腸道類器官在腸疾病機制研究中的運用*

強龍征 毛海光 王夢婷 齊莉莉 王進波

（浙大寧波理工學院，生物與化學工程學院，寧波 315100）

腸道作為消化系統的重要組成部分，承擔著食物消化、營養物質吸收和代謝的重要作用。特別是腸上皮，對營養物質的吸收和藥物的口服生物利用度起關鍵作用，是營養物質和藥物吸收的重要部位［1］。由于腸道各部分獨特的生理構造，導致在體外模擬腸道內環境從而探究腸道疾病的發病機制十分困難。雖然，永生化細胞、動物活體模型等技術已經應用于腸道疾病機制的相關研究［2］，但是由于無法有效模擬腸道結構與功能，導致研究結果有局限。類器官的出現，極大地改變了這一局面。腸道類器官是一種來源于腸道干細胞且具備三維（3D）結構的微器官，因其獲得相對容易，培養周期較短，而且可以進行傳代、凍存，遺傳相對穩定，經誘導后可以有效地模擬人腸道上皮的多細胞組成和復雜功能。同時，類器官技術與生物材料學等多領域的互相結合，極大推動了腸道類器官作為研究腸道疾病的重要體外工具的進展。然而將腸道類器官應用于腸道疾病的研究尚在起步階段，尤其是在許多疾病的發病機制上，仍有大量問題亟待解決。本文從腸道類器官的定義入手，介紹了腸道類器官在不同疾病機制探究及藥物研發、篩選方面的最新進展。

1 腸道類器官的來源與分類

腸道類器官可以定義為使用來源于腸道原代組織、胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）或誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）構建的，具有自我更新和自我組織能力的，并且表現出與原始組織類似的器官功能的微器官［3］。該類器官包含功能性的組織單元，但缺乏間基質細胞、免疫細胞、神經細胞和間充質細胞［4］。目前，成功構建的腸道類器官主要是小腸類器官和結腸類器官（圖1）。2007年，Clevers團隊［5］發現，亮氨酸重復序列G蛋白偶聯受體5陽性（leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5，Lgr5+）在隱窩基底柱狀細胞的特殊表達，標志著多種成人組織和腫瘤中的干細胞。而且位于隱窩底部的Lgr5+干細胞可以分裂增殖產生轉運擴增（transit amplifying，TA）細胞，并由TA細胞分化生成包括腸細胞、腸內分泌細胞、潘氏細胞、杯狀細胞等細胞。2009年，Sato等［6］即通過單個Lgr5+干細胞，首次培養并構建出小鼠隱窩-絨毛樣類器官。2011年，Spence團隊［7］通過新的方式將多能干細胞（pluripotent stem cells，PSC）誘導培養為腸道類器官。根據不同研究中干細胞來源的不同，可以將類器官分為原代腸組織干細胞來源類器官和誘導多能干細胞來源類器官。其中，原代腸組織干細胞來源的類器官又可分為成體干細胞類器官和胚胎干細胞類器官。

Fig.1 Appearance of intestinal organoids from different intestines sources in mice圖1 不同腸源的小鼠腸道類器官樣貌圖

2 腸道類器官的培養

2.1 傳統培養方式

Lgr5+干細胞的鑒定及干細胞生態位的表征證明了可以在體外擴增腸上皮以培育3D腸道類器官。這種類器官的培養模式不僅可以長時間維持，而且不會造成遺傳完整性的破壞，或者使組織生理學發生任何本質的變化［8］。Clevers團隊［6］首次構建腸道類器官時，將分離的單個Lgr5+干細胞或隱窩放入富含層黏連蛋白并起3D骨架支撐作用的基質凝膠（matrigel）中培養（圖2），加入基礎培養基，并添加必要的細胞生長因子：表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、頭蛋白（Noggin）和R-Spondin1。其中，R-spondin1是Wnt激動劑和Lgr5的配體，Noggin是BMP通路抑制劑，二者都具有促進隱窩數量增加的作用［9-10］；EGF主要促進小腸細胞的增殖。由于結腸類器官缺乏分泌Wnt3A的潘氏（paneth）細胞，必須加入Wnts用以維持干細胞自我更新、分化的能力［11］。相較于鼠源類器官，人源類器官更為復雜。用于培養小鼠來源類器官的培養基無法支撐人源類器官的形成，因此，需要在原來的培養基的基礎上增加胃分泌素（Gastrin）和煙酰胺（Nicotinamide）。其中，煙酰胺對延長類器官的存活時間至關重要。另外，還需要加入A-83-01和SB202190，促進提升類器官的形成。上述生長因子可以維持腸道類器官的生長，但是不能促進分化。除去Wnt3A、煙酰胺和SB202190可以促使結腸類器官分化成各類成熟細胞（圖3）［11］。由于結直腸癌（colorectal cancer，CRC）腫瘤的Wnt信號通路被異常激活，所以構建CRC類器官的培養基只需在正常結腸類器官培養基的基礎上進行修改即可。表1總結了用于構建不同類型的人源、鼠源腸道類器官的培養基成分。

Table 1 Components of intestinal organoids culture medium表1 腸道類器官培養基成分

Fig.2 Growth process diagram of mouse small intestinal organoids圖2 小鼠小腸類器官生長過程圖

Fig.3 Human intestinal organoid cell type composition［11］圖3 人類腸道類器官細胞類型組成［11］

2.2 新興培養材料及方法

腸道類器官的成功構建并運用于疾病機制探究，依賴于培養基能夠有效重現天然腸道的特征，而培養基則需借助外在支架的支撐。由于傳統基質凝膠來源于Engelbreth-Holm-Sarm小鼠肉瘤，其構建的類器官在臨床應用中存在安全隱患，而且該基質凝膠不能有效地重現天然腸道微環境［16］，也無法提供類器官生長及成熟必需的組織特異性信號［17］。為解決基質凝膠在腸道類器官培養中存在的局限性，近年來，許多新興生物材料（表2）被應用于腸道類器官的體外培養。水凝膠作為一種生物材料，其內部結構和孔隙大小均可人為調控，經過不同方法的修飾可以實現類器官的個性化培養。Gjorevski等［18］和Luo等［19］精密設計的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）水凝膠和透明質酸（hyaluronic acid，HA）水凝膠，相對于傳統基質凝膠，二者在生物化學和生物物理特征上得到了更好的控制。PEG水凝膠有效地再現腫瘤細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的機械及化學性質，更加適合患者衍生腫瘤類器官（patientderived organoid，PDO）的培養。HA-明膠水凝膠可以促進腸道干細胞的增殖，更適用于腸道干細胞（intestinal stem cell，ISC）衍生類器官的形成與發展。有研究發現［20］，由纖維蛋白和層黏連蛋白為主要成分的水凝膠上天然存在精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）黏附結構域和層黏連蛋白111。纖維蛋白上RGD的濃度足以促進類器官生長。其中，RGD基序是腸干細胞增殖的必要因子，是促進類器官形成和擴張的關鍵因素。此外，該水凝膠還可以廣泛作為基底膜提取物（basement membrane extract，BME）的等效替代物。另有學者設計出一種脫細胞腸組織衍生的3D水凝膠，額外增加的3種蛋白質增強了腸道ECM微環境，并實現了類器官的長期傳代和移植［21］。水凝膠（2 g/L）中層黏連蛋白111、511、腎連蛋白濃度在0.1 g/L、0.01 g/L、0.01 g/L條件下，類器官的培養具有最高形成率。其中，層黏連蛋白有助于隱窩絨毛單元的形成，腎連蛋白通過特異結合α8β1整合素促進腸隱窩穩態［16］。Gjorevski等［18］指出，只有使用含有基質金屬蛋白酶敏感可降解序列和額外ECM成分的較軟PEG水凝膠構建腸道類器官時，才能使干細胞向類器官方向發展。平滑肌細胞特異性表達的小生境因子——基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）17，通過直接修飾ECM成分和切割生長因子來調節其與ECM和細胞結合的能力［22］，進而介導類器官的生長。微孔陣列［23］和懸滴技術［24］運用了新的懸浮培養方法，提供了更受控的培養體系，實現了更加均勻地培養腸道類器官。相比于將類器官浸入凝膠層的培養模式，微孔及懸滴技術僅將基質膠作為培養基的補充，避免了凝膠包埋帶來的并發癥。同時，因基質膠的用量極其有限，也大大降低了類器官的構建成本。

Table 2 Application of new biomaterials and technical means in intestinal organoid culture表2 新生物材料和技術手段在腸道類器官培養中的運用

3 腸道類器官在常見腸道疾病機制研究中的應用

3.1 炎癥性腸道疾病

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn’s disease，CD），統稱為炎癥性腸道疾?。╥nflammatory bowel disease，IBD），屬于腸道慢性炎癥性疾?。?8］。近年來的研究表明，炎性腸道疾病的起始和延續與腸上皮屏障（intestinal epithelial barrier，IEB）功能的損壞、異常免疫應答、內穩態紊亂和腸道微生物群失調都有緊密聯系，進一步支持了腸道類器官的研究對IBD發病機制探索的重要性［29-30］。

促炎細胞因子，如IL-6、IL-1β、IL-17A、IL-17f等的上調以及緊密連接（tight junction，TJ）錯位會導致上皮屏障完整性的破壞［29，31］。在分子水平上［32］，這些細胞因子會增加CLDN-2、MLCK和STAT1磷酸化，降低E鈣黏蛋白和ILDR-1。Cook等［33］用樣本中提取的Tr1細胞和FOXP3陽性的Treg細胞上清液培養人結腸類器官，發現Tr1細胞和FOXP3陽性的Treg細胞抑制了效應T細胞的增殖和髓系細胞對IL-1β和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）的產生。而且Tr1細胞可以分泌IL-22促進人腸上皮細胞的屏障功能，其細胞培養上清液促進了腸道類器官培養物中產生黏蛋白的杯狀細胞分化。Patnaude等［34］通過培養人腸道類器官（圖4），對極化的T-84細胞單層細胞，進行丁酸鹽共處理和與免疫細胞的類器官共培養，監測微生物衍生的代謝物和炎癥環境對IL-22反應的影響，研究發現，IL-22促進上皮干細胞的擴增與增殖、屏障功能障礙和抗菌肽的產生。Cheng等［35］使用右旋糖酐硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導的結腸炎模型研究uPAR缺乏的小鼠，發現通過藥物抑制uPA-uPAR的相互作用可以保護上皮屏障免受炎癥的誘導損傷，從而確定uPA-uPAR是腸上皮屏障完整性的關鍵因子，表明該配體受體對是預防腸道屏障破壞、促進黏膜愈合的潛在IBD靶點。

Fig.4 Brightfield microscopic images of human colon organoids after 6 d coculture with T-cell supernatants［33］圖4 與T細胞上清液共培養6 d后人結腸類器官的亮場顯微鏡圖像［33］

免疫反應失調、腸道黏膜內穩態的破壞也是IBD發病的重要原因。最新研究發現［36-38］，NF-κB激活、內質網應激增加、未折疊蛋白反應和TLR5激活都會導致免疫反應的異常。Onozato等［39］用人類iPSC成功培養出具有成熟小腸特征的芽狀類器官，發現當用TNF-α治療時，該類器官可以復制黏膜損傷的發病機制。Li等［40］從脫乙酰酶（sirtuin 2，SIRT2）基因敲除小鼠和IBD患者中分離腸隱窩培養類器官，通過檢測發現，SIRT2缺失導致Wnt/β連環蛋白信號通路的過度激活，引起腸道上皮細胞分化失調，加劇炎癥。由此表明SIRT2對維持腸道黏膜內穩態有獨特作用。另有中國學者的研究［41］發現，流蘇石斛多糖通過維護腸黏膜完整性來改善DSS誘導的潰瘍性結腸炎。甄爽［42］將海藻酸鈉-類器官微球移植入UC小鼠體內，發現小鼠的腸炎癥狀得到有效改善，證實類器官移植對于治療腸炎有著可觀的效果，并且能顯著降低促炎細胞因子的表達水平。

新的證據表明，微生物群-宿主的交換作用（cross-talk）調節［37，43］腸道免疫活動和IBD的易感性，腸道菌群和上皮細胞相互作用是影響上皮通透性的關鍵因子，對于維持腸道屏障完整、防止小分子和細菌進入到宿主體至關重要。同時，腸道微生物群還可以作為外部調節影響免疫內穩態。因此，可以利用腸道類器官模擬體內腸道微生態，促進有關腸道菌群和腸道上皮細胞互作的研究。Giri等［37］在IBD的背景下通過體外篩選能夠抑制NF-κB的細菌。使用基于類器官的體外方法，鑒定了5株梭狀芽孢桿菌，它們在腸道上皮類器官中可以抑制免疫介導的NF-κB激活。

3.2 結腸直腸癌

作為世界第三致命的惡性腫瘤疾病和第四大最常見的診斷癌癥［44-45］，結腸直腸癌的致死率在中國癌癥死亡率中也高居第三位，而且該癌癥的發病率及死亡率逐年提高，并趨于年輕化。目前認為，大多數結直腸癌來源于癌變的干細胞［46］?；蚝捅碛^遺傳學的改變，通過不斷積累使抑癌基因失活，并激活癌基因，最終產生癌癥干細胞，癌癥干細胞是腫瘤形成和維持的關鍵因素。

Wang等［47］通過建立患者衍生的腫瘤類器官，并進行單細胞RNA序列分析，發現PDO在轉錄組水平上與體內上皮細胞相似，并且忠實地保留了疾病特異性基因的表達，可以對不同階段的癌癥的發展因素進行針對性分析，是研究癌癥分子機制的有力平臺［47-49］。但是，傳統培養基難以滿足腫瘤類器官對特定微環境的需求［25］。有研究發現，癌相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）有助于腫瘤的進展，將CAFs和CRC-PDO在HA-明膠水凝膠中共同培養的方法（圖5），相較于單獨構建PDO的傳統培養方式，使得CRC-PDO保留了原始患者腫瘤的關鍵分子特征，并在CAFs的介導下，與基質間的交互作用得到重現［19］。Shin等［50］構建了PDO和小鼠結腸炎誘導的腫瘤類器官，與對照組相比，腫瘤組織中的DKK2表達增加100倍，證明DKK2是Lgr5+在結腸癌干細胞中表達的必要因子，且從分子機制上證明了SMAD4、TP53、APC和KRAS基因序列突變顯示APC的敲除使DKK2激活C-Src，降解HNF4α1蛋白，進而促進Lgr5+的表達。Naruse等［51］利用小室系統的新培養模式，構建CAF-CRC PDO類器官，通過DNA微陣列分析發現包括REG家族和DUOXs等多種基因表達上調2倍以上，導致腫瘤細胞大量增殖，引發癌癥。另有研究組通過整合基因組、轉錄組和磷酸化蛋白質組多組學的方法，在不同階段、不同生長狀況條件下對患者衍生結腸類器官進行特征化。經過RNA序列實驗確定有5 125個在腫瘤中與正常類器官表達不同的轉錄物，尤其是PTEN途徑［52］。最新研究發現，有近20%的新確診CRC患者出現結腸直腸癌肝轉移（colorectal cancer liver metastasis，CRLM）的情況，Mo等［53］對來自多組學水平的CRLM-PDO進行全面分析，發現該類器官平臺可以捕捉患者內和患者間的異質性并預測患者的化療反應，顯示了在個性化醫療中的潛在應用價值。

Fig.5 Brightfield microscopic images of CRC-PDO in hydrogel derived from different patients［19］圖5 水凝膠中不同患者來源的CRC-PDO亮場顯微圖像［19］

3.3 乳糜瀉

乳糜瀉（celiac disease，CeD）是一種遺傳因素決定的，由麩質等環境因素誘發的小腸炎癥性疾?。?4］，患者癥狀通常表現為因絨毛萎縮引起小腸黏膜損失而導致的營養吸收不良。研究表明，乳糜瀉的發病與易感性基因［55］、麩質觸發免疫反應［56］都有緊密聯系。

乳糜瀉作為一種多基因易感性炎癥腸病，位于主要組織相容性復合物（major histocompatibility composites，MHC）上的人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DQ2和HLA-DQ8基因型的個體具有CeD遺傳易感傾向［55，57］，其中HLADQ2.5發病的風險最高［58］。Dieterich等［59］從健康組和CeD患者體內分離十二指腸隱窩干細胞培養類器官，發現兩組類器官表型及基因表達的巨大差異，并證明其原因是表觀遺傳修飾，從而解釋了CeD中錯亂的隱窩/絨毛軸發育。雖然有約30%的人群具有HLA-DQ2或-DQ8的遺傳傾向，但實際上只有極小一部分人會真正發生CeD［60］。因此，對該疾病發生的其他因素的探究就顯得尤為重要。Freire等［61］成功地構建CeD患者的腸道類器官（圖6），與健康對照組的類器官相比，發現乳糜瀉發病與先天免疫反應顯著相關。從機理上講，麩質部分分解產生的降解產物與tTGA形成復合物，被HLA-DQ2或HLA-DQ8傳遞給免疫細胞，從而產生抗tTGA及抗AGA抗體，引發炎癥［62］。另外，γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）及TG2也會對腸組織造成破壞，TG2在HLA-DQ2或HLA-DQ8存在時，會增強抗麥膠T細胞的反應，而且HLA-DQ8可以促進并放大IFN-γ下游通路［55］。Serena等［63］構建患者來源的腸隱窩類器官，并用經消化的醇溶蛋白刺激類器官，發現醇溶蛋白會引發腸上皮細胞釋放大量促炎因子，如INF-γ，加劇CeD發生。同時，Serena等還強調了CeD患者先天免疫機制的改變，從根本上導致其對麩質耐受性的喪失。

Fig.6 Patient derived duodenal organoids［61］圖6 患者來源的十二指腸類器官［61］

4 腸道類器官用于藥物研發與篩選

藥物開發成本高且耗時長，很多情況下新藥的開發往往難以成功。動物模型的缺陷使大部分藥物不能應用于人體，這使得選擇適合的藥物開發模型顯得尤為重要［64］。而藥物能否應用于臨床階段，由本身的安全性質決定。因而，必須對研發的不同藥物進行篩選［65］。類器官的出現，為藥物的研發與篩選提供了一個全新且可靠的平臺。腸道上皮存在大量藥物代謝酶和外源加工蛋白，是藥物吸收和代謝的重要部位，對藥物的口服生物利用度起著至關重要的作用［2，66］。Xu等［32］利用CD患者衍生的腸類器官（圖7）研究發現，CS-潑尼松龍可以降低CLDN-2、MLCK和STAT1的表達，提高E鈣黏蛋白和ILDR-1的表達，對細胞因子引起的屏障功能破壞具有直接預防作用?；颊哐苌念惼鞴倏梢灾噩F原始腫瘤的遺傳學和組織學特征，并有效體現患者對藥物的反應。Du等［67］利用高密度平板形式進行類器官培養，加速了基于類器官研究的藥物研發，同時大幅降低了大規模篩選的成本。由此說明，腸道類器官作為藥物研發與篩選的平臺具有極高的靈敏性，其在藥物研發及篩選中的優勢盡顯無疑。

Fig.7 Representative FITC-D4 penetration or brightfield microscopic images of intestinal organoids after treatment［32］圖7 經處理后腸類器官的代表性FITC-D4滲透或亮場顯微圖像［32］

5 結論與展望

目前，國內外研究主要采用Lgr5+干細胞和多能干細胞進行腸道類器官的構建［68］，結合生物材料創造新的外基質以維持類器官的生長，并不斷探索基質中不同生長因子的比例及培養時間，以求最大程度地重現腸道內環境，旨在提供一個更精確的模型模擬腸道生理結構，檢測疾病進展狀況，探究其發病機制。雖然腸道類器官本身仍舊存在一些局限，但是相比于傳統體外模型，類器官具有極大的模型優勢與應用價值。在疾病機制探索方面不斷提供新的見解，逐漸取代動物模型作為藥物研發與篩選的工具。同時，腸道類器官在宿主-病原體相互作用、組織再生、腫瘤個性化治療等方面也有廣泛的應用。