球形賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sphaericus)對斑馬魚幼魚生長、腸道菌群及代謝的影響*

王涵穎 張心月 彭懷云 楊君燁 邱浩宇黃 玲 陶晨智 王 萍①

(1. 浙江海洋大學國家海洋設施養殖工程技術研究中心 浙江舟山 316022; 2. 浙江海洋大學海洋科學與技術學院 浙江舟山 316022)

目前, 我國水產養殖量逐年攀升, 養殖集約化日益嚴重, 導致養殖水體惡化、養殖動物病害增加、養殖生態系統失衡, 極大的限制了水產養殖的健康可持續發展(楊衛等, 2018)?？股匾蚱浯偕L且能預防、治療疾病而廣泛運用于水產養殖, 但長期使用抗生素會導致養殖動物易產生耐藥性、腸道微生物系統損傷、免疫力低下, 同時抗生素的殘留也會對環境造成一定影響(Chenetal, 2020)。傳統的抗生素療法已不能滿足綠色健康的養殖理念, 因此, 尋找綠色健康的添加劑勢在必行。

近年來, 益生菌在水產中的應用越來越廣泛, 使用方式也多種多樣, 比如添加到飼料或者養殖水體中。益生菌可調節宿主體內的生態環境、提高抗病力的同時對養殖水體起到改善作用(閆子豪等, 2022)。因其安全有效、環境友好等特點漸漸代替了副作用較多的抗生素。芽孢桿菌與其他益生菌的顯著區別在于其培養的最后階段會在細胞內形成厚壁芽孢, 也稱內生孢子, 具有耐高溫、高pH、高鹽、干燥和抗氧化等特點, 可保護芽孢桿菌免受不良環境的影響(張宇柔等, 2022)。芽孢桿菌作為飼料添加劑具有以下益處(Srisapoomeetal, 2017; Shietal, 2020): 1) 促進魚類生長與消化; 2) 抑制魚體內病原菌生長、增強免疫力; 3) 調節其腸道微生物區系; 4) 顯著改善代謝途徑。養殖水體或飼料中添加益生菌后對魚類的健康養殖具有重要的意義, 因此益生菌可作為綠色健康的添加劑之一, 為水產養殖提供新的可持續解決方案。

斑馬魚(Daniorerio)是一種熱帶淡水魚, 作為重要的模式脊椎動物之一, 斑馬魚模型具有以下顯著優點(Qinetal, 2017; 王之怡等, 2020): 1) 斑馬魚早期體色較透明, 易于觀察微生物在體內的定植情況;2) 與體外細胞培養模式相比, 斑馬魚有完整的生命特征與功能, 是真正意義上的模式生物; 3) 斑馬魚具有先天性免疫系統, 并在4 周齡時能夠發展適應性免疫; 4) 斑馬魚基因數據庫較為完善, 具有良好的研究基礎。近年來, 斑馬魚也被廣泛應用于益生菌在體功能的檢測。例如: 乳酸菌通過增強斑馬魚免疫應答從而提高其抗病能力(Qinetal, 2017); 益生菌浸浴斑馬魚幼魚促進其腸道蠕動, 改善其炎癥相關的黏膜損傷(Wangetal, 2020); 枯草芽孢桿菌浸浴斑馬魚后, 改變宿主腸道微生物群, 減少潛在致病菌的豐度(Castroet al, 2023)。因此, 本研究使用球形賴氨酸芽孢桿菌, 探討其對斑馬魚幼魚生長、腸道菌群及代謝的影響, 為其在魚類養殖中的應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 球形賴氨酸芽孢桿菌制劑的制備及添加方式

實驗用芽孢桿菌制劑是由本實驗室從大黃魚腸道分離獲得的球形賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillussphaericus)菌株。將保存在-80 °C 冰箱的菌株進行活化培養后, 挑取單菌落放入Luria-Bertani (LB)液體培養基中, 經37 °C、180 r/min 振蕩培養制得菌液。按照OD600值與細菌劑量的線性關系進行培養(吳振超, 2020), 確定濃度的菌液通過直接加入養殖水體的方式, 使養殖缸內終濃度分別達到105、107CFU/mL。菌液的添加量要與缸內水體的容量進行換算后加入。

1.2 實驗魚的養殖與管理

選取AB 品系斑馬魚中生長狀況良好、規格均勻的雌雄魚, 雌魚與雄魚按2∶1 交配產卵, 收取魚卵當天記為第0 天。培養至24 d 時, 挑取270 尾初體重為(0.019±0.003) g 的斑馬魚, 隨機均分為3 組, ZF0 組(對照組, 基礎飼料)、ZF5 組(基礎飼料+105CFU/mL球形賴氨酸芽孢桿菌)與ZF7 組(基礎飼料+107CFU/mL球形賴氨酸芽孢桿菌), 每組3 個平行。每日飼喂2次(09:00 和15:00), 每隔48 h 換去養殖缸內1/2 養殖水, 進行為期33 d 的飼養。飼養期間水溫(27.5±1) °C、pH 為7.3～7.8、光暗周期為14 h:10 h。

1.3 樣品制備

養殖實驗結束后, 對實驗魚進行24 h 饑餓處理。取樣前用丁香酚(1∶1 000)對斑馬魚幼魚進行麻醉, 并進行各組的稱重與計數。每組取20 尾魚放置于無菌操作臺中, 冰上解剖取出腸道和肝臟于無酶無菌EP 管中后迅速放入液氮, 并-80 °C 保存, 用于肝臟與腸道生化指標、腸道菌群與代謝的測定。另外每組取3 尾魚放置于無菌操作臺中, 取出的腸道放置裝有4%多聚甲醛的離心管中固定, 便于進行后續的腸道組織學分析。

1.4 指標測定

1.4.1 生長數據處理 各生長參數按下列公式計算:

上述公式中, IBW、FBW 分別表示實驗魚初始體重和終末體重;No、Nt分別表示養殖實驗開始時網箱中魚的尾數和養殖實驗結束時網箱中魚的尾數;t表示實驗天數。

1.4.2 肝臟與腸道的生化指標 肝臟抗氧化相關酶包括總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD);肝臟免疫相關酶包括堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、谷草轉氨酶(GOT)、谷丙轉氨酶(GPT); 腸道消化酶包括胰蛋白酶、脂肪酶, 均使用南京建成生物工程研究所的相關試劑盒進行測定。

1.4.3 腸道組織學觀察 將4%多聚甲醛溶液固定的組織送往杭州厚愛生物科技有限公司進行組織切片的后續制作, 用Image-Pro Plus 6.0 軟件, 分別測量絨毛長度(mm)、隱窩深度(mm), 每張切片選取5 根完整的絨毛, 計數每根完整絨毛上的杯狀細胞。

1.4.4 腸道菌群的測序 將-80 °C 保存的腸道送去上海元莘生物公司進行腸道菌群的測序, 包括樣品的DNA 提取、測序建庫與多樣性分析。首先通過Illumina Novaseq 6000 進行測序; 其次對測序序列進行質控、聚類/去噪, 劃分Feature, 并根據Feature 的序列組成得到其物種分類, 從而獲得各樣品的物種分布圖、物種聚類熱圖、屬分類學水平系統進化發育樹; 最后使用QIIME2 軟件進行樣品的Alpha、Beta 多樣性分析。

1.4.5 腸道代謝物的測定 將-80 °C 冰箱內保存的腸道送去上海元莘生物公司進行腸道代謝物的分析, 采用UHPLC 超高效液相色譜系統(Thermo)分離后, 用Q Exactive 系列質譜儀(Thermo)進行質譜分析,檢測樣本中的代謝物, 通過與本地數據庫中代謝物的保留時間、分子質量(誤差在10 ppm 內, ppm 為質譜儀的精度單位part per million)、二級碎裂譜圖、碰撞能等信息進行匹配, 對生物樣本中的代謝物進行結構鑒定, 并對鑒定結果進行嚴格的人工二次核對、確認。原始數據經ProteoWizard 轉換成mzXML 格式,然后采用XCMS 軟件進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。對XCMS 提取得到的數據首先進行代謝物結構鑒定、數據預處理, 然后進行實驗數據質量評價, 最后進行數據分析。

1.5 數據分析

本實驗所有數據使用Excel 2019 處理并采用SPSS 26.0 進行方差分析,P＜0.05 表示差異顯著,P＞0.05 表示差異不顯著, 所有數據用平均值±標準差表示。

2 實驗結果

2.1 球形賴氨酸芽孢桿菌對斑馬魚幼魚生長性能的影響

由表1 可知, 各組間的終末體重、增重率、存活率和特定生長率都沒有顯著性差異(P＞0.05), 但ZF7組的終末體重和增重率相對ZF0 組有所升高。

表1 球形賴氨酸芽孢桿菌對斑馬魚幼魚生長性能的影響Tab.1 Effects of L. sphaericus on growth performance of juvenile zebrafish (D. rerio)

2.2 球形賴氨酸芽孢桿菌對斑馬魚幼魚肝臟抗氧化免疫能力的影響

由表2 可知, ZF5、ZF7 組GPT 活性相比ZF0 組顯著提高(P＜0.05), ZF5 組AKP 活性顯著高于其余兩組(P＜0.05); 各組間的SOD、T-AOC、GOT 與ACP活性均無顯著性差異(P＞0.05)。

表2 球形賴氨酸芽孢桿菌對斑馬魚幼魚肝臟抗氧化免疫能力的影響Tab.2 Effects of L. sphaericus on liver antioxidant and immune ability of juvenile zebrafish (D. rerio)

2.3 球形賴氨酸芽孢桿菌對斑馬魚幼魚腸道消化酶活性的影響

由表3 可知, ZF7 組的脂肪酶、胰蛋白酶活性顯著高于ZF0 組(P＜0.05); ZF7 組腸道蛋白含量顯著高于ZF5 與對照組(P＜0.05)。

表3 球形賴氨酸芽孢桿菌對斑馬魚幼魚腸道消化酶活性的影響Tab.3 Effects of L. sphaericus on intestinal digestive enzyme activity of juvenile zebrafish (D. rerio)

2.4 球形賴氨酸芽孢桿菌對斑馬魚幼魚腸道組織結構的影響

如表4 所示, 各組之間的絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度具有顯著性差異(P＜0.05); ZF7 組的隱窩深度顯著低于其他兩組(P＜0.05); 實驗組杯狀細胞的數量與對照組沒有顯著性的差異(P＞0.05)。

表4 球形賴氨酸芽孢桿菌對斑馬魚幼魚腸道組織結構的影響Tab.4 Effects of L. sphaericus on intestinal structure of juvenile zebrafish (D. rerio)

2.5 球形賴氨酸芽孢桿菌對斑馬魚幼魚腸道菌群的影響

2.5.1 Alpha 多樣性分析 通過單樣本的多樣性分析(Alpha 多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性。反映細菌群落豐富度的Ace 指數、Chao 指數隨著指數數值的增大, 豐富度增加。表5 可知, 對照組的豐富度(Ace、Chao)低于試驗組, ZF5、ZF7 組Ace指數顯著高于對照組(P＜0.05); ZF7 組Chao 指數顯著高于對照組(P＜0.05)。Simpson 與Shannon 指數常用于反映群落多樣性, Simpson 指數值越大, 群落多樣性越低; Shannon 指數值越大, 群落多樣性越高。與對照組相比, 試驗組群落豐富度顯著升高(P＜0.05)。Coverage 是指各樣本文庫的覆蓋率, 其數值越高, 樣本中序列被測出的概率越高, 由表5 可知, 本試驗中各組Coverage 指數接近于1, 表明樣本中幾乎所有序列都被檢測到了。

表5 Alpha 多樣性分析Tab.5 Alpha diversity analysis

2.5.2 Beta 多樣性分析 如圖1 所示, 在第一主成分(PC1, 83.39%)對照組與試驗組相距較遠, 且試驗組樣品分布較緊密; 對照組在第二主成分(PC2,8.34%)跨度較大, 但試驗組仍保持緊密分布。根據圖2 可以看出對照組與試驗組距離較遠, 各組之間都有較好重復性。

圖1 主成分分析圖Fig.1 Principal Component Analysis

圖2 聚類樹狀圖Fig 2 Clustering tree diagram

為了清晰地看到斑馬魚的腸道菌群組成, 運用統計學方法計算各樣品的群落組成, 主要分析門水平和屬水平的微生物種群類別。由圖3a 所示, 門水平上, 斑馬魚腸道微生物主要由變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteriota)和放線菌門(Actinobacteriota)組成, Others 由物種豐度低于1%的各門類組成。對照組與各試驗組的優勢菌門都是變形菌門, 試驗組中放線菌門的豐度顯著提高。

圖3 群落結構組分圖Fig 3 Map of community structure components

基于屬水平的腸道菌群組成(圖3b)所示, 對照組優勢菌屬為鯨桿菌屬(Cetobacterium), 其中還含有大量的鄰單胞屬(Plesiomonas)。試驗組優勢菌群仍為鯨桿菌屬, 但戈登氏菌(Gordonia)、細桿菌屬(Microbacterium)、副球菌屬(Paracoccus)等有益菌屬有所增加, 且鄰單胞屬大幅減少, ZF7 組氣單胞屬含量在菌群組成中也顯著降低。

2.6 球形賴氨酸芽孢桿菌對斑馬魚幼魚腸道代謝物的影響

2.6.1 單變量統計分析 單變量統計方法通過變異倍數分析與T 檢驗/非參數檢驗對兩組樣本進行差異分析?；鹕綀D橫坐標代表該組對比物質的差異表達倍數(Flod Change)log2的對數值, 縱坐標代表T 檢驗P值的-lg 的對數值。圖中紅色表示顯著上調的差異代謝物(FC＞1.5,P＜0.05), 藍色表示顯著下調的差異代謝物(FC＜0.67,P＜0.05)。黑色表示不顯著的差異代謝物(P＞0.05)。ZF0 與ZF5 兩組共檢測到270 個差異代謝物, 相比ZF0 組, ZF5 組顯著上調172 個差異代謝物, 顯著下調98 個差異代謝物(圖4a)。ZF0 與ZF7兩組共檢測到183 個差異代謝物, 相比ZF0 組, ZF7組顯著上調110 個差異代謝物, 顯著下調73 個差異代謝物(圖4b)。ZF7 與ZF5 兩組共檢測到231 個差異代謝物, 相比ZF5 組, ZF7 組顯著上調67 個差異代謝物, 顯著下調164 個差異代謝物(圖4c)。

圖4 組間差異代謝物表達火山圖Fig.4 Volcanic plot of differential metabolite between control and treatment groups

2.6.2 篩選差異代謝物 OPLS-DA 模型得到的變量權重值(variable importance for the projection, VIP)能夠用于衡量各代謝物的表達模式對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力, 通常VIP＞1 的代謝物被認為在模型解釋中具有顯著貢獻。以 OPLS-DA VIP＞1 和P＜0.05 為標準篩選顯著性差異代謝物?；诤Y選結果, 我們列出了ZF5 和ZF7 組中顯著上調和下調的前5 位差異表達代謝物(表6)。ZF5 和ZF7 處理組共同上調的差異代謝物有 Lipoxin a4、Prostaglandin g2 和11-dehydrothromboxane b2, 共同下調的差異代謝物有 5'-phosphoribosyl-5-amino-4-imidazolecarboxamide (aicar)。與ZF5 相比, ZF7 顯著上調的前兩位差異代謝物是 Sulfobacin b、5-Hydroxytryptophan; 顯著下調的前兩位差異代謝物是11-dehydrothromboxane b2 和Prostaglandin i2。

表6 組間差異表達代謝物TOP 5 (負離子模式下)Tab.6 TOP 5 metabolites were differentially expressed between groups (neg)

2.6.3 KEGG 分析 KEGG 通路富集分析是以KEGG 通路為單位, 通過計算各個通路代謝物富集度的顯著性水平, 從而確定受到顯著影響的代謝和信號轉導途徑。P值越小, 則該代謝通路的差異性越顯著。圖5 所示, ABC 轉運蛋白(ABC transporters)、神經活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸(alanine,aspartate and glutamate metabolism)通路中包含的差異表達代謝物數目較多且富集程度極顯著, 氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)通路中包含的差異表達代謝物數目較多, 富集程度較顯著。

圖5 KEGG 富集通路圖Fig 5 KEGG enrichment pathway diagram

3 討論

3.1 球形賴氨酸芽孢桿菌對斑馬魚幼魚生長性能的影響

益生菌在水產養殖中應用廣泛, 常通過向飼料或養殖水體中添加益生菌制劑的方法來探究益生菌對于水產養殖動物生長性能的影響(Lietal, 2019; Sumonetal, 2022)。大量研究表明, 益生菌對水產養殖動物生長性能有促進作用, 如在Padeniya 等(2022)的研究中發現, 益生菌浸浴斑馬魚幼魚后加快其對卵黃的吸收, 增強其生長性能。Snega Priya 等(2021)的實驗結果表明, 飼喂添加枯草芽孢桿菌的飼糧可以提高斑馬魚幼魚的生長性能, 飼糧中添加枯草芽孢桿菌和榴蓮皮PG 混合補充劑具有更高的效益。本試驗結果表明, ZF5 和ZF7 組雖然沒有顯著增強斑馬魚幼魚的生長性能, 但實驗組末體重相比對照組有所提高,ZF7 組的WGR 相比ZF0 也有所提高, 總的來說, 添加球形賴氨酸芽孢桿菌后魚體終末體重與增重率有上升趨勢。本試驗結果與上述研究結果相似, 表明球形賴氨酸芽孢桿菌可以改善斑馬魚幼魚的生長狀況,具體的作用效果還要根據益生菌的種類、劑量與補充持續時間而定。

3.2 球形賴氨酸芽孢桿菌對斑馬魚幼魚肝臟抗氧化免疫指標的影響

抗氧化酶的調節是改善宿主機體防御機制所必需的(Midhunetal, 2019b)。機體的健康狀況主要取決于活性氧(ROS)的代謝和免疫系統的功能。ROS 代謝涉及SOD、GPx、GR 和CAT 等酶, 它們是調節自由基發生和保護機體免受氧化應激的第一道防線(Ramosetal, 2015)。在Giri 等(2013)的研究中, 用含植物乳桿菌的飼料飼喂露斯塔野鯪(Labeorohita)養殖30 d后 SOD 活性沒有得到顯著性改善, 養殖 60 d 后108CFU/g 處理組的SOD 活性顯著增強, 這表明飼料中添加菌液濃度的高低與養殖周期的長短都會得到不同的養殖效益。本研究中, 處理組SOD 活性相比于對照組沒有顯著性差異, 推測可能由于養殖周期問題, 球形賴氨酸芽孢桿菌在斑馬魚體內還沒有激發免疫組織增強其抗氧化作用。谷丙轉氨酶(GPT)和谷草轉氨酶(GOT)是肝臟內活性較高的2 種轉氨酶,主要參與機體的轉氨基作用, 當機體GPT 和GOT 活性較高時, 轉氨作用相應增強, 容易進行聯合脫氨作用, 增強氨基酸氧化分解從而減少氨基酸代謝產物對機體的毒害, 保持機體穩定(劉盼等, 2022)。本試驗中, ZF5、ZF7 組GPT 活性顯著高于對照組(P＜0.05),表明添加球形賴氨酸芽孢桿菌后對斑馬魚機體具有保護作用。堿性磷酸酶(AKP)主要存在于肝臟與腸上皮, 是魚體內巨噬細胞溶酶體的標志酶, 主要參與磷酸基團的轉移和代謝(郭文靜, 2020)。本試驗中, 與其他兩組相比 ZF5 處理組的 AKP 活性顯著升高(P＜0.05)。Wang 等(2021)飼喂乳酸乳球菌Z-2 后, 顯著增加鯉魚(Cyprinuscarpio)體內的AKP 活性, 與本試驗結果相同。試驗表明添加球形賴氨酸芽孢桿菌能夠增強斑馬魚幼魚機體的免疫能力。

3.3 球形賴氨酸芽孢桿菌對斑馬魚幼魚腸道消化酶的影響

腸道是魚類主要的消化器官, 腸道中的各種消化酶對蛋白質、脂質、碳水化合物等重要營養物質的消化吸收起主要作用(Girietal, 2013)。芽孢桿菌作用機制之一是能夠產生多種降解有機物的酶類(于瑞河,2020)。當飼料中添加的益生菌在腸道成功定植后可產生細胞外酶, 從而促進營養物質的消耗與吸收(Nedaeietal, 2019)。大量研究表明, 添加益生菌有助于魚類腸道消化酶的提高。例如, 添加不同劑型的乳酸乳球菌提高了鯉魚腸道消化酶活性(淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶) (Wangetal, 2021)。與對照組相比, 飼喂含有宿主相關益生菌乳酸菌(HAP)飼料的擬鯉(Rutilus rutiluscaspicus)幼魚體內淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性顯著提高(Tarkhanietal, 2020)。本研究中, ZF7 組脂肪酶、胰蛋白酶顯著高于其他兩組(P＜0.05), 表明球形賴氨酸芽孢桿菌對提高斑馬魚腸道消化酶活性有積極的作用。消化酶是魚類對營養物質消化能力的重要指標(胡亞軍等, 2016)。使用益生菌多黏類芽孢桿菌HGA4C 可以通過增加尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)的脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶來提高魚的消化能力(Midhunetal, 2019a)。本研究中, ZF7 組消化酶活性顯著提高增強了斑馬魚幼魚腸道的消化能力,這與ZF7 組的絨毛高度與v/c 顯著增高相呼應, 表明球形賴氨酸芽孢桿菌有助于魚類腸道的消化吸收。

3.4 球形賴氨酸芽孢桿菌對斑馬魚幼魚腸道組織的影響

魚類腸道不僅是消化吸收的重要場所, 具有容納和運輸、消化食物、吸收營養的功能, 還是具有生物、物理、化學、免疫屏障等多功能的免疫器官(涂永鋒等, 2004)。腸道結構功能的完整對魚類的生長和消化吸收至關重要(王穎, 2022)。對腸道進行組織觀察可進一步了解魚類對食物消化吸收的能力(劉君恒等, 2021)。絨毛高度是判斷腸道消化吸收能力的重要指標, 且絨毛高度與腸道的吸收能力呈正相關(王子旭等, 2003)。隱窩深度的深淺可以體現出腸道的發育情況, 隱窩深度變淺, 腸道的消化吸收能力增強(歐紅霞等, 2020)。絨毛高度與隱窩深度的比值則是腸道綜合功能的評價指標, 體現為比值上升, 腸道黏膜消化吸收功能增強, 機體生長加快; 反之, 比值降低,腸黏膜出現破損, 其消化吸收能力減弱, 機體表現出生長緩慢(徐光科, 2007)。絨毛長度越長, 隱窩深度越淺, V/C 值越大, 腸道吸收營養的能力越強。本研究中,ZF7 組的絨毛高度與v/c 顯著高于其他兩組(P＜0.05);ZF7 組的隱窩深度顯著低于對照組與ZF5 組(P＜0.05),這與楊智仁等(2023)的結果一致, 表明添加球形賴氨酸芽孢桿菌有助于腸道對營養物質的消化吸收。在斑馬魚腸道化學屏障中, 杯狀細胞分泌的黏蛋白可作為潤滑性黏液, 對腸道上皮細胞具有保護作用(劉娜娜等, 2015)。大鼠(哺乳動物)創傷性休克后的腸黏膜重建過程中, 有大量的杯狀細胞占據腸黏膜表面并呈現分泌狀態來促進重建的完成(常建星等, 2005)。本研究顯示養殖水體添加球形賴氨酸芽孢桿菌后杯狀細胞數量減少, 這與劉娜娜等(2015)的研究結果相一致, 說明添加益生菌后有助于提高腸道屏障的完整性, 加強腸道上皮細胞的保護作用。

3.5 球形賴氨酸芽孢桿菌對斑馬魚幼魚腸道菌群的影響

魚類腸道菌群是一個動態的微生態系統, 養殖環境、飲食、宿主遺傳等因素都會影響腸道微生物的組成(Egertonetal, 2018)。本試驗通過高通量測序對斑馬魚幼魚的腸道微生物進行分析, 從而探究養殖水體添加球形賴氨酸芽孢桿菌對斑馬魚幼魚腸道菌群的影響。試驗通過Alpha 和Beta 對斑馬魚幼魚腸道菌群進行多樣性分析, 結果表明, 添加球形賴氨酸芽孢桿菌后斑馬魚幼魚腸道微生物群落的豐度與多樣性都顯著提高(P＜0.05), 這與林艾影(2019)的研究結果相似。在蔣廣志等(2023)的研究中發現, 添加益生菌后改變了宿主腸道微生物的多樣性。本試驗Beta分析的PCA 圖可清晰地看出在試驗組與對照組中斑馬魚幼魚腸道樣品的物種豐度有一定的差別, 而兩試驗組樣本間的物種相似度較高, 這也與本試驗中斑馬魚幼魚腸道菌群組成的結果相呼應。研究表明,斑馬魚腸道主要由變形菌門(Proteobacteria)與梭桿菌門(Fusobacteriota)組成(Roeselersetal, 2011)。在本研究中, 對照組也得出相同結果, 試驗組在此基礎上顯著提高了放線菌門(Actinobacteriota)的豐度。與之相似的是, 汪磊(2022)使用復合益生菌飼喂眼斑雙鋸魚(Amphiprionocellaris)后提高其腸道菌群中放線菌門的豐度。放線菌門是一類具有廣泛應用前景的微生物類群, 有抗菌活性(楊子文, 2018)。屬水平上, 相比于對照組, 試驗組腸道菌群中的物種多樣性明顯增加,其中戈登氏菌屬(Gordonia) 、 細桿菌屬(Microbacterium)、賴氏菌屬(Leifsonia)、副球菌屬(Paracoccus)的相對豐度有所提高。Sheikhzadeh 等(2017)發現戈登氏菌顯著增強虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的生長與免疫性能。細桿菌屬對豐年蝦的生長發育有良好的影響(Suoetal, 2017)。本研究中相比對照組, 試驗組的生長與免疫能力都有所改善, 推測可能與腸道中益生菌屬相對豐度提高有關。由此表明,添加球形賴氨酸芽孢桿菌可改善斑馬魚的腸道微生物組成。但在本試驗中, 球形賴氨酸芽孢桿菌所屬的菌屬不是優勢菌屬, 可能是由于腸道定植數量較少不足以顯示菌株的變化, 在Zhang 等(2020)的研究中使用檸檬酸桿菌作為飼料添加劑對魚類腸道菌群進行探索也得出相同結果。綜上所述, 斑馬魚養殖水體中添加球形賴氨酸芽孢桿菌可以改善其腸道微生物多樣性, 調節腸道菌群。

3.6 球形賴氨酸芽孢桿菌對斑馬魚幼魚腸道代謝的影響

本研究中雖然斑馬魚腸道中有機酸及其衍生物在總代謝物中占比較大, 但脂質和類脂質分子中差異代謝物變化更為明顯。Lipoxin a4 (LXA4)是腸道差異代謝物中上調最明顯的, 在ZF5 和ZF7 組分別上調到ZF0 的86 和11 倍。LXA4 屬于脂質和類脂質分子中脂肪酰類(Fatty Acyls)的類花生酸(Eicosanoids), 主要參與花生四烯酸代謝中的新陳代謝與脂質代謝。研究表明, 花生四烯酸通過抑制脂肪細胞的增殖分化和凋亡來促進脂肪的水解, 降低炎癥相關化學因子(Burnsetal, 2018)。Sepulcre 等(2016)在斑馬魚及其他硬骨魚中發現, 魚體內中性粒細胞凋亡前會產生LXA4, LXA4 在抑制巨噬細胞呼吸爆發的同時加強了對凋亡細胞的吞噬活性。本研究中, 添加球形賴氨酸芽孢桿菌后LXA4 表達量明顯上調, 從而可以降低炎性因子的表達, 這與孫學亮等(2023)用屎腸球菌對斑節對蝦(Penaeusmonodon)的研究結果相一致。與ZF5 相比, ZF7 上調最明顯的代謝物是Sulfobacin b(磺脲霉素B), 上調到ZF5 的6.17 倍。屬于脂質和類脂質分子中脂肪酰類的脂肪酰胺(Fatty amides), 在Maeda 等(2010)的研究中發現, 將磺脲霉素B 通過腹腔注射到lps 誘導的急性炎癥模型的小鼠體內, 可抑制小鼠血清TNF-α的產生, 表明磺脲霉素B是一種潛在的炎癥化療藥物。其次5-Hydroxytryptophan (5-羥色氨酸)上調到ZF5 的4.05 倍。5-羥色氨酸(5-HTP)屬于有機雜環化合物中吲哚衍生物(indoles and derivatives)的色胺衍生物(tryptamines and derivatives)。5-HTP 是一種天然氨基酸(AA), 目前, 5-HTP 主要從天然產品中提取, 但隨著生物技術的發展, 微生物合成5-羥基色氨酸的新策略被提出。Liu 等(2021)提出大腸桿菌是原核生物的模型菌株, 具有明確的遺傳信息和良好的發酵條件。本研究中ZF7 相比ZF5 組5-HTP 明顯上調可能的原因是由于較高濃度的球形賴氨酸芽孢桿菌更適合5-HTP 的產生。與ZF5 組相比, ZF7 組下調最明顯的代謝物是 11-dehydrothromboxane b2(11-脫氫血栓素 B2), 其次是Prostaglandin i2 (前列腺素I2), 分別下調到0.09 和0.11。其同屬于脂質和類脂質分子中脂肪酰類的類花生酸。11-脫氫血栓烷B2(11-dhTXB2)是體內形成的血栓烷A2 的標記化合物(Takasakietal, 1991)。在Lukianets 等(2022)的研究中發現, 人體尿液中11-dhTXB2 的含量升高表明血栓素在持續產生, 造成動脈粥樣硬化血栓形成從而增加心血管疾病的風險。前列腺素I 2 (PGI 2)是一種脂質介質, 對免疫細胞具有有效的抗炎作用(Norlanderetal,2021)。PGI2 信號也對免疫系統產生強大的抗炎作用(Tokietal, 2013)。大量研究證明, PGI2 不僅對treg 的形成和發展很重要, 反過來, 在某些疾病模型中, treg 又促進了PGI2 的生物利用度(Tamosiunieneetal, 2018)。在Norlander 等(2021)的研究中發現, PGI2 信號轉導可以直接或間接的促進treg 的形成和treg 功能, 從而治療炎癥性疾病或者自身免疫病。這可能與本試驗中ZF5組的非特異性免疫酶AKP 顯著高于ZF7 組有關。

KEGG 中ABC 轉運蛋白通路、神經活性配體-受體通路和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸通路中的差異表達代謝物數目較多且富集程度極顯著。ABC 轉運蛋白催化ATP 的水解, 將反應中釋放的能量與其他細胞功能耦合, 實現腸道內各物質的輸入與輸出(Bieczynskietal, 2021), 這與本研究中腸道消化酶和腸道組織的結果相呼應。Xia 等(2020)對羅非魚的研究表明, 添加乳酸菌對其腸道差異代謝物的代謝途徑具有顯著影響, 包括ABC 轉運蛋白、蛋氨酸和半胱氨酸的代謝、氨基酸的生物合成、蛋白質的消化吸收、花生四烯酸的代謝等。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑是主要參與神經傳遞的氨基酸代謝途徑, 其代謝途徑是由多種代謝物變化的結果。其中γ -氨基丁酸(GABA)是中樞神經系統中主要的抑制性神經遞質,在促進攝食、調節能量代謝、參與內分泌調節和免疫防御等方面發揮著重要作用(Xieetal, 2017)。在中華絨螯蟹的日糧中添加GABA 后, 影響了其攝食相關基因的表達, 促進了消化酶活性(Zhangetal, 2022)。這也與本研究中腸道消化酶顯著升高的結果相一致, 其原因可能是添加球形賴氨酸芽孢桿菌后增強了丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝途徑, 有助于其腸道消化吸收代謝物的富集, 從而增強了其消化吸收的能力。

4 結論

養殖水體中添加球形賴氨酸芽孢桿菌后提高了斑馬魚幼魚腸道微生物的多樣性, 使其腸道代謝產物發生顯著變化, 調節免疫能力的Lipoxin a4 顯著上調, 促進了斑馬魚幼魚抗氧化和免疫能力的提升。同時ABC 轉運蛋白通路與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝通路的富集促進了斑馬魚幼魚腸道消化能力的提高, 有利于改善斑馬魚幼魚的生長性能。