I型神經纖維瘤病一家系基因檢測

余佳琳 梁嘉莉 劉翌菲 蔡 妍 張辰希 張曉穎 劉 成 李榮華

1廣東省東莞市大朗醫院皮膚科,廣東東莞,523770;2南方醫科大學南方醫院皮膚科,廣東廣州,510515;3廣州醫科大學附屬武警廣東省總隊醫院皮膚科, 廣東廣州, 510517;4福建醫科大學附屬泉州第一醫院皮膚科,福建泉州,362000

I型神經纖維瘤病(neurofibromatosis type 1,NF1)是一種較常見的遺傳性神經皮膚綜合征,發病率為1/3500,主要表現為皮膚牛奶咖啡斑、腋窩雀斑、虹膜lisch結節及神經纖維瘤。本研究收集臨床診斷NF1的患兒,經過二代測序及Sanger測序技術鑒定了NF1基因突變?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患兒,女,10歲。因“全身多發咖啡斑10年,左眼瞼及上顎腫物3年”就診?；純鹤猿錾鸪霈F腋窩雀斑,牛奶咖啡斑,逐漸增多。3年前患兒出現左眼瞼及上顎腫物,逐漸增長,無疼痛,無視力下降,無進食及吞咽困難。出生史無特殊,查體身高134.5 cm,體重28 kg,語言、運動及智力發育正常。皮膚科查體:全身散在皮膚咖啡牛奶斑,以軀干、腋窩、四肢等部位為主(圖1a)。左眼上瞼外側瞼板增厚,局部軟組織增生,邊界不清,表面組織無破潰,質韌、無壓痛(圖1b)。右側上頜腭部一1 cm×0.8 cm粉色不規則腫物生長,質地柔軟,邊界不清,與周圍組織粘連(圖1c)?；純焊改刚?均無皮膚咖啡牛奶斑和腫物。檢驗檢查:血常規、肝腎功能、凝血四項、術前四項及頭顱MRI未見明顯異常。右側上頜牙齦腫物切除送病理活檢,鏡下見瘤細胞長梭形,細胞胞漿嗜伊紅,細胞核長梭形,部分細胞核卵圓形,染色質細膩,未見核分裂象(圖1d)。免疫組化示EMA(-)、Actin(SMA)(部分+)、S-100(+)、SOX-10(+)、CD34(+)、NP(局灶+)、Ki-67(+,約1%),符合神經纖維瘤。

1a:左眼眶腫物;1b:上顎腫物;1c:腋窩雀斑;1d:組織病理學表現(HE,×200)

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA 經患兒及家屬知情同意,采集患兒及其父母外周靜脈血,使用Qiagen DNA Mini Kit試劑盒(Qiagen,中國,上海)提取基因組DNA。

1.2.2 DNA文庫制備 通過S220 Focused-ultrasonicator儀器(Covaris, Massachusetts, 美國)將1～3 μg的基因組DNA片段化至150 bp平均大小。使用文庫制備試劑盒(MyGenotics,中國,北京),通過末端修復、接頭連接和PCR擴增樣本,制備DNA文庫,通過DNBSEQ(DNBSEQ-T7)進一步測序。

1.2.3 目標基因捕獲 使用骨骼疾病相關基因捕獲試劑盒(MyGenostics Inc,中國,北京)對打斷的DNA文庫進行捕獲。生物素標記的捕獲探針設計包含所有基因的編碼外顯子以及外顯子上下游50 bp側翼區域,探針長度為100 bp。利用Illumina Nextseq 500第二代測序儀對捕獲到的區域進行雙端測序。

1.2.4 數據篩選與生物信息學分析 用cutadapt篩選MGI測序適配器和低質量讀取(<80 bp)。在質量控制之后,使用Sention將讀數映射到UCS hg19人類參考基因組。去除重復讀取,使用參數驅動程序校正堿基,以便最終輸出BAM文件讀取中堿基的質量值更接近與參考基因組,使用映射讀取來檢測變異。最后通過Sentieon軟件的參數驅動程序檢測SNP和InDel的變異。將數據轉換為VCF格式,使用ANNOVAR軟件對變體進行了進一步注釋(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/),并與多個數據庫關聯,如千人基因組、ESP6500、dbSNP、EXAC、內部數據庫(Mygenotics)、HGMD,并用REVEL、SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster等進行變異有害性預測。

1.2.5 Sanger測序驗證 獲得所有可用家族成員的基因組DNA,根據需要測序的DNA片段合成引物,用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)法進行擴增。將得到的產物進行純化,純化后的PCR產物經Sanger測序法(Biosune)測序。測序結果用DNASTAR(Madison)軟件分析。

2 結果

2.1 測序數據分析 患兒基因檢測平均測序深度為180.12,目標區域覆蓋度為99.48%。

2.2 致病基因突變分析 全外顯子測序顯示患者17號染色體NF1基因內含子2發生c.204+2T>G位點雜合突變(圖2a),導致第2個堿基由T變為G,為剪切突變,經過Sanger測序驗證。根據ACMG指南,該變異初步判定為致病性變異(Pathogenic:PVS1+PS2+PS4+PM2_Supporting+PP4)?；純耗赣H(圖2b)和父親(圖2c)無該位點變異,患兒為自發雜合突變。

2a:先證者;2b:先證者的母親;2c:先證者的父親

3 討論

NF1是一種常染色體顯性遺傳性腫瘤性疾病,50%為自發突變[2]。NF1以咖啡牛奶斑、神經纖維瘤和Lisch結節為特征,主要為皮膚、神經、眼、骨骼及血管等器官及系統受累的一種易患腫瘤綜合癥。

NF1臨床癥狀主要為多發皮膚結節、咖啡牛奶斑、虹膜結節、腋下和腹股溝雀斑等特征性表現。根據美國國立衛生研究院制定及Legius更新的NF1診斷標準,滿足以下2點即可診斷:(1)全身≥6處咖啡色斑,青春期前直徑>5 mm,青春期后直徑>15 mm;(2)≥2處任何類型的神經纖維瘤或1處叢狀神經纖維瘤;(3)腋窩和(或)腹股溝雀斑;(4)視神經膠質瘤;(5)≥2個虹膜結節;(6)骨骼異常;(7)一級親屬患有NF1[3,4]。在本研究中,結合患兒臨床體征及影像學檢查資料,初步診斷為NF1。我們采用二代測序檢測患者的全外顯子,發現患者NF1基因內含子2發生雜合突變,c.204+2T>G雜合突變,導致氨基酸發生剪切突變。該患者父母未發生該位點突變,提示該突變為新發突變。

NF1基因定位于染色體17q11.2,跨越350 kb,包含60個外顯子(其中3個為選擇性剪接外顯子),編碼由2818個氨基酸組成的神經纖維蛋白[5]。神經纖維蛋白與RAS GTPase激活蛋白具有同源性,可通過加速Ras結合的GTP水解來負性調控RAS蛋白轉導信號[6]。當NF1基因突變,神經纖維蛋白表達下調, Ras過度活化,下游通路持續激活,施萬細胞過度增殖,形成神經纖維瘤[7]。NF1相關神經纖維瘤可發生于全身各個部位。例如本研究NF1患兒的神經纖維瘤發生于眼眶及上顎,影響患兒正常生活,首先手術治療,上顎及眼眶中午經過手術治療切除了腫物,但并不能預防復發。其他傳統的治療方法如激光治療、放射療法和化學療法等,但效果有限且伴隨著較大的創傷性[8,9]。這些方法無法阻止瘤體的新發[10],因此在臨床上難以常規應用,需要探討新的治療方法。

NF1基因突變引起Ras/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路異常激活是目前較為認可的致病機制之一。因此,靶向抑制絲裂原活化蛋白激酶(MEK)是一種有效的靶向治療方法。司美替尼是一種高度選擇性口服小分子MEK抑制劑,能與MEK1/2的變構抑制結合位點特異性結合,阻止MAPK通路異?；罨痆11,12]。于2020年4月獲得美國FDA批準,用于治療2～18歲,有癥狀和/或進行性、不可手術的NF1相關神經纖維瘤[13]。還有許多MAPK處于研發及臨床試驗中,為NF1患者帶來希望的曙光。

在本文中,我們對一例散發性的NF1患兒進行了基因檢測,明確了致病基因,并鑒定出一個國內未曾報道過的新突變位點。這一發現豐富了NF1基因突變庫,為NF1的遺傳咨詢和產前診斷提供了理論依據。另外,本研究患兒采用手術切除的方式去除了眼眶及上顎神經纖維瘤,此后仍需要門診密切隨訪及多學科協助治療,以便及時發現其他NF1臨床特征,進而對疾病的嚴重程度做出評估,并較早采取合理的綜合干預,提高患兒生存質量。