不同葉色猴樟花青素含量與光合特性比較

張楠，韓浩章，張麗華，李素華，趙榮，王芳

（宿遷學院 生物與材料學院，江蘇 宿遷 223800）

彩葉植物是指在環境因子及其內在遺傳特性的影響下，葉片在一定時期內全部或部分呈現紫色、黃色、紅色、橙色等顏色的植物種類［1］。彩葉植物組織和器官的顏色取決于花青素、葉綠素、類胡蘿卜素的含量和分布，花青素的主要存在形式是花青素苷，花青素苷除了參與葉片呈色外，還有抗高光強、干旱、低溫弱光、紫外線、鹽堿脅迫、病蟲害等功能。研究表明，在煙草（Nicotiana tabacumL.cv.Xanthi）中過量表達金魚草（Antirrhinum majusL.）Rosea1基因可增強花青素苷的積累，明顯提高植物抗旱能力［2］。在鹽脅迫下，紫莖假儉草［Eremochloa ophiuroides（Munro.）Hack.］中花青素苷含量顯著高于綠莖假儉草，花青素苷明顯提高紫莖假儉草的抗鹽能力［3］。紫色羽衣甘藍（Brassica oleraceaL. var.acephalaf. tricolor）的花青素生物合成相關基因表達水平在低溫處理下顯著提高，其花青素苷含量是溫室栽培條件下的50倍，表明花青素與植物抗低溫能力有關［4］?；ㄇ嗨卮龠M逆境條件下植物正常生長發育的機理研究一直倍受關注。

研究表明，花青素的吸收光譜與葉綠素的吸收光譜部分重疊［5］，能夠吸收400 ～ 600 nm的可見光，并且多數花青素分布在葉片表面，具備光消減功能［6-7］；另外，光合作用中的過量激發能會傷害PSII的光學活性，植物主要通過非光化學猝滅、循環電子傳遞、梅勒反應和光呼吸的形式進行耗散［8］，而花青素能夠增加熱耗散的比例，最大可能減少PSII中的過剩激發能；再者，花青素具有抗氧化特性，非生物脅迫下的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）信號調控轉錄子（MYB/bHLH/WD40）能激活花青素生物合成基因的表達［9］，致使葉片花青素積累，花青素通過清除ROS降低氧化應激，保護植物免受生長抑制和細胞死亡的影響。低溫條件下，缺乏花青素的葉片具有更多的內源ROS，而富含花青素的葉片氧化損傷水平降低，光合速率提高［10］，花青素及其中間產物比抗壞血酸等抗氧化物質具有更強的ROS清除能力［11］。然而，也有研究認為，花青素在光系統保護方面的光消減功能應該比抗氧化功能更重要［12］，逆境下植物花青素的積累還與激素代謝［13］、抗氧化物質代謝［11］、糖代謝［14］、次生物質代謝［15］等途徑密切相關，不同植物積累花青素響應逆境脅迫的機理仍存在爭議。

猴樟（Cinnamomun bodinieriLevl.）為樟科（Lauraceae）樟屬（CinnamomunSchaeffer）常綠喬木，是中國重要的經濟樹種、綠化樹種和林用樹種，但部分品系在春季新梢生長過程中新葉葉綠素含量較低，花青素苷含量較高，形成呈色穩定的紅葉、紫葉等表型，一直持續到6月中下旬，具有很高的觀賞價值，但人們對猴樟春季葉色變化的機理并不清楚?；诖?，本研究以春季新梢表現為綠葉、紅葉、紫葉的不同葉色猴樟實生苗為材料，比較其功能葉色素含量、花青素合成相關基因表達量、光合作用參數和葉綠素熒光參數，以期為初步研究猴樟春季葉色變化的機理提供參考，為選育優良猴樟品種提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用的試驗材料選自宿遷學院樟屬植物栽培基地實生苗，根據當年新稍呈色特征分為綠葉、紅葉和紫葉3個處理。于2019年4月扦插繁殖，2021年3月移栽至盆內，栽培土pH為8.17，電導率為1 352 μs·cm-1。2022年4月中旬，選擇正常生長、長勢一致的猴樟扦插苗為材料，苗高130 ± 5 cm，每處理選擇5株種苗掛牌標記，選取種苗新梢同一部位處于成熟期的功能葉片進行檢測。

1.2 試驗方法

1.2.1 光合色素含量及花青素含量測定

猴樟葉片光合色素含量及花青素含量測定參考蔡慶生［16］的方法，5次重復。

選擇少云的晴天上午，在9 ： 00 ～ 10 ： 30期間用光合作用測定儀（Li-6400，Li-Cor公司）對猴樟光合作用參數進行測定。所測定的光合作用參數包括凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、水分利用效率（WUE），5次重復。其中葉片水分利用效率計算公式如下：

1.2.3 葉綠素熒光參數測定

光合作用參數測定的同時進行葉綠素熒光參數測定。選取功能葉片，采用葉綠素熒光儀（Yaxin-1161G，北京雅欣理儀科技有限公司）進行初始熒光（Fo）、暗適應下最大熒光（Fm）、光適應下最大熒光（Fm'）及光適應下初始熒光（Fo'）等的測定。在此基礎上，參考李運麗等［17］的方法，計算暗適應下PSⅡ最大光化學效率（Fv/Fm）、光適應下PSⅡ的最大量子產額（Fv'/Fm'）、光適應下PSⅡ的實際光化學效率（ΦPSⅡ）、光適應下的PSⅡ反應中心開放的比例（qP）和光適應下的非光化學猝滅（NPQ），5次重復，取平均值進行統計分析。

1.2.4 花青素合成相關基因表達量分析

根據猴樟轉錄組數據庫信息，通過OFR finder和NCBI-BLAST在線工具篩選出猴樟葉片花青素合成相關的查爾酮合成酶基因（CbCHS）、查爾酮異構酶基因（CbCHI）、黃烷酮-3-羥化酶基因（CbF3H）、黃烷酮-3'-羥化酶基因（CbF3'H）、二氫黃酮醇4-還原酶基因（CbDFR）、花青素合成酶基因（CbANS）、類黃酮-3-O-葡糖基轉移酶基因（CbUFGT）的CDS序列。利用NCBI的Primer-BLAST在線軟件設計定量引物（表1，由北京擎科生物科技有限公司合成）。

表1 實時熒光定量PCR所用引物Tab.1 Primers used for real-time fluorescent quantitative PCR

以不同葉色猴樟種苗新梢功能葉片為材料，按照艾德萊生物科技公司的RN53-EASYspin Plus多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒說明書進行RNA提取，使用超微量核酸蛋白測定儀（Nano600，上海嘉鵬科技有限公司）檢測RNA濃度，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。cDNA合成根據反轉錄試劑盒EasyScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的說明書進行操作。

熒光定量PCR以CbActin1作為內參基因，按照全氏金PerferStart? Green qPCR SuperMix試劑盒配制反應體系，采用熒光定量 PCR儀（Q2000B，杭州朗基科學儀器有限公司）測定3種猴樟葉片花青素相關基因的相對表達量。

實時熒光定量PCR反應體系為20 μL體系，包括cDNA 1μL，2 × SYBR Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus） 10 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL；反應程序為95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 40 s，40個循環；采用2-△△Ct法進行相對表達量的分析，確定3種猴樟花青素合成相關基因的表達水平。

結腸癌的發生是一個多因素、多階段和多基因改變協同作用的過程，其發生的分子基礎包括癌基因和抑癌基因的表達失調[18]。研究結腸癌的發病機制，如分子遺傳學和生物學的改變，在將來有希望能夠改善患者的預后。但是，不幸的是，大多數患者死于其轉移性[19]。因此，研究結腸癌的發生和轉移都尤為重要。

1.3 數據統計與處理

采用Microsoft Excel 2010進行色素含量、光合作用參數、葉綠素熒光參數和花青素合成相關基因表達量數據處理，采用SPSS 22.0進行數據統計，采用最小顯著差數法（LSD）進行不同處理間的顯著差異分析。

2 結果與分析

2.1 不同葉色猴樟光合色素和花青素含量差異分析

葉綠素、類胡蘿卜素和花青素的含量差異促使葉片呈色，分別對綠葉、紅葉、紫葉猴樟幼苗功能葉片葉綠素、類胡蘿卜素和花青素含量進行測定。如表2所示，綠葉猴樟的葉綠素a、葉綠素b和葉綠素（a + b）含量最低，而紅葉猴樟的最高，但差異不顯著；紫葉猴樟的類胡蘿卜素含量最高，但三者顯著不差異；紫葉猴樟的花青素含量最高，綠葉猴樟的最低，紫葉猴樟和紅葉猴樟的花青素含量分別是綠葉猴樟的134.24倍和49.80倍，差異顯著（P＜ 0.05）。

表2 不同葉色猴樟葉片的光合色素和花青素含量Tab.2 Contents of photosynthetic pigments and anthocyanins of C. bodinieri seedlings with different leaf colors

2.2 不同葉色猴樟葉片光合作用參數差異分析

葉綠素、類胡蘿卜素與光合作用密切相關，采用Li-6400光合作用測定儀對猴樟光合作用參數進行測定。如表3所示，紅葉猴樟和紫葉猴樟的Pn、Gs、Tr均高于綠葉猴樟，而Ci和WUE均低于綠葉猴樟；紫葉猴樟和綠葉猴樟之間的Pn、Gs、Tr、Ci和WUE均存在顯著差異（P＜ 0.05），紅葉猴樟和綠葉猴樟之間的Pn、Gs、Ci和WUE存在顯著差異（P＜ 0.05），紫葉猴樟和紅葉猴樟之間的Pn、Gs、Ci差異不顯著。

表3 不同葉色猴樟的光合作用參數Tab.3 Photosynthetic parameters of C. bodinieri seedlings with different leaf colors

2.3 不同葉色猴樟葉綠素熒光參數差異分析

光合色素以蛋白復合體的形式存在于葉綠體類囊體膜上，通過吸收和傳遞光能參與光合作用中的能量分配，采用Yaxin-1161G葉綠素熒光儀測定其Fo、Fm、Fm'及Fo'等熒光參數。如表4所示，紅葉猴樟和紫色猴樟的Fo、Fm、NPQ、Fo'/Fm'均顯著高于綠葉猴樟（P＜ 0.05），而qP和ΦPSⅡ均顯著低于綠葉猴樟（P＜ 0.05），Fv/Fm差異不顯著。紫葉猴樟的Fo、Fm、Fo'/Fm'、Fv/Fm和ΦPSⅡ均高于紅葉猴樟，僅有Fo、Fm差異顯著（P＜ 0.05）；NPQ、qP均低于紅葉猴樟，但差異不顯著。

表4 不同葉色猴樟的葉綠素熒光參數Tab. 4 Chlorophyll fluorescence parameters of C. bodinieri seedlings with different leaf colors

2.4 不同葉色猴樟花青素合成相關基因表達量分析

采用實時熒光定量PCR技術對不同葉色猴樟功能葉片花青素合成相關基因CbCHS、CbCHI、CbF3H、CbF3'H、CbDFR、CbANS、CbUFGT的相對表達量進行分析。如表5所示，紫葉猴樟葉片CbCHS的相對表達量顯著高于其他兩個處理（P＜0.05），分別是紅葉猴樟和綠葉猴樟的1.82倍和2.22倍，紅葉猴樟與綠葉猴樟差異不顯著；CbCHI和CbF3H在3種猴樟葉片中的表達量差異不顯著；紅葉猴樟葉片CbF3'H的表達量最高，分別是綠葉猴樟和紅葉猴樟的2.58倍和2.96倍，綠葉猴樟和紫葉猴樟之間差異不顯著；紫葉猴樟葉片CbDFR表達量最高，分別是綠葉猴樟和紫葉猴樟的2.14和1.4倍，綠葉猴樟與紅葉猴樟之間差異不顯著；紫葉猴樟葉片CbANS的表達量最高，分別是紅色猴樟和綠色猴樟的2.99和3.93倍，綠葉猴樟與紅葉猴樟之間差異不顯著；紅葉和紫葉猴樟的CbUFGT表達量分別是綠葉猴樟的16.73和20.74倍，紅葉猴樟與紫葉猴樟之間差異不顯著。

表5 不同葉色猴樟花青素合成相關基因表達量Tab.5 Expression levels of genes related to anthocyanin synthesis in different leaf colors of C.bodinieri seedlings

3 討論與結論

3.1 不同葉色猴樟光合特性的比較分析

植物葉片呈色主要歸因于葉綠素、類胡蘿卜素和花青素等色素的含量差異。在本實驗結果中，紫葉猴樟和紅葉猴樟的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素（a + b）和類胡蘿卜素含量均與綠葉猴樟無明顯差異，而花青素含量差異巨大，紫葉猴樟和紅葉猴樟的葉片花青素含量分別是綠葉猴樟的134.24倍和49.80倍，由此可見，花青素含量是猴樟葉片呈現紫、紅色的主要原因，與前人研究結論一致［1］。葉綠素、類胡蘿卜素又是植物主要的光合色素，以蛋白復合體的形式存在于葉綠體內的類囊體膜上，通過吸收和傳遞光能參與光合作用中的能量分配，其含量變化與植物光合功能相關。從本試驗結果來看，紅葉猴樟和紫葉猴樟的Pn、Gs、Tr均高于綠葉猴樟，而Ci和WUE均低于綠葉猴樟，推測花青素對植物的氣孔開關具有調控作用，致使紫葉猴樟、紅葉猴樟對CO2的吸收和同化能力高于綠葉猴樟，這種調控作用可能與光系統保護有關［12］。春季氣溫較低，猴樟新梢上的葉片還沒有完全發育成熟，葉綠素含量偏低，對低溫、強光、鹽堿等環境因子的抵抗能力較差［18］，花青素的積累能夠通過光消減、提高抗氧化活性、消耗光系統中過多激發能等形式保護光系統，提高光合速率，提高植物抗逆性。

從光系統功能來看，紅葉猴樟和紫葉猴樟的Fo、Fm、NPQ、Fo'/Fm'均顯著高于綠葉猴樟，而qP和ΦPSⅡ均顯著低于綠葉猴樟，Fv/Fm差異不顯著。Fo是PSⅡ反應中心處于關閉時的初始熒光產量，光系統功能受損與葉綠素含量增加均會導致Fo升高［19］。Fm反映PSⅡ的電子傳遞最大值，Fv/Fm體現PSⅡ反應中心光能最大轉換效率；qP反映光適應下光化學活性，NPQ表示PSⅡ吸收的光能中以熱的形式耗散掉的部分，Fo'/Fm'反映光適應下PSⅡ反應中心原初光能捕獲效率；ΦPSⅡ為部分PSⅡ反應中心關閉時，PSⅡ原初光能捕獲效率，體現PSⅡ和PSI之間實際電子傳遞情況［16］。本試驗中，紫葉、紅葉猴樟的光合色素含量高于綠葉猴樟，因而暗適應下的Fo、Fm也高于綠葉猴樟；3種不同葉色猴樟種苗生長條件一致，因而Fv/Fm值差異不顯著。但在光適應條件下，綠葉猴樟光系統可能受到了損傷，光合能力下降，氣孔開度變??；而紅葉猴樟和紫葉猴樟中積累了大量花青素，一方面通過吸收、反射、滲透調節等措施降低植物對強光的吸收［7］，另一方面通過自身或中間產物以及其誘導的抗氧化活性減少ROS對光系統的損傷［9］，其Fo'/Fm'高于綠葉猴樟。再者，花青素還能通過耗散過量激發能的形式保護光系統，導致NPQ高于綠葉猴樟［8，20］，qP和ΦPSⅡ均低于綠葉猴樟，花青素的積累致使NPQ提高的原理仍需進一步研究。

3.2 不同葉色猴樟花青素相關基因的表達量變化規律

植物體內不同花色苷所呈現的顏色存在差異，天竺葵素及其衍生物呈紅色或橙色，矢車菊素及其衍生物主要呈磚紅或洋紫色［21］。本試驗中，所用的猴樟種苗葉片呈現紅色和紫色，其花青素的合成可能是以苯丙氨酸作為前體物質合成4-香豆酰CoA，4-香豆酰CoA在CHS、CHI、F3H的作用下形成二氫黃烷酮，而后二氫黃烷酮在F3'H、DFR、ANS的催化下形成矢車菊素，或者直接在DFR、ANS的作用下形成天竺葵素，矢車菊素或天竺葵素再通過UFGT糖基化反應形成穩定的花青素苷［1］，因3種不同葉色猴樟中CbF3'H均有較高的表達量，推測矢車菊素可能是猴樟葉片呈色的關鍵色素類型。在我們的研究中，紫葉猴樟的CbDFR、CbANS和CbUFGT基因表達量顯著高于綠葉猴樟，紅葉猴樟的CbDFR、CbANS和CbUFGT基因表達量高于綠葉猴樟，其中僅有CbUFGT差異顯著，因而推測CbDFR、CbANS和CbUFGT可能是猴樟葉片呈色的關鍵基因。

值得注意的是，紅葉和紫葉猴樟的CbUFGT表達量遠高于綠葉猴樟，紅葉猴樟與紫葉猴樟之間差異不顯著，CbUFGT一方面通過合成大量花青素促進猴樟葉片呈色，另一方面還能通過糖基化過程消耗大量的碳水化合物，以防止碳水化合物積累對光合作用的反饋調節，間接促進光合功能［6］，基于此，我們推測CbUFGT的糖基化可能對猴樟葉色的形成起重要作用。另有研究表明，植物體內ANS基因的表達水平與花青素的消光功能呈正相關，花青素的消光功能可能在光保護中發揮比抗氧化功能更重要的作用，花青素的抗氧化功能可能更依賴于中間產物［12］。在本實驗中，紫葉猴樟的CbCHS表達量顯著高于綠葉猴樟和紅葉猴樟，紅葉猴樟的CbF3'H表達量顯著高于綠葉猴樟和紫葉猴樟，CHS能催化4-香豆酰CoA合成查爾酮，F3'H能催化二氫黃烷酮合成二氫槲皮素，推測中間產物查爾酮和二氫槲皮素的積累可能在猴樟耐受春季低溫過程中起作用，其機理尚需進一步研究。

綜上所述，猴樟在春季生長過程中，新梢葉片易受低溫的影響而積累花青素，花青素是猴樟葉片呈紫、紅色的主要色素；花青素積累能調控植物的氣孔開關，并能通過加大激發能熱耗散的形式保護光系統，致使紫、紅葉猴樟的碳同化能力高于綠葉猴樟。依據不同葉色猴樟花青素合成相關基因表達量分析，推測矢車菊素可能是猴樟葉片呈色的關鍵色素類型，CbDFR、CbANS和CbUFGT可能是猴樟葉片呈色的關鍵基因，其中CbUFGT對猴樟葉色的形成尤其重要，花青素合成過程中的中間產物查爾酮和二氫槲皮素可能在猴樟耐受春季低溫過程中起重要作用。