桑葉水提物對高糖環境下前成骨細胞成骨分化的作用研究

張文杰 吳澤鈺 夏雨凝 趙 今

糖尿病是全球增長最快的疾病之一，預計到2045 年將影響6.93 億成年人，目前已成為全球廣泛關注的慢性代謝疾病之一[1]。牙周?。╬eriodontal diseases，PD）是由多種復雜因素(遺傳、環境和細菌感染等)共同作用導致的感染性疾病，能夠造成牙周組織的破壞，最終導致牙齒脫落[2]。流行病學研究證實牙周炎是糖尿病的第六大并發癥，且糖尿病患者患牙周炎的風險是非糖尿病患者的三倍[3]糖尿病患者伴發牙周炎在國際上已經被公認為是一種特殊類型的牙周疾病,稱為糖尿病牙周炎[4]，目前臨床上常采用全身給藥的方式治療糖尿病，其不僅毒副作用較強，且無法同時改善罹患牙周炎患者的牙周狀況。近年來，中醫藥用于輔助治療牙周炎獲得了很好的療效，并且很多中藥在抗炎的同時還具有降血糖的作用，國內外已有較多學者將傳統中藥用于DP進行了相關研究。研究證實，桑葉富含多種活性成分，如多糖、黃酮類和維生素等，具有抗炎、降糖和促進骨組織形成的潛在作用[5]。然而，對于桑葉水提物在高糖環境下對成骨分化的影響，目前的了解還十分有限。因此，本研究旨在評估桑葉水提物在高糖環境下對MC3T3-E1 細胞成骨分化的影響，可以進一步為桑葉水提物用于治療DP 提供一定的理論依據。

材料和方法

1.材料

（1）細胞株小鼠成骨前體細胞株（MC3T3-E1）（貨號：CL-0387），購自武漢普諾賽生物生命科技有限公司。

（2）藥物桑葉水提物粉末，購自中國上海源葉，貨號：S28490 純度：≥98%。

（3）主要試劑α-MEM 培養基（Gibco，美國）；0.25%胰蛋白酶、地塞米松、胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗（BI，印度）；細胞增殖毒性檢測試劑盒CCK-8（Dojindo，日本）；成骨細胞礦化結節染色試劑盒（貨號：C0148）、BCIP/NBT 堿性磷酸酶染色試劑盒(貨號：C3206)、堿性磷酸酶檢測試劑盒（貨號：P0321）購于碧云天生物科技有限公司（中國）；4%多聚甲醛（Biosharp 生物，中國）；Trizol（invitrogen，美國）；,酶聯免疫吸附ELISA 試劑盒（睿信生物，中國），碧云天凋亡試劑盒（貨號：c1062L），碧云天ROS 檢測試劑盒（貨號：S033M）；TB Green Premix ExTaqTMII、PrimeScriptTM RTreagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）購買于Takara 生物技術有限公司（Takara Biomedical Technology Co,Ltd，日本）。

（4）主要實驗儀器超凈工作臺（蘇凈安泰，中國）、細胞培養箱（Thermo，美國）、熒光倒置顯微鏡（Leica，德國）、全波長酶標儀（Thermo，美國）、實時熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems 7500 Fast，美國）。

2.方法

（1）細胞培養：將課題組凍存的MC3T3-E1 細胞放入37℃恒溫水浴箱復蘇，加入含血清的培養基于培養瓶中培養，當細胞密度大于80%時，可按1:3 的比例傳代培養，隔天換液，將其傳代培養至P4 時開始用于后續各實驗。

（2）藥物的配置：①不同濃度高糖培養基的配置：稱取4.504 g 葡萄糖，充分溶解于50 mL 的α-MEM 完全培養基中，于超凈臺中用0.22 nm 的濾器過濾，得到500 mM 的母液，將其分裝于15 mL 離心管中置于4℃冰箱保存備用。實驗過程中將其稀釋為：10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、60 mM、70 mM、100 mM 的工作液。②不同濃度桑葉水提物的配置：將10 mg 桑葉提取物粉末溶于1 mL 的含50 mM葡萄糖的α-MEM 培養基中充分混勻，在超凈臺中用0.22 nm 的濾器過濾，得到10 mg/mL 的桑葉水提物母液，將其分裝于1.5 mL 的無菌EP 管中，-20℃冰箱儲存。實驗過程中將藥物分別稀釋為：10 mg/mL、1 mg/mL、100 μg/mL、10 μg/mL、1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL的工作液。

（3）CCK-8 檢測高糖濃度及桑葉水提物濃度對MC3T3-E1 細胞的增殖影響：①CCK-8 篩選適宜高糖濃度：將長至80%～90%的P4 代MC3T3-E1 細胞用胰酶消化后將細胞調整為2×104個/mL 的密度接種于96 孔板，每孔100 μL。待細胞貼壁后，棄原培養基，分別加入含5 mM、10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、60 mM、70 mM、100 mM 葡萄糖的完全培養基中，培養1 d、3 d、5d、7 d 后棄原培養基，加入100 μLα-MEM 培養基及10 μL CCK8 溶液，放入37 ℃培養箱中避光孵育2 h 。用酶標儀在450 nm波長時測定吸光度。②篩選出適宜藥物濃度：步驟同上，不同之處在于細胞貼壁后分別加入含10 mg/mL、1 mg/mL、100 μg/mL、10 μg/mL、1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL桑葉水提取物的培養基。

（4）實驗分組：不含葡萄糖的對照組（control組）；含50 mM 葡萄糖的高糖組（HG 組）；50 mM 葡萄糖+含不同濃度桑葉水提取物（1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL）的實驗組（HSY組）。

（5）細胞凋亡：取對數期生長的MC3T3-E1 細胞以4.0×105個細胞/皿的密度接種到6 cm 培養皿中，每孔4 mL，貼壁后按分組干預72 h，按說明書操作，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光，室溫孵育10 min；再加入5 μL PI 染料，混勻避光，室溫孵育5 min。補加200 μL的1×Binding Buffer，用流式細胞儀進行檢測。

（6）MC3T3-E1 的ROS 檢測：按上述方法進行鋪板及干預，于72 h 后將ROS 熒光探針按1:1000 的比例加入基礎培養基中，避光保存。取出培養皿，胰酶消化后轉移至離心管中離心（1000 rpm，5 min）。棄原培養基加入無酚紅的α-MEM 培養基重懸后繼續離心。棄培養基后加入1 mL ROS 熒光探針溶液，放置于37℃恒溫箱中避光孵育30 min，棄液，使用不含酚紅的α-MEM 重復上述清洗步驟3遍，過篩后轉移至流式管中，短時間內使用流式細胞儀進行檢測。

（7）不同濃度桑葉水提物在高糖環境下對細胞炎癥因子表達的影響：將細胞接種于12 孔板，待細胞貼壁后按分組加入藥物進行干預72 h，取1 mL 培養液離心（4000 rpm，20 min），取上清轉移至新的EP管中，-20℃保存。按相關說明書操作。

（8）堿性磷酸酶染色：細胞傳代培養至P4 代后調整細胞濃度為3×104個/孔的密度接種于12 孔板，待細胞長至80%左右，更換為含不同濃度的桑葉水提取物的高糖培養基,2 天/次進行換液，誘導7 d、14 d 后棄原培養基加入PBS 清洗3 遍，加入1 mL 組織細胞固定液固定30 min，棄液后，PBS清洗3次，加入800 μL 現配的堿性磷酸酶孵育液放入37℃烘箱中避光孵育15 min，棄液后PBS 清洗，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

（9）堿性磷酸酶活性：步驟同上，棄液后加入預冷的PBS 清洗，每孔加入60 μL 無抑制劑細胞裂解液，裂解至1.5 mL 的無菌EP 管中，5 min/次渦旋，12000 r/min，4℃條件下離心15 min，取上清于新的EP 管中作為待測樣本保存于-80℃備用。BCA 法測得待測樣本蛋白濃度；按照堿性磷酸酶試劑盒說明書于96 孔板中操作：設置空白孔、標準孔、待測孔，依次加入標準液、緩沖液、基質液，充分混勻，37 ℃水浴15 min 后加入顯色劑終止反應，用酶標儀在520 nm 波長處測定各孔吸光度OD 值。計算金氏單位（U/mg）用以反映ALP 活性。細胞中ALP活力=測OD 值-空白OD 值/標準OD 值-空白OD 值×標準品濃度（0.1 mg/mL）÷待測樣本蛋白濃度。

（10）茜素紅染色：將P4 代細胞以3×104個/孔的密度接種于3.5 cm的小皿中，待細胞長至80%左右，棄原培養基，加入含不同濃度的桑葉水提物的高糖成骨培養基，隔天換液，分別于14 d、21 d 時終止培養。PBS 清洗小皿，組織細胞固定液室溫下固定30 min后棄固定液，純水清洗小皿，棄液后加1 mL茜素紅染液室溫下染色30 min，棄染液用純水清洗小皿，清亮為止。顯微鏡下觀察礦化結節并拍照記錄。

（11）茜素紅定量：配置氯化十六烷基吡啶溶液（每克加入10 mL 水至其完全溶解），上述小皿拍照完成后棄純水，每皿加入1 mL 氯化十六烷基吡啶溶液放置于水平搖床溶解30 min，吹打混勻，將其轉移至96 孔板中每孔100 μL，于562 nm 的波長下檢測其OD值。

（12）RT-PCR 檢測基因表達：將傳代培養至P4代的細胞在含藥的成骨誘導液中培養3 d、7 d，每組設3 個平行孔。利用Trizol 法提取總RNA，定量后進行反轉錄。RT-PCR 反應條件：①預變性95 ℃2 min；②變性95 ℃5 s；③退火58 ℃30 s，共40個循環；④延伸72 ℃，5 min。檢測相關mRNA 的表達，以GAPDH為內參。采用2-ΔΔCT法進行相對定量分析。

3.統計學方法

用SPSS26.0 及Graphpad 統計軟件處理實驗數據，計量資料以均數±標準差表示，對各組數據進行正態及方差齊性檢測，若數據滿足正態分布及方差齊性，則采用單因素方差分析進行數據分析，組間比較采取Dunnett-t檢驗，若方差不齊則采用秩和檢驗。以P＜0.05，α=0.05表示差異有統計學意義。

結果

1.CCK-8篩選出高糖濃度及桑葉水提物濃度

如圖1 所示，低濃度葡萄糖對細胞的增殖影響不大，甚至還能促進細胞的增殖；但隨著葡萄糖濃度的升高，細胞的增殖開始下降。經統計學分析，當葡萄糖濃度在0～30 mM 時，短時間內其細胞增殖甚至大于control 組（P＜0.05）,當糖濃度在50～100 mM 時細胞增殖能力受到抑制（P＜0.05），結果與歐等[6]結果一致，故選用50 mM的葡萄糖濃度用于后續實驗。

圖1 不同濃度的葡萄糖對MC3T3-E1細胞增殖能力的影響

如圖2 所示，將含有50 mM 葡萄糖的α-MEM 培養基培養MC3T3 細胞，并加入不同濃度的桑葉水提物分別干預1 d、3 d、5 d、7 d。隨著干預時間的延長，細胞的OD值與對照組相比在10 mg/mL～1 μg/mL范圍內不斷升高，差異具有統計學意義（P＜0.05），當桑葉水提物在1～100 μg/mL 時，與對照組相比其細胞增殖活性促進更明顯且穩定，故選用1～100 μg/mL作為有效藥物濃度用于后續實驗。

圖2 不同濃度桑葉水提物在高糖環境下對MC3T3-E1細胞增殖能力的影響

2.桑葉水提物在高糖環境下對MC3T3-E1 細胞凋亡的影響

流式細胞術顯示桑葉水提物在高糖刺激下的MC3T3-E1 細胞的細胞凋亡具有影響（圖3）。第一象限是由晚期凋亡細胞組成。第二象限是指PI 陰性的細胞，第三象限是指未被染色的正?；罴毎?。第四象限是指早期凋亡細胞。對照組和高糖組的早期凋亡率分別為(15.00±0.94)%和(30.90 ±0.19)%。桑葉水提物組分別為(14.15±1.96)%、(16.65±1.53)%和(19.35±1.96)%.高糖組于對照組相比顯著促進了細胞的凋亡（P＜0.05），在高糖環境下加入桑葉水提取物后均可在一定程度上降低細胞的凋亡率（P＜0.05），尤其是高濃度的桑葉水提取物?？梢缘贸鼋Y論，桑葉水提取物可顯著保護細胞免受高糖刺激引起的凋亡。

圖3 不同濃度桑葉水提物在高糖環境下對MC3T3-E1細胞凋亡的影響

3.不同濃度的桑葉水提物對高糖環境下的MC3T3-E1細胞內ROS的表達

如圖4 所示，對照組和高糖組的細胞內活性氧水平分別為(50.75±0.02)%和(81.55±0.78)%.桑葉水提物分別為(20.15±5.07)%、(33.9±10.65)%和(40.15±11.24)%。流式結果表明與正常組相比在高糖狀態下的MC3T3-E1 細胞會產生更多的ROS（P＜0.05）。實驗組與高糖組相比，均可以在一定程度上緩解因高糖刺激引起的細胞內ROS 水平升高，尤其是100 μg/mL 的桑葉水提物濃度。且其ROS水平較正常組更低，完全逆轉了因高糖刺激引起的氧化應激損傷。

圖4 不同濃度桑葉水提物在高糖環境下對MC3T3-E1細胞內ROS的表達

4.不同濃度的桑葉水提物對高糖環境下的MC3T3-E1細胞炎癥因子表達的影響

通過ELISA 檢測上清液中相關炎癥因子的表達水平（見圖5），與對照組（control）相比，高糖組（HG）上清液中晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）、白細胞介素-1（interleukin 1，IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）的表達量明顯升高。加入不同濃度的桑葉水提物干預后，與HG組相比，均能在一定程度上抑制相關因子的表達（P＜0.05），尤其是高濃度的桑葉水提物（P＜0.01）。

圖5 不同濃度桑葉水提物在高糖環境下對MC3T3-E1細胞內炎癥因子的表達

5.桑葉水提物對MC3T3-E1 細胞ALP 活性的影響

ALP 是成骨分化的早期標志物之一，與對照組相比如圖6 所示，桑葉水提物的ALP 活性在用藥物干預培養7 d、14 d 后，高糖組ALP 活性與對照組相比顯著降低。與高糖組相比1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL 桑葉水提取物干預的實驗組ALP 表達能力隨著劑量的升高逐漸升高（P＜0.05），藥物組均可以緩解高糖刺激引起的ALP 活性降低，且存在以劑量依賴的方式增加ALP活性的表達能力。

6.桑葉水提物對MC3T3-E1 細胞礦化結節的影響

成骨細胞在細胞增殖分化過程中會產生細胞外鈣化物沉積，將MC3T3-E1細胞成骨誘導14 d、21 d，如圖7 所示，在與14 d、21 d 茜素紅染色的結果圖中均可看出與對照組相比HG 組的鈣化能力顯著下降，藥物組可有效促進高糖環境下成骨細胞的分化且存在劑量依賴。尤其在100 μg/mL 時可以逆轉高糖對成骨細胞分化的影響。

圖7 不同濃度的桑葉水提物在高糖環境下對MC3T3-E1細胞A細胞礦化能力的表達

7.桑葉水提物對成骨細胞凋亡調節因子（apoptosis regulator Bcl-2，Bcl-2）、凋亡調節因子Bax(apoptosis regulator Bax,Bax)mRNA表達的影響

與對照組相比，HG 組Bax 表達明顯降低（P＜0.05），且Bcl-2 表達明顯增多（P＜0.05）。加入桑葉水提取物后，與HG 組相比，隨著桑葉水提物濃度增高，Bax 的表達呈遞減趨勢，且Bcl-2 蛋白表達明顯增多，差異具有統計學意義，3 d與7 d的結果基本一致（圖8）。

圖8 不同濃度桑葉水提物在高糖環境下對MC3T3-E1細胞凋亡相關基因mRNA的表達

8.桑葉水提物對成骨細胞IL-1β、IL-6、TNFαmRNA表達的影響

與ELISA 結果基本一致，與對照組相比，HG 組炎癥相關的mRNA表達明顯降低。加入桑葉水提取物后，與HG 組相比，隨著桑葉水提物濃度增高，mRNA的表達呈遞減趨勢（圖9）。

圖9 不同濃度桑葉水提物在高糖環境下對MC3T3-E1細胞內炎癥相關基因

9.桑葉水提物對成骨細胞成骨相關mRNA 表達的影響

在高糖環境下MC3T3-E1 細胞的runt 相關基因2（runt-related transcription factor2, Runx2）、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)、成骨細胞特異性轉錄因子(osterix,OSX)、Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Type,Col-1)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor，IGF-1）的mRNA 的表達顯著降低，且差異具有統計學意義(P＜0.05)。與高糖組相比，藥物干預后的細胞中mRNA 的表達呈劑量依賴性增加（圖10、11）。

圖10 不同濃度桑葉水提物在高糖環境下對MC3T3-E1細胞內成骨相關基因mRNA的表達（3天）

圖11 不同濃度桑葉水提物在高糖環境下對MC3T3-E1細胞內成骨相關基因mRNA的表達（7天）

討論

長期的高血糖是導致患骨類疾病風險顯著增加的主要原因之一[6]。因此，本研究通過CCK8 法檢測MC3T3-E1 在高糖環境下第1、3、5、7 天的增殖情況，與劉等[7]的研究結果相似，從第3 天開始，50 mM的高糖環境均能夠顯著抑制MC3TC-E1的增殖。造成這個現象的原因可能是由于短時間內升高低濃度的葡萄糖為細胞提供了更加充足的養分反而促進了其增殖，而較高的糖濃度短時間內就對細胞產生了損傷。故本實驗采用50 mM的葡萄糖模擬體內高糖環境。

通過對天然藥物的研究發現，天然藥物可緩解因高糖刺激引起的成骨細胞分化能力減弱和氧化應激。而桑葉作為我國傳統中藥材，含有酚類、生物堿類、多糖類、氨基酸類等多種活性成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗炎和抗腫瘤等藥理作用[8]。本課題組前期研究發現，桑葉水提物可以在正常及炎癥環境中促進成骨細胞的增殖和分化。然而，目前關于桑葉水提物對高糖環境下前成骨細胞增殖和分化的研究較少。本研究通過CCK-8 法檢測高糖環境下MC3T3-E1 加入桑葉水提物后的增殖情況，最終選取了1～100 μg/mL 的桑葉水提物用于接下來的實驗，并觀察桑葉水提物在高糖環境下對前成骨細胞成骨分化的作用研究。

成骨細胞的增殖是骨形成的重要階段之一。目前關于桑葉水提物對高糖環境下前成骨細胞凋亡的研究較少。本研究發現，與對照組相比，高糖刺激可以引起前成骨細胞的凋亡率增加，加入桑葉水提物在一定濃度范圍內能緩解因高糖刺激而引起的細胞凋亡。100 μg/mL 的桑葉水提物在抑制因高糖刺激引起的凋亡最為明顯。Bax 是一種促凋亡蛋白基因，Bcl-2 是一種抗凋亡蛋白基因，在成骨細胞的凋亡過程中發揮著至關重要的作用[9]。本研究發現，在高糖環境下加入一定濃度的桑葉水提物后抗凋亡蛋白Bcl-2 表達增高，凋亡蛋白Bax 表達降低，Bcl-2/Bax 比值升高，且與桑葉水提物的濃度有一定的關系。因此，推測桑葉水提物在一定濃度范圍內可能通過調控Bax/Bcl-2來抑制前成骨細胞凋亡。

氧化應激是由高血糖狀態下介導胰島β 細胞損害的重要病因，被認為是糖尿病合并骨質疏松、牙周病、冠心病、動脈粥樣硬化等的共同發病機制[10,11]。氧化應激會造成ROS 大量產生，當體內ROS 超出了機體清除率時會導致細胞的有氧損傷，從而加劇體內的氧化應激反應[7,11]，清除ROS能夠有效促進細胞的成骨能力，高糖狀態產生過量ROS 會導致細胞內谷胱甘肽的水平下降，將抑制細胞的成骨分化[12,13]。糖尿病及牙周炎均會造成氧化應激升高，當牙周處于炎癥狀態時,機體內抗氧化水平的降低會進一步加劇糖尿病狀態下的氧化失衡狀態[14]。糖尿病伴隨牙周炎會加重局部和全身的氧化損傷，氧化應激的增加又會損害牙周組織[15]。而且ROS的過度產生與糖尿病的AGEs 密切相關，AGES 大量產生會導致IL-1β、TNF-α 和IL-6 等炎癥介質的分泌增多，會導致牙槽骨的快速喪失，繼而影響相關成骨指標的表達[16]。因此，氧化應激被認為可能是糖尿病牙周炎致病中的關鍵。本研究發現，與對照組相比高糖環境明顯促進了ROS 的產生和相關炎性因子的表達。加入桑葉水提物后，可在一定程度上能抑制ROS 的產生和相關炎癥因子的表達，表明桑葉水提物能夠緩解因高糖刺激引起的細胞氧化應激損傷。

高糖環境會產生大量ROS，進而導致牙槽骨的吸收和破壞，而牙槽骨主要通過成骨和破骨細胞的共同作用改建，包括骨生成和骨吸收[18]。因此本研究檢測了與骨形成和礦化相關成骨指標的表達情況。IGF-1 是細胞及組織代謝過程中的中間產物，參與葡萄糖穩態[19,20]，當其作用于成骨細胞，可誘導成骨細胞增殖、分化以及促進成骨礦化相關基因的表達[21,22]。ALP、Runx2、OCN、COL-1、Osterix 作為骨細胞的標志性轉錄因子，對骨的分化及改建方面有著至關重要的作用[23～25]。本研究通過堿性磷酸酶染色及活性以及檢測成骨相關基因的表達情況來探究高糖狀態下成骨細胞的成骨分化能力。結果發現與對照組相比，高糖組堿性磷酸酶活性及成骨相關mRNA 表達情況明顯降低，說明高糖環境可以抑制成骨細胞的分化能力，加入桑葉水提物后可能通過抵抗ROS 的產生從而逆轉高糖環境下成骨基因表達低的情況。

綜上，桑葉水提物能夠對高糖環境下MC3T3-E1 細胞發揮良好的抗炎及抗氧化能力，緩解甚至逆轉高糖環境引發的炎癥反應和細胞氧化應激進而促進高糖環境中細胞的增殖活性、成骨分化功能及基質礦化能力。該研究雖然闡述了桑葉水提物對高糖狀態下成骨細胞分化的影響，但體外高糖環境并不能完全模擬糖尿病在體內對骨損傷的致病機理，后期還需進一步完善相關體內實驗，為桑葉水提物用于糖尿病牙周炎的防治提供更多的參考依據。