馬錢子致大鼠體內毒性的研究*
——“裝袋”算法和16S rRNA基因測序技術在毒理學研究中的應用

王曦燁 寶樂爾 姜明洋 李丹 白梅榮

（1）內蒙古民族大學化學與材料學院，通遼 028000；2）內蒙古民族大學，天然產物化學及功能分子合成重點實驗室，通遼 028000；3）內蒙古自治區藥品檢查中心，呼和浩特 010000；4）內蒙古民族大學計算機科學與技術學院，通遼 028000；5）內蒙古民族大學蒙醫藥研發工程教育部重點實驗室，通遼 028000）

毒理學是研究外源性因素對生物系統有害影響的學科。毒理學主要研究化學物質對生物體的毒性反應、嚴重程度、頻率和毒性機制，并對毒性效應進行定性和定量評估。毒理學研究的主要目的是預測毒物對人體和生態環境的危害，為確定安全閾值和采取預防措施提供科學依據［1］。馬錢子（Strychnos nux-vomicaL.，SN）是一種傳統的中藥材，是馬錢的干燥成熟種子。馬錢子經過加工后用作藥物，能夠疏通絡脈、散結，從而減輕腫脹和疼痛。馬錢子具有廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、抗炎和鎮痛等，但由于含有馬錢子堿、士的寧和其他類型生物堿，馬錢子具有靶器官毒性，主要包括肝毒性和腎毒性，這嚴重限制了馬錢子的臨床應用［2-3］。因此，有必要全面深入了解馬錢子的體內致毒機制。遺憾的是，對馬錢子毒性引起的內源性代謝變化知之甚少。馬錢子的毒性反應主要與其含有的馬錢子堿、士的寧等活性成分有關。

目前，高級化學計量學方法已廣泛應用于化學研究中［4-6］。代謝組學是一個以化學計量學為基礎的重要研究領域。代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學之后的一門新興學科，是系統生物學的重要組成部分。近年來，代謝組學迅速發展并滲透到許多領域，如疾病診斷、藥物研發、毒理學、環境科學，以及與人類健康保健密切相關的其他領域。代謝組學研究涉及在一定時間收集細胞中的所有代謝產物。代謝產物反映細胞環境，與細胞的營養狀態、藥物的影響、環境污染物和其他外部因素密切相關［7-9］。裝袋算法是一種基于機器學習的群體學習算法。與傳統的代謝組學分類算法相比，裝袋算法更適合于對具有小樣本量、高維度和稀疏特征的數據進行分類［10］。臨床上將30個樣本以下稱為小樣本，而30個以上稱為大樣本。代謝組學動物實驗一般包含3個基本組（即正常組、模型組、給藥組，每組8個樣本，共24個樣本），屬于小樣本范疇。由于數據的樣本量較少且變量極多（幾千維甚至上萬維），導致數據難以直接進行分析。裝袋算法在處理小樣本量、高維度數據過程中不損失原始數據信息、準確率高且結果能夠得到有效驗證［11］。因此，該算法近年來在毒理學研究中得到了廣泛應用。毒性目標生物分子相互作用的特異性導致許多毒性數據集的特征非常不平衡，這是基于結構活性關系的化學分類結果不佳的直接原因。Idakwo等［12］使用隨機森林作為分類器，以裝袋算法作為集成策略，并將隨機森林與合成少數類過采樣技術（SMOTEENN）學習方法相結合，應用于對高度不平衡的Tox21數據集進行分類。結果表明，該學習方法可以顯著改善不平衡的化學毒性分類結果，為了調節毒理學中預測不同營養水平下各種試驗物種的急性毒性，Singh等［13］開發了多個物種定量構效關系的數學模型，并且這些基于集成學習方法的分類和回歸模型使用裝袋算法作為內置算法。結果表明，該模型對于物種的完整數據集具有較高的分類精度（97.82%）。此外，該模型對不同營養水平的不同試驗物種具有良好的預測能力，可用于預測新化學品的毒性。目前，將裝袋算法融入到代謝組學中以解決生物化學及毒理學方面的問題鮮見報道。Wang等［14］將裝袋算法融入代謝組學分析中對蒙藥忠倫-5治療類風濕關節炎數據集進行分類，處理來自健康對照組、模型組及給藥組的數據。結果表明，在不同組成的訓練樣本和測試樣本集中應用裝袋算法均得到較高的分類準確率，但該研究未對后續的生物標記物篩選及代謝通路的驗證做進一步的說明。如果將裝袋算法應用于組學數據的分類和計算，不僅可以進一步挖掘毒物的生物學信息，顯著提高數據分類的準確率，而且對于藥物代謝組學研究方法的擴展和大數據研究的深化都具有重要意義。

人體腸道中寄生著大約10萬億個細菌，它們可以影響人體體重和消化，抵御感染并降低自身免疫疾病的風險［15］。然而，腸道菌群與肝病、腎病和肝腎綜合征密切相關［16-18］。與化學藥物和生物制劑相比，中藥靶點多，作用機制復雜，其藥理和毒理學機制可能與人體腸道菌群有關［19］。因此，研究藥物毒性機制與腸道菌群的關系，對于全面客觀地了解中藥具有重要意義。

本研究以灌胃馬錢子的大鼠為毒理學研究對象。首先，使用急性、蓄積性和亞急性毒性試驗確定馬錢子的毒性劑量、毒性強度和毒性靶器官；然后，將裝袋算法融入到代謝組學研究中，分析馬錢子灌胃前后大鼠血清、肝臟和腎臟中的內源性生物小分子的代謝變化，并提高樣本分類的準確率，識別與毒性相關的內源性標記物；最后，通過灌胃后腸道菌群的變化建立各菌群與肝腎毒性之間的聯系。本研究的目的是闡明中藥馬錢子的體內致毒機制，并為其臨床上的安全、合理使用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

馬錢子（批號20200634）由內蒙古民族大學附屬醫院制劑室提供，在實驗之前制備不同濃度的藥物水溶液；乙腈和甲酸（色譜純，美國Thermo Fisher公司）；去離子水由Milli-Q純水儀制備（美國Millipore公司）；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）檢測試劑盒（批號43546001）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）檢測試劑盒（批號44713101）、尿素氮（UREAL）檢測試劑盒（批號48268901）、肌酐（CREP）檢測試劑盒（批號47756001）均購自羅氏診斷產品（上海）有限公司；甲醛（批號20180606）購于北京益利精細化學品有限公司；瓊脂糖購于西班牙Biowest公司；建庫試劑盒購于美國Bioo Scientific公司；測序試劑盒購于美國Illumina公司。利福昔明（rifaximin）購于通遼利群藥店。

超高效液相色譜儀（Nexera UHPLC LC-30A，日本島津公司）+質譜儀（Triple TOF 5600+，美國AB SCIEXTM公司）；色譜柱為Waters BEH HILIC Column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國沃特世公司）；漩渦振蕩器（M16710-33，美國Thermo Fisher公司）；超聲波清洗儀（KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司）；臺式高速冷凍離心機（Microfuge22R，美國Beckman Coulter公司）；超微量分光光度計（NanoDrop2000，美國Thermo Fisher公司）；酶標儀（BioTek ELx800，美國Biotek公司）；電泳儀（DYY-6C，北京六一生物技術有限公司）；PCR儀（ABI GeneAmp?，美國ABI公司）；測序儀（Illumina Miseq，美國Illumina公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物

本實驗研究經內蒙古民族大學附屬醫院倫理委員會批準（NMMZDX2021［K］0155）。昆明種大鼠（SPF級，雌雄各半，體重（20±2） g）由遼寧長生生物技術股份有限公司提供（合格證號：SCXK（遼）2015-0001）。動物飼養于內蒙古民族大學蒙醫藥學院動物實驗室（室內溫度20~25℃，濕度40%~60%）。

1.2.2 急性毒性實驗

a. 預實驗

通過預實驗來確定100%死亡劑量（Dm）和0%死亡劑量（Dn），為正式實驗提供基礎數據。在Dm和Dn范圍內選個劑量（n=5），計算各組劑量公比r（公式：）和組距k（公式：k=1/r）。

b. 正式實驗

取昆明大鼠50只，雌雄各半，按體重和性別隨機分為5組，每組均為10只小鼠（馬錢子不同劑量給藥組：A1~A5）。實驗前禁食不禁水12 h，利用預實驗所計算出的不同給藥劑量對小鼠灌胃給藥馬錢子。給藥后連續觀察7~14 d，詳細觀察并記錄中毒表現，如中毒出現的時間、持續時間、恢復時間、最短、最長及平均死忙時間，死忙動物數量等。用Bliss程序計算各組小鼠的半數致死量LD50和LD50的95%可信限。

同時，選取昆明大鼠50只，給予馬錢子和利福昔明連續灌胃14 d（利福昔明劑量為50 mg·kg-1·d-1）［20］，其余步驟同上。

1.2.3 蓄積毒性實驗

40只昆明大鼠（雌雄各半）按體重和性別隨機分為正常組、馬錢子組，每組均為20只大鼠。給藥前12 h禁食不禁水。給藥劑量以4 d為1個階段，第1個階段每只動物每天給藥劑量為LD50的1/10，以后各階段依次遞增1.5倍，直至該組動物死亡一半，同時正常組每日給予與實驗組相同劑量的蒸餾水，實驗最后1 d計算馬錢子的蓄積系數（蓄積系數K=累積劑量/LD50）。

1.2.4 亞急性毒性實驗

將30只昆明雄性大鼠隨機分為正常組、馬錢子高和低劑量組共3組，每組10只。采用經口灌胃染毒法，染毒劑量分別為馬錢子高劑量（0.102 9 g/kg）、低劑量（0.051 4 g/kg），染毒1次/d，連續4周，同時正常對照組每日給予與實驗組相同劑量的蒸餾水。實驗最后1 d染毒前，12 h禁食不禁水，染毒30 min后，對大鼠進行麻醉，從腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，待測血清中ALT、AST、UREAL和CREP等生化指標。取各組大鼠臟器，生理鹽水漂洗并用濾紙擦干，稱重，取適當肝臟和腎臟固定制作石蠟切片，HE染色，進行組織病理學檢查。

1.2.5 代謝產物的前處理

大鼠麻醉腹主動脈取血后，3 000 r/min離心10 min，分離血清，而后立即取100 μl血清樣本加入300 μl冷乙腈，震蕩提取30 min，在12 000 r/min，4℃下離心10 min，取出100 μl在37℃下真空離心濃縮至干。殘渣用100 μl乙腈溶解，于12 000 r/min，4℃下離心10 min，取上清液進樣10 μl，用于UPLC-MS檢測。質控（quality control，QC）樣品為所有樣品分別取10 μl進行混合，每8個樣品加1個質控樣品進行穩定性考察。

將研磨玻璃珠和100 μl冷乙腈添加到50 mg腎臟或肝臟樣品中，粉碎3 min。將樣品添加到900 μl冷乙腈中，振蕩提取30 min，4℃下離心10 min。收集100 μl樣品，37℃下真空離心濃縮干燥。將殘余物溶解在100 μl乙腈中，4℃下12 000 r/min離心10 min。上清液待測。

1.2.6 色譜和質譜分析條件

色譜分析條件：柱溫為35℃，流速為0.300 ml/min。流動相：A，0.1% 甲酸水+1 mmol/L乙酸銨；B，乙腈。流動相梯度組成：0~16 min，5%~50%B；16~20 min，50%B；20~21 min，50%~95%B；21~22.5 min，95%B。

質譜分析條件：分別采用電噴霧電離正離子和負離子模式進行檢測，條件如下：離子源溫度500℃（正離子）和450℃（負離子），毛細管電壓5.5 kV（正離子）和4.4 kV（負離子），掃描范圍m/z為100~1 200 u，子離子（破碎離子）掃描范圍m/z為50~1 000 u，子離子累積掃描時間為0.01 s，二級質譜選用IDA，“高靈敏度”模式，去簇電壓±60 V，碰撞能（35±15）eV。

1.2.7 潛在生物標志物篩選及解析

通過MS-DIAL 4.10軟件進行預處理，包括峰提取、去噪音、反卷積，峰對齊，導出CSV格式的三維數據矩陣（原始數據矩陣），再將原始數據導入Matlab 2012軟件進行數據分類處理。將提取的峰信息與數據庫進行比對，對MassBank（http://www.massbank.jp/，一個高質量的質譜數據庫，旨在公開分享從代謝物的化學標準品得到的質譜圖以方便用戶進行代謝物的鑒定，包含了代謝物的質譜信息以及采集情況）［21］、HMDB（https://hmdb.ca/，加拿大代謝組學創新中心（TMIC）創立的人體代謝組學綜合數據庫，是最常用的代謝組數據庫之一，收錄內容包括物質的化學信息、臨床數據分子生物學數據等超過11萬種代謝物的信息）［22］、GNPS（https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnpssplash.jsp，基于Web的質譜生態系統平臺，旨在成為全球范圍內組織共享原始、處理或注釋碎片質譜數據 （MS/MS） 的開放訪問數據庫）［23］三個庫進行全庫檢索，篩選生物標記物，這個三維矩陣包括的信息有：樣品信息、保留時間、質核比和質譜響應強度（峰面積）。生物標記物篩選條件有：P≤0.05且變量權重值（VIP）≥1；P≤0.05且含量變化倍數（FC）≥1.5或≤0.67。利用HemI軟件進行生物標記物的熱圖分析［24］，利用Cytoscape 3.2.1軟件建立藥物、生物標記物之間的網絡關系圖，將篩選出的差異代謝產物導入MBRole 2.0軟件進行通路富集分析。

1.2.8 代謝組學數據的分類過程

a. 基于裝袋算法分類模型的描述

本文使用裝袋算法的目的是對馬錢子灌胃給藥前后大鼠血液、肝臟和腎臟樣品的代謝組學數據進行分類［14］。數據集由12組樣本組成（正離子條件下正常組和馬錢子給藥組（血液）；負離子條件下正常組和馬錢子給藥組（血液）；正離子條件下正常組和馬錢子給藥組（肝臟）；負離子條件下正常組和馬錢子給藥組（肝臟）；正離子條件下正常組和馬錢子給藥組（腎臟）；負離子條件下正常組和馬錢子給藥組（腎臟）），每組由8只大鼠組成。在血液代謝數據中，正離子條件下樣本數據的維數為2 143，負離子條件下樣本數據的維數為716；在肝臟代謝數據中，正離子條件下樣本數據的維數為4 112，負離子條件下樣本數據的維數為1 226；在腎臟代謝數據中，正離子條件下樣本數據的維數為1 668，負離子條件下樣本數據的維數為506。

本文采用裝袋算法完成代謝組學數據的重采樣，即在原始代謝組學數據集上，通過有放回抽樣重新選出k個新數據集來訓練分類模型。利用訓練出來的多個分類器集合來對代謝組學樣本進行分類，然后用多數投票或者對輸出求均值的方法統計所有分類器的分類結果，結果最高的類別即為最終標簽。該方法能夠減少單一分類模型容易過擬合的問題，增強學習效果，提高預測準確率。

在實驗過程中，為了提高模型的差異性，裝袋算法在訓練待組合的各個模型的時候是從訓練集合中隨機抽取數據。對于裝袋算法來說，隨機采集和訓練集樣本數n一樣個數的樣本，得到的采樣集和訓練集樣本個數相同，但是樣本內容不同。如果對有n個樣本的訓練集做k次隨機采樣，則由于隨機性，k個采樣集各不相同。該方法通?？紤]的是同質弱學習器，相互獨立地并行學習這些弱學習器，并按照某種確定性的平均過程將它們組合起來。

如果建立一個由k個分類模型組成的集成模型，假設每個模型在每個樣本上的誤差是?i，該誤差服從均值為零，方差為協方差為E=［?i?j］=c的多維正態分布。通過所有集成分類模型得到的平均預測誤差是平方誤差的數學期望是：

當在誤差完全相關（c=v）的情況下，均方誤差減少到v，所以集成模型沒有任何的效果。如果在錯誤完全不相關（c=0）的情況下，該集成平方誤差的期望僅為1/k*ν，這意味著集成平方誤差的期望會隨著集成規模增大而線性減小。換句話說，集成方法至少應與其中的任何一種方法表現得一樣好，并且如果每一個單獨模型的誤差是獨立的，則集成方法將比其他單一方法表現得更好。

b. 裝袋算法結合決策樹和KNN模型解決數據分類問題

代謝組學數據具有高維、稀疏，且變量的維度遠遠大于樣本數量的特點。同時，受限于醫學實驗成本的限制，獲取到的數據量是有限的，這樣就給此類數據分類模型的建立帶來了很大的困難。對于裝袋算法來說，可以在不同數據集上訓練模型降低分類器的方差，也就是說，裝袋算法可以預防過擬合。裝袋算法的有效性來自不同訓練數據集上單獨模型的不同，它們的誤差在投票過程中相互抵消?；谏鲜鲈?，本文采用裝袋算法結合決策樹和K最近鄰（K nearest neighbor，KNN）模型解決代謝組學數據的分類問題。K最近鄰算法是一種監督分類算法。如果一個樣本在特征空間中有K個最相似的樣本，并且這些樣本中的大多數屬于某一類別，那么這個樣本也屬于這一類別［25-26］。

c. 通過訓練集和測試集實驗得到分類準確率

本文從原始樣本集中使用裝袋算法隨機抽取n個訓練樣本，共進行k輪抽取，得到k個訓練集（k個訓練集之間相互獨立，元素可以有重復）。對于n個訓練集，訓練k個決策樹和KNN模型，最終分類結果由多數投票的方法產生。在每次實驗中，樣本數據被分為訓練集和測試集，隨機抽取訓練樣本數量n與訓練集樣本數量相同，其余的測試集樣本用于驗證模型的分類準確率。同時，通過選擇不同訓練集和測試集數據的比例，完成不同訓練集和測試集的分類實驗。

1.2.9 大鼠糞便細菌中總DNA提取與PCR擴增

a. 總DNA提取和檢測

按照1.2.4亞急性毒性實驗動物處理法，無菌條件下每組收集8只大鼠糞便。利用NanoDrop2000檢測DNA純度和濃度；利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

b. PCR擴增

擴增目標區域為16S V3-V4區，上下游引物序列分別為338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG），806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。

PCR反應參數：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環；72℃延伸10 min。

c. PCR產物鑒定、純化及定量

利用瓊脂糖凝膠電泳檢測產物，每個樣本3個PCR重復，將3個重復的PCR產物混合；利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進行PCR產物純化；利用QuantusTMFluorometer對PCR產物進行定量分析；利用NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit構建Miseq文庫，利用Miseq PE300軟件平臺進行測序。

1.2.10 腸道菌群代謝數據的統計處理

使用Qiime2軟件對全部有效的序列進行聚類/去噪，形成特征序列（OTU）。通過與Greengenes Database 13_8，Silva release 132以及UNITE數據庫進行比對獲得物種注釋信息?；贠TU的絕對豐度及注釋信息，對不同組別樣品在門、綱、目上的群落結構進行統計分析；同時，建立門這個級別上腸道菌群與肝、腎生化指標之間的聯系，用以說明灌胃馬錢子后肝、腎及腸道菌群發生的相應變化。

2 結果與討論

2.1 急性毒性試驗

預實驗中，給藥30 s后各組大鼠出現中毒癥狀，主要表現為焦躁、呼吸急促、心跳加速、全身顫抖、抽搐、最終下肢伸直、上肢彎曲而死亡。死亡時間通常在給藥后的5~10 min左右，若30 min內不死則恢復正常。毒性癥狀的輕重、死亡快慢及死亡率的高低與給藥劑量的大小直接相關。馬錢子的Dm=271.01 mg/kg，Dn=109.70 mg/kg，r=1.25，k=0.80。

正式實驗中，馬錢子的LD50值為176.02 mg/kg，LD50的95%可信限為155.18~200.69 mg/kg（表1）。

Table 1 Experimental results for the acute toxicity of SN

2.2 蓄積毒性試驗

蓄積毒性是指藥物多次少量進入機體后，通過代謝而排出或直接排出，但固定時間內連續反復進入機體時的消化速率超過代謝變化和排泄速率時，藥物在體內蓄積量逐漸增加而出現毒性。蓄積作用為出現慢性毒性的基礎，通過蓄積毒性實驗能夠進一步揭示馬錢子的毒性特征。

蓄積毒性實驗中，給藥后第4階段開始出現大鼠死亡現象，死亡的數量是第5階段組的一半。此時，大鼠用藥總量為1 329.20 mg/kg，蓄積系數K＞5，出現了弱蓄積性（表2）。

2.3 亞急性毒性試驗

亞急性毒性試驗是通過連續3~4周定量給藥，研究與藥物急性毒性試驗結果不同的毒性表現和特點，該實驗在毒理學研究中是不可缺少的。由于中藥療程長，亞急性中毒試驗占有重要地位。為探討馬錢子的毒性反應性質、量效關系及時效關系，本實驗通過給大鼠連續4周灌胃，研究其毒性作用特點。

Table 2 Statistics of total death in the cumulative toxicity test with SN

連續給藥4周后，與正常組比較，馬錢子高劑量組的AST、ALT和UREAL含量顯著升高，說明肝功能及腎功能指標異常（表3）。

組織病理學檢查結果顯示，正常組肝組織肝小葉結構清晰，組織由膜彈性纖維的致密結締組織構成，肝細胞圓潤、飽滿，肝板排列規則、整齊，未見明顯的炎性改變（圖1a）。正常組腎小球分布均勻，未見明顯系膜細胞和基質增生，未見明顯的結締組織增生和炎性細胞浸潤（圖1d）。馬錢子可導致肝組織中少量的肝細胞輕度空泡變性，胞質疏松淡染，可見大小不一的水泡（圖1b，c）。馬錢子組的腎組織中部分腎小球可見系膜細胞和系膜基質輕微變多，少量腎小管管腔可見嗜酸性物質（圖1e，f）。因此，病理變化表明肝臟和腎臟是馬錢子的毒性靶器官。由于高劑量馬錢子組引起的臟器病理變化更為明顯（圖1b，e），因此，接下來的代謝組學實驗選擇高劑量（0.102 9 g·kg-1·d-1）作為實驗劑量。

Fig.1 Histopathological changes of the liver (a-c) and kidney (d-f) in rats owing to the subacute toxicity of SN

Table 3 Biochemical indices based on the SN subacute toxicity test（x±s）

2.4 基于裝袋算法的數據分類結果

連續灌胃馬錢子（0.102 9 g·kg-1·d-1）4周后，采用超高效液相色譜-質譜的正離子和負離子模式分別分析大鼠血液、肝臟和腎臟樣品，獲得了各組樣品總離子流色譜圖（圖2）。

Fig.2 Total ion flow chromatogram of blood (a, b), liver (c, d) and kidney (e, f) after intragastric administration to rats

在不同組的主成分分析（principal component analysis，PCA）得分圖（圖3）中，QC樣本聚集在一起（幾乎重疊），這表明在質譜序列分析期間儀器性能穩定，方法可靠，可以進行后續數據分析。

作為一種無監督的模式識別方法，PCA可以顯示數據的原始狀態，并直觀反映不同樣品間的整體差異。馬錢子組和正常組（肝臟）之間存在明顯的分離邊界（圖4b）。正常組和馬錢子組（血液、腎臟）大鼠的代謝輪廓略有重疊，但有明顯的分離趨勢（圖4a，c）。這些結果表明，馬錢子顯著影響血液、肝臟和腎臟的代謝過程。然而，PCA有時會存在樣本歸屬不明確的問題。例如，盡管正常組和馬錢子組的樣本趨于分離，但很難確定重疊部分樣本的歸屬（圖4a）。錯誤的樣本分類會導致篩選出錯誤的生物標志物，并進一步影響代謝通路的推斷。因此，下一步將裝袋算法應用于組學數據的處理過程。

Fig.3 PCA score plots obtained from the metabolic profiles of blood group (a), liver group (b), kidney group (c)and QC group (d)

Fig.4 PCA score plots obtained from the metabolic profiles of the control group (C), SN group (S) and SN+rifaximin group(S+ rifaximin)

表4列出了決策樹和KNN數據分類結果（未使用裝袋算法作為內置算法）。通常來說，訓練樣本的數量越大，模型越可靠，分組準確率越高。決策樹的分類結果優于KNN。使用72個訓練樣本和24個測試樣本，決策樹模型的分類準確率為87.50%（21/24，24個樣本中的21個樣本正確分組），KNN模型的分類正確率為79.17%（19/24）；使用60個訓練樣本和36個測試樣本，決策樹模型的分類準確率為83.33%（30/36），KNN模型的分類正確率為77.78%（28/36）；使用48個訓練樣本和48個測試樣本，決策樹模型和KNN模型的分類準確率分別為81.25%（39/48）和77.08%（37/48）；使用36個訓練樣本和60個測試樣本，決策樹模型的分類準確率為78.33%（47/60），KNN模型的分類正確率為73.33%（44/60）。

Table 4 Results of metabonomics data classification（exclusion bagging algorithm）

表5列出了基于裝袋算法的決策樹和KNN數據分類結果。使用72個訓練樣本和24個測試樣本，決策樹模型的分類準確率為95.83%（23/24，24個樣本中的23個樣本正確分組），KNN模型的分類正確率為87.50%（21/24）；使用60個訓練樣本和36個測試樣本，決策樹模型的分類準確率為91.67%（33/36），KNN模型的分類正確率為83.33%（30/36）；使用48個訓練樣本和48個測試樣本，決策樹模型和KNN模型的分類準確率分別為89.58%（43/48）和83.33%（40/48）；使用36個訓練樣本和60個測試樣本，決策樹模型的分類準確率為88.33%（53/60），KNN模型的分類正確率為80.00%（48/60）。實驗結果表明，在使用裝袋算法的情況下，決策樹和KNN模型的分類準確率顯著高于未使用裝袋算法的情況，這說明裝袋算法有助于提高組學數據的分類準確率。

Table 5 Results of metabonomics data classification （including bagging algorithm）

2.5 主要生物標志物的分析

火山模型用于篩選潛在的生物標志物（圖5）。在正離子模式下篩選出2個血液生物標志物（尿素、肌酐）；在正離子模式下篩選出2個肝臟生物標志物（甘油單油酸酯、β龍膽二糖），負離子模式下篩選出6個肝臟生物標記物（D-（+）-半乳糖、果糖、海藻糖、帕拉金糖、麥芽糖、華蟾毒精）；在正離子模式下篩選出2個腎臟生物標志物（L-谷氨酸、次黃嘌呤核苷）。這些標記物可能是馬錢子產生體內毒性的根源。圖6顯示了不同組別生物標志物的熱圖，生物標志物信息見表6。

Fig.5 Volcano map for screening the biomarkers (pink dots represent biomarkers with significant changes)

Fig.6 Heatmap of the potential biomarkers that can be regulated by SN

Table 6 Potential biomarkers between the control group and SN group

2.6 血液及肝腎生物標志物的毒性分析

體內多余的氮在肝臟中轉化為尿素，尿素在尿液中被當作廢物處理。某些疾病發生時，體液（如血液）中的尿素濃度會發生變化，因此，尿素的鑒定在醫學診斷領域具有重要意義［27］。高濃度尿素會導致各種嚴重的疾病，如消化不良、潰瘍、癌癥、腎功能不全、腎功能衰竭和尿路梗阻等。此外，體內尿素濃度低于正常值可能會導致肝衰竭、腎病綜合征、惡病質和其他疾?。?8］。肌酸是肌肉代謝的產物，血清肌酐的臨床檢測是了解腎功能最常用的方法之一。當腎功能不全時，肌酐累積并成為對人體有害的毒素［29］?？傊?，血液中尿素和肌酐代謝異常表明馬錢子可能導致腎功能發生病變。因此，有必要研究腎臟中的代謝產物，以進一步確定馬錢子在體內的致毒機制。

通路富集分析顯示，與馬錢子毒性相關的肝臟生物標志物涉及多種代謝通路，如精氨酸和脯氨酸代謝、ABC轉運、蛋白質消化和吸收、維生素消化和吸收，氨酰tRNA生物合成，以及癌癥的中心碳代謝等（圖7a）。

Fig.7 Bubble diagram of the metabolic pathway based on liver (a) and kidney (b) samples from rats

通路富集分析顯示，與馬錢子毒性相關的腎臟生物標志物涉及多種代謝途徑，如蛋白質消化和吸收、ABC轉運蛋白、精氨酸和脯氨酸代謝、突觸囊泡循環和嘌呤代謝等（圖7b）。

肝臟是參與糖代謝的主要器官，糖代謝紊亂能夠導致肝臟胰島素抵抗［30］。此外，糖代謝的紊亂可能導致慢性丙型肝炎［31］。帕拉金糖是一種蔗糖類似物，其消化速度比蔗糖慢，與蔗糖相比，攝入帕拉金糖可以減少肝臟脂肪生成，更好地維持膽固醇穩態［32］；海藻糖對蛋白質和細胞膜具有一定的保護作用，并因其對肝臟損傷的保護作用而引起了廣泛關注，海藻糖通過抑制炎癥信號、增強抗氧化防御和誘導自噬來保護肝臟［33］；果糖被認為是非酒精性脂肪性肝病的主要媒介，臨床研究發現，果糖含量與炎癥和纖維化程度之間存在顯著相關性，果糖誘導許多信號通路，如促進炎癥、纖維化等，這表明果糖對肝臟有損害作用，此外，果糖是肝癌發生的危險因素［34］，果糖主要在肝臟代謝，有證據表明它在小腸代謝時會導致腸上皮屏障惡化，果糖對肝臟代謝產生負面影響，這在腸-肝軸的病理學中起著關鍵作用［35］；衰老與肝臟的形態和功能變化有關，D-半乳糖可誘導機體衰老，并對肝臟造成各種有害影響［36］?？傊?，馬錢子引起的糖代謝紊亂可能進一步導致肝損傷，這可能是馬錢子產生肝毒性的機制之一。

谷氨酸是生物體的主要代謝產物，在各類代謝途徑中具有重要意義。谷氨酸是一種參與氮代謝的堿性氨基酸，它在氮同化、氨基酸生物合成和某些胺分解代謝中起關鍵作用［37］。因此，馬錢子引起的谷氨酸代謝紊亂可能導致一系列腎毒性。次黃嘌呤核苷也稱為肌苷，它是一種以次黃嘌呤為基礎的核糖核苷。轉錄組中的腺苷脫氨基導致肌苷的形成，這被稱為A-to-I RNA編輯。A-to-I RNA編輯在RNA代謝的各個方面都發揮著關鍵作用，如mRNA穩定性和蛋白質編碼等。此外，A-to-I RNA編輯可能與癌癥、衰老、神經系統疾病、自身免疫疾病或心血管疾病密切相關［38］。因此，肌苷代謝紊亂可能會產生嚴重后果。

2.7 腸道菌群致毒機制分析

2.7.1 馬錢子灌胃前后腸道菌群的變化

為了確定馬錢子對大鼠腸道菌群種類和組成的影響，本文標記了所有樣品的OTU。根據門、綱、目分類，對含量前20的菌種進行分析，以確定正常組和馬錢子給藥組之間的不同菌株。圖8顯示了腸道菌群的結構變化。

在門水平上，大鼠腸道菌群主要由厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋桿菌門、放線菌門、變形菌門、疣微菌門等組成，其中厚壁菌門和擬桿菌門組成約占總細菌數的95%。與正常組（CG）比較，馬錢子組（SN）的厚壁菌門、放線菌門和TM7菌門等豐度顯著升高，螺旋桿菌門、變形菌門和疣微菌門等豐度顯著降低（圖8a）。

Fig.8 Schematic diagram of the changes in intestinal flora before and after SN gavage different classification level

在綱水平上，大鼠腸道菌群主要由梭菌綱、桿菌綱、擬桿菌綱、螺旋體綱、產芽胞菌綱、放線菌綱、疣微菌綱、σ變形菌綱等組成，其中梭菌綱、桿菌綱、擬桿菌綱及螺旋體綱的相對豐度占總細菌數的80%以上。與正常組比較，馬錢子組的桿菌、擬桿菌、螺旋體綱、生芽生菌綱和TM7_3菌等豐度顯著升高，梭菌綱、放線菌、疣微菌綱和變形菌等豐度顯著降低（圖8b）。

在目水平上，大鼠腸道菌群主要由梭菌目、乳桿菌目、擬桿菌目、螺旋桿菌目、丹毒目、CW040菌目、疣微菌目等組成，其中梭菌目、乳桿菌目、擬桿菌目占總細菌數量的80%以上。與正常組比較，馬錢子組的乳桿菌、擬桿菌、螺旋桿菌、丹毒菌目豐度顯著升高，梭菌和脫硫弧菌的豐度顯著降低（圖8c）。

2.7.2 腸道菌群與肝腎生化指標的相關性分析

選擇OTU的代表性序列以獲取圖像注釋信息，對每個樣品在7種分類水平為界（kingdom）、門（phylum）、綱（class）、目（order）、科（family）、屬（genus）、種（Species）上列數目占總序列數的比例進行統計，可以有效地評估樣本的物種注釋分辨率，圖9展示了每個樣本中OTU在各分類水平注釋的相對程度。從圖中可以看出，注釋到“屬”水平的序列在各個樣本中的區分度最高（即在“屬”的水平樣品個體差異最大），而注釋到其他水平的序列區分度不高，因此下一步將分析腸道菌群在“屬”水平上相對豐度與血清肝腎功能指數之間的相關性。

Fig.9 Sequence annotation bar chart of each sample at each classification level

為了探討馬錢子影響大鼠腸道菌群的機制，使用Spearman方法分析了腸道菌群在“屬”水平上相對豐度與血清肝腎功能指數之間的相關性（圖10）。熱圖分析顯示，某些腸道菌群的相對豐度與肝功能（AST和ALT）和腎功能（UREAL）指標密切相關。

馬錢子組的UREAL含量與相對豐度降低的益生菌屬（Blautia）和擬桿菌屬（Bacteroides）呈顯著負相關（r=-0.515 5，-0.515 3）（P＜0.05）。UREAL是指血漿中的含氮化合物，而不是從腎小球過濾出體外的蛋白質。腎功能不全患者的UREAL水平升高，因此，它在臨床上被視為評估腎小球濾過功能的指標［39］。研究發現，人體腸道菌群失調與腎結石形成密切相關。通過比較腎結石組和健康對照組之間腸道微生物的差異，腎結石組中的益生菌屬豐度顯著降低，這表明腎結石的形成與腸道菌群之間存在關聯性，也為腎結石新的治療方案提供了理論基礎［40］。腸道微生物群構成人體最大的微生態系統，該系統與慢性代謝疾病密切相關。研究發現，與對照組相比，慢性腎臟?。–KD）患者的腸道微生物多樣性降低，微生物群落發生了顯著變化。值得注意的是，CKD組的益生菌屬豐度顯著下降。本研究結果可作為CKD臨床診斷的參考［41］。大量證據表明，腎陽虛證（KYDS）與腸道微生物群的代謝紊亂有關。結合糞便代謝組學和16S rRNA基因測序分析，發現KYDS主要與擬桿菌屬的代謝紊亂有關［42］。白藜蘆醇可通過調節擬桿菌屬和其他細菌的豐度來改善腸道屏障功能、通透性并抑制炎癥，進而延緩糖尿病腎病進展［43］。

馬錢子組的ALT含量與相對豐度降低的糞厭氧棒菌屬（Anaerostipes）和顫螺菌屬（Oscillospira）的豐度呈顯著負相關（r=-0.648 9，-0.611 7）（P＜0.05）。ALT主要存在于肝細胞的細胞質中，其胞內濃度比血清中的濃度高1 000~3 000倍。如果1%的肝細胞被破壞，ALT含量就會翻倍。因此，ALT水平被視為肝功能損害最敏感的檢測指標［44］。肝纖維化（HF）是各種慢性肝病的典型表現，它與腸道微生物群的組成和代謝狀態密切相關。糞厭氧棒菌屬能夠促進HF患者腸道中丁酸的生成，進而引發過量氨的生成并影響免疫功能，最終加重HF［45］。研究表明，非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）受腸道微生物組成的影響。NAFLD組中顫螺菌屬的豐度顯著低于健康對照組，因此，顫螺菌屬可被視為NAFLD發病及進展過程中一種特征性腸道標志物［46］。

Fig.10 Heat map of the correlation between different flora and function indices of liver and kidney

馬錢子組的的AST含量與相對豐度升高的雙歧桿菌屬（Bifildobacterium）和螺桿菌屬（Helicobacter）呈顯著正相關（r=0.557 8，0.559 2）（P＜0.05），與相對豐度降低的糞球菌屬（Coprococcus）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）和雙莖體菌屬（Bilophila）的豐度呈負顯著負相關（r=-0.523 5，-0.579 4，-0.622 3）（P＜0.05）。AST是肝功能檢查的重要指標，可用于檢測肝組織是否受損。AST存在于肝細胞的線粒體中，只有當肝組織嚴重受損時，血清AST才會升高［47］。螺桿菌屬，又稱幽門螺桿菌，是目前已知的唯一能夠在人體胃中存活的微生物物種。流行病學研究表明，感染幽門螺桿菌的患者患非酒精性肝病的風險增加。幽門螺桿菌通過調節激素、促炎細胞因子和腸道微生物組的表達進而影響非酒精性肝病的發?。?8］。此外，由幽門螺桿菌感染直接導致的肝病，如NAFLD、病毒性肝炎和肝細胞癌（HCC）等，在全球范圍內發病率都很高［49］。非酒精性脂肪性肝炎（NASH）同樣受腸道微生物群的影響。研究發現，在NASH患者中，丁酸產生菌（如糞球菌）的豐度顯著降低，這表明丁酸產生菌與NASH的發病密切相關［50］。短期過度喂養會導致肝臟脂肪變性，并影響人體腸道微生物群，而雙莖體菌屬與過度喂養引起的肝臟脂肪變性顯著相關［51］。腸道微生物群失衡與丙型肝炎病毒（HCV）感染有關。與健康對照組相比，未經治療的HCV組中的雙莖體菌屬豐度降低，表明雙莖體菌屬可能對HCV感染具有診斷價值［52］。

2.7.3 腸內菌群與馬錢子所引起的大鼠體內毒性的相關性

利福昔明是一種廣譜腸道抗生素。實驗結果表明，長期灌胃給藥后，利福昔明對大鼠幾乎沒有副作用［53］。利福昔明對本實驗所涉及的多種腸道菌群（如擬桿菌、糞球菌等）具有非常強的抑制作用［54］。因此，為了驗證馬錢子的毒性與腸道菌群之間的相關性，以馬錢子灌胃大鼠為研究對象，通過急性毒性實驗考察利福昔明干預后LD50的變化情況。

在急性毒性試驗中，馬錢子（利福昔明干擾）的LD50值為209.82 mg/kg，LD50的95%置信限為188.73~234.49 mg/kg。與馬錢子組大鼠相比，馬錢子+利福昔明組大鼠的LD50值顯著升高，表明腸道菌群被抑制后，馬錢子的體內毒性降低。實驗結果表明，腸內菌群確實與馬錢子的體內毒性密切相關。表7為利福昔明干擾后馬錢子急性毒性試驗結果。

另外，馬錢子組和馬錢子+利福昔明組大鼠的血清代謝譜界限明顯（圖4d），說明腸內菌群被利福昔明抑制后，大鼠整體的血液代謝途徑發生了較大變化。因此，實驗結果進一步表明馬錢子的體內毒性與腸道菌群密切相關。

Table 7 Experimental results for the acute toxicity of SN（rifaximin interference）

2.7.4 各組腸道菌群中MetaCyc通路的PCA分析

基于MetaCyc數據通路的功能，采用16S擴展技術獲得KEGG數據通路的PCA分析。正常組（C）組和馬錢子組（S）之間有分離趨勢（圖11a），表明兩組間存在差異代謝通路。馬錢子在大鼠腸道菌群中主要影響P-162-PWY、PWY-7198、PEY-7210、PWY-7315等信號通路（圖11b）。下一步工作將對這些信號通路進行逐一分析和驗證。

Fig.11 PCA analysis based on KEGG pathway

3 結論

本文通過急性、蓄積性和亞急性毒性試驗，分別確定了馬錢子致大鼠體內的毒性劑量、毒性強度和毒性靶器官；將裝袋算法融入到代謝組學研究中顯著提高了組學數據分類的準確率；共鑒定出2種血液內源性代謝物、8種肝臟內源性代謝物以及2種腎臟內源性代謝物，這些代謝產物在大鼠體內的代謝紊亂可能是馬錢子毒性產生的根源。根據腸道菌群代謝分析，豐度發生顯著變化的糞厭氧棒菌、顫螺菌、螺桿菌、糞球菌、雙莖體菌與肝腎功能生理指標密切相關，而益生菌、擬桿菌與腎功能的生理指標密切有關，這表明馬錢子導致的肝腎損害機制可能與這些腸道細菌的代謝紊亂有關。下一步將對由馬錢子引發變化的腸道菌群信號通路進行逐一分析和驗證。本文闡明了中藥馬錢子在大鼠體內的致毒機制，為馬錢子臨床的安全和合理使用提供了科學依據。