/g 和（13 .90 ±1 .48）μg/ g，（5 .00 ±0 .28）μg/ g 和（2 .38±0.37）μg/g。發酵紅豆的水楊酸含量上升，達到（1.15±0.19）μg/g；而菜豆芥子酸含量下降了87.80%。

表1 8種豆類發酵前、后酚類化合物組成Table 1 Phenolic composition of 8 kinds of beans before and after fermentation

圖2 19 種酚類化合物標準品離子流色譜圖Fig.2 Ion chromatography of 19 phenolic compound standards

2.3 豆類提取物抗氧化活性變化

2.3.1 豆類提取物DPPH 清除活性圖3a 為發酵前、后8 種豆類提取物DPPH 清除活性變化。發酵前紅豆、豇豆和菜豆提取物DPPH 清除活性較高，分別達到95.10% ± 0.24%，95.37% ± 0.40%和81.82%± 2.40%。發酵后豇豆和菜豆DPPH 自由基清除活性分別下降了20.48%和39.86%?？寡趸钚耘c總酚含量顯著相關，豇豆總酚含量下降，導致DPPH 自由基清除活性下降[30]。豆類抗氧化活性組分主要有酚類化合物和類胡蘿卜素等，菜豆提取物DPPH 自由基清除活性下降，可能與發酵過程中具有抗氧化活性成分含量下降的原因有關[31]。發酵后綠豆、豌豆、蠶豆、扁豆和大豆提取物DPPH 自由基清除活性均有提高，其中豌豆和大豆提高最多，分別增加了118.00%和106.94%。Li 等[12]研究發現干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）發酵大豆48 h 后大豆提取物DPPH 自由基清除活性增加至61.10%。Jeon 等[32]利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）P229發酵大豆，也獲得了較高的DPPH自由基清除率。

圖3 8 種豆類發酵前、后抗氧化活性變化Fig.3 Changes in antioxidant activity of 8 kinds of beans before and after fermentation

2.3.2 豆類提取物ABTS+清除活性圖3b 為發酵前、后8 種豆類提取物ABTS+清除活性變化。發酵前蠶豆、紅豆和豇豆提取物ABTS+自由基清除活性較高，分別達到（36.18±1.70），（40.29±1.93），（47.86±1.93）μmol TE/g dw。發酵后豇豆和蠶豆提取物ABTS+自由基清除活性分別下降了54.91%和60.59%。豇豆提取物ABTS+自由基清除活性與發酵后其總酚含量下降相關。研究發現少孢根霉發酵也會導致蠶豆提取物ABTS+清除活性下降[33]。發酵后綠豆、大豆、扁豆和豌豆提取物的ABTS+清除活性上升，分別提高了241.34%，176.29%，244.95%和570.60%，其中豌豆ABTS+清除活性上升最高。Yu 等[34]研究發現利用蛹蟲草（Cordyceps militaris）SN-18 發酵綠豆，其ABTS+清除活性提升了2.1 倍。

2.3.3 豆類提取物鐵離子還原能力 圖3c 為發酵前、后8 種豆類提取物鐵離子還原能力變化。發酵前紅豆和豇豆提取物鐵離子還原能力較高，分別達到（47.60±0.72），（59.49±0.97）μmol FE/g dw。發酵后綠豆、扁豆、豌豆和大豆提取物鐵離子還原能力分別提高了69.07%，188.63%，279.87%和297.12%。發酵后豇豆、紅豆和菜豆提取物鐵離子還原能力下降，其中豇豆最多下降了61.35%。Muhialdin 等[35]研究發現發酵苦豆提取物鐵離子還原能力下降了6.75%。

利用3 種不同抗氧化活力評價方法比較分析8 種豆類發酵前、后抗氧化功能變化。研究結果表明：大豆、綠豆、豌豆和扁豆適宜于利用枯草芽孢桿菌發酵制備高抗氧化活力的豆類食品。

2.4 不同豆類總酚含量及酚類組成與抗氧化活性的相關性分析

由表2 可知，總酚含量與DPPH 自由基清除活性、ABTS+清除活性和鐵離子還原能力均極顯著相關（P＜0.01）。劉婷婷等[36]對不同雜豆總酚和抗氧化活性的研究表明，總酚與總抗氧化之間呈極顯著正相關。本研究發現兒茶素、水楊酸和反式肉桂酸與DPPH、FRAP 呈極顯著正相關，芥子酸與DPPH 呈極顯著正相關（P＜0.01）；表兒茶素與DPPH 呈顯著正相關，水楊酸與ABTS 呈顯著正相關，3，4-二羥基苯甲酸和氫化肉桂酸與DPPH、FRAP 呈顯著正相關（P＜0.05）。多酚化合物清除自由基抗氧化活性主要通過順序質子損失電子轉移、氫原子轉移和單電子轉移等機制實現[37]。兒茶素和水楊酸等酚類化合物可以通過給出氫離子與自由基結合或直接給出電子將自由基轉化為反應活性低的陰離子，還可以先給出質子轉化為陰離子，再由陰離子給出電子將自由基轉化為陰離子去清除自由基[38-39]。苯丙氨酸、香草酸、香草醛、沒食子酸、丁香酸、丁香醛、咖啡酸、4-羥基苯甲酸、對香豆酸、反式阿魏酸和苯甲酸與抗氧化相關性較低。王何柱等[40]對不同花色蕓豆的酚類化合物與抗氧化進行相關性分析，發現沒食子酸、咖啡酸、4-羥基苯甲酸、對香豆酸和阿魏酸也與抗氧化的相關性較低。

表2 總酚、酚類組成與抗氧化活性的相關性Table 2 Correlation between total phenols，phenolic composition and antioxidant activity

3 結論

本試驗利用枯草芽孢桿菌ATCC 6051 發酵綠豆和紅豆等在內的8 種常見豆類。發酵后綠豆、紅豆、蠶豆、菜豆、大豆、豌豆和扁豆7 種豆類多酚含量增加，其中發酵豌豆總酚含量提高了343.17%，達到（6.16±0.55）mg GAE/g dw。發酵后8 種豆類游離苯丙氨酸、3，4-二羥基苯甲酸和苯甲酸含量增加。發酵綠豆、豌豆、蠶豆、扁豆和大豆提取物DPPH 自由基清除率上升，其中豌豆上升最多。發酵綠豆、大豆、豌豆和扁豆提取物ABTS+清除活性增加，其中豌豆增加最多為570.60%。發酵綠豆、扁豆、豌豆和大豆提取物鐵離子還原能力提高，其中大豆增加最多為297.12%?？偡雍颗c3 個抗氧化指標均極顯著相關（P＜0.01）。大豆、綠豆、豌豆和扁豆是利用枯草芽孢桿菌發酵制備高抗氧化活力食品的理想豆類食品原料。