秸稈及其生物質炭輸入對毛竹林土壤氨氧化微生物與氮循環相關酶活性的影響

潘麗霞，姜振輝，張雯怡，周家樹，劉 娟,2，蔡延江,2，李永夫,2

（1.浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300；2.浙江農林大學 浙江省森林生態系統碳循環與固碳減排重點實驗室，浙江 杭州 311300）

毛竹Phyllostachysedulis是中國亞熱帶地區種植最廣泛的竹種之一，具有減緩氣候變化、固碳減排的優勢和潛力[1-2]。毛竹林集約經營具有增產增收等優勢，但長期集約經營可能會導致毛竹林生態功能退化、土壤有機碳儲量下降以及土壤碳排放加劇等問題[3]。前人研究發現：外源碳的施用可以顯著提升毛竹林土壤肥力和有機碳儲量[4]。農作物秸稈作為一種常見的外源碳，被廣泛應用于農林生態系統中[5]。但是，秸稈直接輸入土壤會引發病蟲害，導致土壤酸化等問題[6-7]。相比之下，秸稈生物質炭(秸稈在高溫低氧條件下熱解產生的一種難以降解的富碳固態產物)具有更多的優勢，如提升土壤有機碳儲量、降低土壤酸度及促進作物增產等[8-9]。另外，秸稈及其生物質炭輸入土壤后均會改變土壤氮素含量、微生物群落特征及氮轉化過程等[10-12]，從而對氮循環產生顯著影響，且影響效應與外源碳類型密切相關[13-14]。氮素是毛竹生長的必需元素之一[15-16]，也是其產量的限制因子[17]，因此，研究不同外源碳輸入對毛竹林土壤氮循環的影響具有重要意義。

硝化作用是土壤氮循環中的關鍵因素之一，也是旱地土壤氧化亞氮(N2O)排放的主要途徑[18]。氨氧化過程是硝化作用的關鍵和限速步驟，由氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細菌(AOB)共同驅動[19]。此外，復雜的有機氮需要經過微生物分泌胞外酶進行水解，才能進入下一步氮素轉化過程[20]。因此，研究土壤氨氧化微生物群落及與氮循環相關的酶活性變化，有助于揭示毛竹林土壤硝化過程的生物學調控機制。

目前的研究表明：秸稈及其生物質炭的輸入能夠顯著改變土壤中氨氧化微生物群落和氮循環相關酶活性，但研究結果存在較大差異。這可能是由于外源碳材料、土壤類型以及氣候等因素的差異而產生的[21-24]。此外，現有的研究主要集中在農田土壤，對毛竹林生態系統的研究報道相對較少。因此，本研究以亞熱帶毛竹林為研究對象，比較玉米Zeamays秸稈及其生物質炭施用對毛竹林土壤氨氧化微生物群落、氮循環相關酶活性以及總硝化速率的影響，揭示玉米秸稈及其生物質炭輸入后毛竹林土壤氮素轉化的微生物學機制，為秸稈及其生物質炭在毛竹林生態系統中的合理利用提供理論基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于浙江省杭州市臨安區高虹鎮泥馬村(30°19′N, 119°41′E)。該地為中亞熱帶季風氣候，年平均氣溫為18.1℃，年平均降水量為1 764.0 mm，日照時數1 950.0 h，無霜期243.0 d。土壤類型為紅壤，0～20 cm 土層土壤的基本理化性質：pH 4.82，有機碳19.80 g·kg-1，全氮1.88 g·kg-1，有效磷7.81 mg·kg-1，速效鉀89.40 mg·kg-1，砂粒398.00 g·kg-1，粉粒321.00 g·kg-1，黏粒 281.00 g·kg-1。

1.2 試驗設計

本研究于2020—2021 年在試驗地毛竹林中進行。試驗設置3 個處理：對照(不施用玉米秸稈和生物質炭，ck)、施用玉米秸稈5 t·hm-2(T1)、施用玉米秸稈生物質炭5 t·hm-2(T2)。每個處理設4 個重復，共計12 個小區。采用隨機區組設計，小區面積為100 m2(10 m×10 m)，小區之間設5 m 的緩沖地帶。

本研究所用的玉米秸稈及其生物質炭由南京智融聯科技有限公司提供。玉米秸稈中碳和氮質量分數分別為412.3 和6.6 g·kg-1。玉米秸稈生物質炭是在500 ℃限氧條件下熱裂解而成，其基本理化性質如下：pH 為9.24(m∶V=1∶20)，含碳和氮分別為550.4 和11.9 g·kg-1，比表面積為11.3 m2·g-1。

2020 年8 月31 日，將玉米秸稈和玉米秸稈生物質炭分別均勻施入樣地，并將其翻耕至土壤表層的0～20 cm 深度。于2020 年11 月(施用外源碳后的第3 個月)和2021 年9 月(施用外源碳后的第12 個月)進行采樣。采用“五點法”采集土壤表層(0～20 cm)土樣，隨后將采得的土樣分成2 個部分，分別置于4 和-80 ℃冰箱保存，用于各項指標測定。

1.3 土壤氮組分與酶活性測定

1.4 土壤總硝化速率的測定

土壤總硝化速率采用氣壓過程分離(BaPS)程序測定[30]。在每個小區表層(0～20 cm)采取6 個土壤樣品。為防止土壤水分損失，樣品采集后立即密封包裝。隨后，將土壤樣品放置在帶有溫度傳感器的BaPS 培養箱中，并將溫度設置為野外實際測定的土壤溫度。打開BaPS 系統軟件，輸入樣品參數，測試收集數據24 h，經Delta 分析得到土壤總硝化速率，單位為μg·g-1·d-1[31]。

1.5 土壤DNA 提取、擴增與定量分析

稱取0.2 g 新鮮土壤，使用Fast DNA Spin Kit(MP Biomedals)提取土壤總DNA，提取的DNA 樣品保存于-70 ℃。選用不同引物對土壤氨氧化古菌和氨氧化細菌amoA基因進行擴增(引物信息和反應條件見表1)。PCR 采用AP221-02 試劑盒(TransStartFastpfu DNA 聚合酶，20 μL 反應體系，南京諾唯贊生物科技有限公司)在ABI GeneAmp?9 700 型PCR 儀(Applied Biosystems)中進行。使用質量分數為2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產物，利用DNA 凝膠回收純化試劑盒(PCR Clean-Up Kit)回收純化產物。

表1 氨氧化古菌和氨氧化細菌擴增引物Table 1 Primers of ammonia oxidizing archaea and ammonia-oxidizing bacteria

通過熔解曲線分析，觀察瓊脂糖凝膠電泳產物，證實擴增的特異性。隨后用QuantiFluor?-ST 藍色熒光定量系統(Promega 公司)測定氨氧化古菌和氨氧化細菌的amoA基因拷貝數。對含有克隆amoA基因的線性化質粒進行10 倍梯度連續稀釋，得到校準曲線。采用PCR 效率為90%～110%，調整系數(R2)大于0.98 的標準曲線。

1.6 Illumina 測序與序列分析

引物組的擴增產物同樣用于高通量測序。擴增產物經純化后，使用TruSeqTMDNASample Prep Kit 試劑盒構建文庫，在上海美吉生物醫藥科技有限公司(中國)的IlluminaMiSeq 平臺(Illumina)上測序，獲得以FASTQ 格式保存的雙端序列數據。測序得到的PE reads 首先根據overlap 關系進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾。根據序列首位兩端的barcode 和引物序列區分樣品得到有效序列，并矯正序列方向，得到優化數據。利用UPARSE 11 按照97%的相似度對質控拼接后的序列進行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類并剔除嵌合體。使用RDPClassifier 對比FunGene 功能基因數據庫進行OTU 物種分類學注釋，置信度閾值為70%，并在不同物種分類水平下統計每個樣本的群落組成。

1.7 數據處理

采用Excel 2010 和SPSS 21.0 進行數據處理和統計分析。利用單因素方差分析(one-way ANOVA)結合Tukey 法檢驗不同處理間的差異顯著性(P＜0.05)。采用Pearson 相關分析，分析土壤氮組分、氨氧化微生物、酶活性和總硝化速率之間的相關性。利用Canoco 5.0 對土壤不同形態氮組分質量分數與氨氧化微生物群落之間的相關性進行冗余分析(redundancy analysis，RDA)，并通過蒙特卡洛檢驗，選擇出顯著影響氨氧化微生物群落結構的土壤氮組分。

2 結果與分析

2.1 秸稈及其生物質炭輸入對土壤氮組分的影響

與對照相比，在試驗第3 個月和第12 個月，秸稈處理均顯著提高了土壤、和水溶性有機氮(P＜0.05)，而生物質炭處理則顯著降低這些土壤氮組分的質量分數(P＜0.05，圖1A～C)。秸稈及其生物質炭處理均顯著提高土壤微生物生物量氮(P＜0.05)，且在試驗第3 個月，秸稈及其生物質炭處理分別使土壤微生物生物量氮增加26.6%和14.4%，兩者間差異顯著(P＜0.05)，但在試驗第12 個月，秸稈及其生物質炭處理分別使微生物生物量氮增加17.4%和12.2%，兩者間無顯著差異(圖1D)。

圖1 秸稈及其生物質炭輸入對毛竹林土壤不同形態氮組分的影響Figure 1 Effects of straw and its biochar application on different soil N fractions in a Ph.edulis forest

2.2 秸稈及其生物質炭輸入對土壤氨氧化微生物的影響

由圖2A 和圖2B 可知：與對照相比，在試驗第3 個月和第12 個月，施用秸稈顯著提高了土壤氨氧化細菌豐度(P＜0.05)；而生物質炭則降低了土壤氨氧化細菌豐度，降幅分別為44.6%和39.0% (P＜0.05)。秸稈及其生物質炭處理對土壤氨氧化古菌豐度均無顯著影響。

圖2 秸稈及其生物質炭輸入對毛竹林土壤氨氧化古菌和氨氧化細菌基因豐度及多樣性指數的影響Figure 2 Effects of straw and its biochar application on the abundance and diversity index of soil AOA and AOB in a Ph.edulis forest

與對照相比，在試驗第3 個月和第12 個月，秸稈及其生物質炭處理均顯著提高了土壤氨氧化古菌群落的Shannon 指數(P＜0.05)，而氨氧化古菌群落Chao1 指數無顯著變化(圖2C～D)；秸稈及其生物質炭處理下，土壤氨氧化細菌群落Shannon 指數和Chao1 指數均顯著高于對照(P＜0.05，圖2E～F)。

在試驗第3 個月，氨氧化古菌群落的優勢菌屬(相對豐度＞1%)主要為norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota 和norank_p_environmental_samples_k_norank，兩者相對豐度分別為70.0%～76.3%和17.2%～21.2%(圖3A)；在試驗第12 個月，氨氧化古菌群落以norank_p_Crenarchaeota 和norank_d_Archaea 為主，兩者相對豐度分別為84.4%～87.3%和2.0%～2.8%(圖3B)。在試驗第3 個月和第12 個月，與對照相比，秸稈及其生物質炭處理均對氨氧化古菌群落組成無顯著影響。

圖3 秸稈及其生物質炭輸入對毛竹林土壤氨氧化古菌和氨氧化細菌群落物種組成的影響(屬水平)Figure 3 Effect of straw and its biochar application on the community composition of soil AOA and AOB at genus level in a Ph.edulis forest

由圖3C～D 可知：亞硝化螺菌屬Nitrosospira在氨氧化細菌群落組成中占絕對優勢。在試驗第3 個月，與對照相比：秸稈處理顯著增加了亞硝化螺菌屬的相對豐度(P＜0.05)，顯著降低了norank_p_ammonia_oxidising_bacteria_ensemble 的相對豐度(P＜0.05)。生物質炭處理顯著降低了亞硝化螺菌屬和norank_p_ammonia_oxidising_bacteria_ensemble 的相對豐度(P＜0.05)，增加了norank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteria 的相對豐度。在試驗第12 個月，秸稈處理顯著增加了亞硝化螺菌屬的相對豐度(P＜0.05)；而生物質炭處理顯著降低亞硝化螺菌屬的相對豐度(P＜0.05)，并增加了norank_c_Betaproteobacteria 和norank_f_Nitrosomonadaceae 的相對豐度。

對土壤不同形態氮組分質量分數與氨氧化微生物群落之間的相關性進行冗余分析，并通過蒙特卡洛檢驗發現：在試驗的第3 個月和12 個月，土壤氮組分質量分數對氨氧化古菌群落結構均無顯著影響(圖4A～B)；在試驗的第3 個月，土壤和微生物生物量氮為氨氧化細菌群落的關鍵影響因子(P＜0.05，圖4C)，而在試驗第12 個月，和水溶性有機氮為影響氨氧化細菌群落的主要因子(P＜0.05，圖4D)。

圖4 毛竹林土壤氨氧化古菌和氨氧化細菌群落結構與不同形態氮組分的冗余分析Figure 4 RDA analysis based on community structure of AOA, AOB and different soil N fractions in a Ph.edulis forest

2.3 秸稈及其生物質炭輸入對土壤氮循環相關酶活性和總硝化速率的影響

在試驗第3 個月和第12 個月，與對照相比，秸稈處理顯著提高了土壤蛋白酶和脲酶活性(P＜0.05)，其中，蛋白酶活性分別提高了19.9%和13.3%，脲酶活性分別提高了17.5%和13.1%；生物質炭處理則顯著降低了這2 種酶的活性(P＜0.05)，蛋白酶活性的降幅分別為15.2%和12.7%，脲酶活性的降幅分別為14.6%和12.0% (圖5A～B)。在試驗第3 個月和第12 個月，與對照相比，秸稈處理使土壤總硝化速率提高了25.1%和16.6% (P＜0.05)，生物質炭處理則顯著降低了土壤總硝化速率(P＜0.05)，降幅分別為18.9%和13.6% (圖5C)。

圖5 秸稈及其生物質炭輸入對毛竹林土壤蛋白酶、脲酶活性及總硝化速率的影響Figure 5 Effects of straw and its biochar application on the soil protease activity, urease activity, and gross nitrification rate in a Ph.edulis forest

2.4 土壤氮組分、氨氧化微生物、酶活性與總硝化速率的相關性

相關性分析表明(圖6)：除在試驗第3 個月，氨氧化古菌豐度與土壤水溶性有機氮質量分數呈顯著正相關(P＜0.05)之外，氨氧化古菌豐度及其優勢菌的相對豐度與土壤氮組分質量分數、總硝化速率之間無顯著相關。在第3 個月和第12 個月，土壤氨氧化細菌豐度及其優勢菌屬亞硝化螺菌屬的相對豐度、蛋白酶活性和脲酶活性均與、和水溶性有機氮以及總硝化速率呈顯著正相關(P＜0.05)；土壤、和水溶性有機氮也均與總硝化速率呈顯著正相關(P＜0.05)。

圖6 毛竹林土壤氮組分、氨氧化古菌和氨氧化細菌豐度及其優勢菌屬的相對豐度、酶活性與總硝化速率的相關性Figure 6 Relationships between soil N fractions, AOA and AOB abundance and the relative abundance of their dominant genus, enzyme activity and gross nitrification rate in a Ph.edulis forest

3 討論

3.1 秸稈及其生物質炭輸入對土壤氨氧化微生物的影響

土壤氨氧化古菌和氨氧化細菌是土壤硝化作用的關鍵微生物群體，它們對環境變化的響應存在差異[32]。本研究發現：毛竹林土壤氨氧化細菌豐度及其群落結構受秸稈及生物質炭輸入顯著影響，而土壤氨氧化古菌群落變化受到的影響較小。這可能是由于土壤氨氧化細菌的生態位小于氨氧化古菌，即其在土壤中占據的資源和空間范圍較窄；而土壤氨氧化古菌具有更廣泛的生態位，能夠在不同的溫度、pH、氧氣和氮素等條件下生存和活動[33-34]。因此，土壤氨氧化細菌對環境變化的適應能力相對較低，對管理措施的響應更加敏感。另外，本研究也發現：土壤中不同形態氮組分對氨氧化細菌豐度及群落結構產生了顯著影響，而對氨氧化古菌豐度和群落結構無顯著影響。這也進一步證實了土壤氨氧化細菌對環境變化的響應更加敏感。這可能是由于氨氧化古菌和氨氧化細菌對不同形態的氮素反應能力存在差異，氨氧化細菌對于土壤中氮素的利用和轉化具有更高的依賴性，因此在面對環境變化的時候更易受影響[35]。

本研究結果顯示：玉米秸稈處理顯著提高了土壤氨氧化細菌豐度，這可能是因為秸稈輸入提供了充足的底物，從而促使氨氧化細菌生長，這與以往大多數研究結果一致[36-37]。此外，秸稈的施用還改變了土壤氨氧化細菌群落的結構，顯著增加了氨氧化細菌優勢菌屬亞硝化螺菌屬的相對豐度。與秸稈處理相反，玉米秸稈生物質炭輸入降低了土壤氨氧化細菌豐度，并減少了亞硝化螺菌屬的相對豐度。這可能是因為生物質炭具有較高的比表面積和孔隙結構，對土壤氮素具有吸附作用[38]，或者其對硝化作用具有抑制作用，減少了土壤中硝酸鹽的生成，降低了土壤中可溶性氮組分質量分數[39]。這導致氨氧化細菌生長所需的氮素減少，降低了氨氧化細菌豐度[40]。另外，生物質炭本身的物質組成可能包含硝化抑制劑α-松萜或酚類物質。這些化合物可能與土壤中的氨氧化細菌相互作用，干擾了其正常的代謝活動，導致氨氧化細菌豐度降低[41]。亞硝化螺菌屬主要利用土壤中的氨氮和亞硝酸鹽進行生長和代謝，并通過氨氧化和亞硝酸氧化將這些無機氮化合物轉化為硝酸鹽[42]。因此，當生物質炭輸入使土壤中的無機氮降低時，亞硝化螺菌屬可能會面臨氮源供應的不足，不利于其生長和繁殖。此外，生物質炭輸入還提高了土壤氨氧化細菌群落的多樣性，這使得氨氧化細菌屬間的競爭加劇，從而對氨氧化細菌優勢菌屬的生長產生抑制作用[43]。

3.2 秸稈及其生物質炭輸入對土壤酶活性和總硝化速率的影響

土壤蛋白酶和脲酶是參與土壤氮循環的主要酶系，其活性與土壤氮素轉化強度和供氮能力緊密相關[44-45]。本研究中，秸稈輸入對土壤蛋白酶和脲酶活性均有刺激作用，導致土壤酶活性顯著提高。這可能是由于秸稈輸入提高了土壤有機質質量分數，為微生物提供了豐富的營養物質，促使微生物生長，提高了土壤酶活性[45-46]。相反，秸稈生物質炭的輸入會對土壤蛋白酶和脲酶活性產生負面影響，這可能是由于生物質炭對反應底物和酶分子具有吸附作用。這種吸附作用會限制酶與底物接觸，阻礙酶促反應，導致土壤酶活性降低[47-48]。此外，生物質炭可能會占據酶的活性位點，使酶分子無法有效地與底物結合，降低了酶的活性[49]。

土壤酶活性與不同氮素組分的水平緊密相關[50-51]。蛋白酶和脲酶活性的提高有利于促進土壤有機氮分解為銨態氮[52]。本研究的相關性分析表明：毛竹林土壤蛋白酶和脲酶活性與土壤、和水溶性有機氮呈正相關，其中，土壤水溶性有機氮質量分數與酶活性之間的相關性最高。這與前人研究結果相符[53]，說明水溶性有機氮質量分數是影響毛竹林土壤酶活性的主要因素之一。

秸稈輸入顯著提高了毛竹林土壤總硝化速率，而秸稈生物質炭輸入則顯著降低了土壤總硝化速率。前者可能是由于秸稈中的有機物質激活和增強了酶的活性，也為土壤硝化細菌提供底物，促進其生長和代謝活動，從而促進硝化作用[54-55]。后者則可能是由于生物質炭對無機氮的吸附作用以及對土壤酶活性和硝化細菌的抑制作用，導致土壤硝化作用削弱[56]。本研究還發現：氨氧化細菌在毛竹林土壤硝化作用中起主要驅動作用，而其中亞硝化螺菌屬是優勢菌屬，其相對豐度與土壤總硝化速率呈顯著正相關。前人研究結果也發現：土壤硝化作用的削弱歸因于亞硝化螺菌屬相對豐度的降低[57]，表明亞硝化螺菌屬是土壤硝化作用的關鍵屬[43]。此外，土壤蛋白酶和脲酶活性也與總硝化速率呈顯著正相關，這說明增強土壤酶活性有利于促進土壤硝化作用。

綜上所述，與玉米秸稈輸入相比，玉米秸稈生物質炭降低了土壤氨氧化細菌豐度及優勢菌屬亞硝化螺菌屬的相對豐度，同時削弱了土壤中蛋白酶和脲酶的活性，因而，抑制了毛竹林土壤硝化作用。

4 結論

玉米秸稈及其生物質炭通過影響毛竹林土壤氮組分質量分數，對氨氧化細菌群落及氮循環相關酶活性產生影響，進而調節土壤硝化作用。秸稈輸入會刺激土壤硝化作用，而生物質炭輸入則會抑制土壤硝化作用。相較于秸稈直接輸入，將秸稈生物質炭輸入毛竹林土壤能夠顯著抑制土壤硝化作用，因此可以被視為減少亞熱帶森林土壤氧化亞氮排放和氮素損失的一種有效途徑。