中國旱獺Ⅰ型干擾素受體β亞基克隆、表達及功能初步鑒定

陶 穎， 楊東亮， 王寶菊， 劉 藝， 桂文甲， 李 智， 樊和斌

1 中國人民解放軍中部戰區總醫院感染科， 武漢 430030

2 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院感染科， 武漢 430030

α/β 干擾素共用Ⅰ型受體，該受體有α、β 兩個亞單位，分別稱為IFNAR1 和IFNAR2［1-4］。中國旱獺是研究HBV 感染的重要動物模型［5-6］。本研究對中國旱獺Ⅰ型干擾素受體β 亞基（marmata himalayana type Ⅰ interferon receptor β subunit，mhIFNAR2）進行了克隆、表達和抗體制備，并在體外用siRNA 鑒定其功能，為研究干擾素抗土撥鼠肝炎病毒的確切機制、土撥鼠肝炎病毒持續感染的原因及提高干擾素的療效奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2 細胞、DH5α、BHK 細胞、腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）由同濟醫學院附屬協和醫院感染科實驗室保存；WH12-6 細胞由德國埃森大學陸蒙吉教授提供；pSUPER 由美國Baylor 大學細胞生物學系馮新華教授惠贈；引物和RNAi 由上海英俊公司合成；限制性內切酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ、Bgl Ⅱ和Sal Ⅰ、pMD18T 載體、DL2000、T4 DNA 連接酶、T4 多核苷酸激酶購自Takara 公司；Trizol、Lipofectamine2000TM購自Invitrogen 公司；質粒抽提試劑盒為北京博大泰克生物基因技術有限公司生產；Taq 酶和膠回收試劑盒為Tiangen公司產品；dNTP由上海凌飛公司提供；DMEM 由HyClone公司提供；M-MLV 逆轉錄酶、RNasin 由美國Promega 公司提供；小牛血清購自杭州四季青公司；凝膠成像分析系統購自美國UVP 公司。根據其他哺乳動物干擾素受體的保守性設計引物，由上海英俊公司合成，其他哺乳動物在GenBank 中的序列號分別為：鼠NM_010509，牛NM_174553，羊NM_001009342，人NM_207585（表1）。RT-PCR擴增目的基因mhIFNAR2（50-181aa）。

表1 干擾素受體β亞基的引物序列Table 1 Primer sequences for interferon receptor β subunit

1.2 方法

1.2.1 mhIFNAR2 的克隆 根據其他哺乳動物干擾素受體的保守序列設計引物，克隆具體步驟見文獻［7］。

1.2.2 Ⅰ型干擾素受體β 亞基的表達及多克隆抗體的制備 測定重組質粒pRSET-B.mhIFNAR2核酸序列；重組質粒pRSET-B. mhIFNAR2 轉化高效表達菌Rossetta（DE3）plysS；菌體總蛋白的Western Blot 分析：轉膜后利用兔抗His-probe（H-15）作為一抗，HRP 標記的羊抗兔IgG 作為二抗進行Western Blot 檢測目的蛋白的表達；融合蛋白的大量制備及純化：取純化蛋白液20 μL，加2×蛋白電泳上樣緩沖液20 μL 于管中，100 ℃煮沸5 min。SDS-PAGE 電泳，考馬斯亮藍染色觀察純化效果；檢測蛋白純度：將目的蛋白表達過程中的各個組分進行SDSPAGE 電泳，結果進行蛋白條帶灰度掃描，并用Gelwork 1D advanced V4.01軟件分析。檢測蛋白濃度：通常每次純化的樣本都要行SDS-PAGE 檢測純化樣本的純度，高純度的樣本被收集起來，用標準的Bradford法（考馬斯亮藍G-250 法）測定蛋白濃度，為下一步免疫動物作準備。以純化的重組蛋白mhIFNAR2B（50-181aa）為免疫原，每次取120 μg溶于1 mL PBS中，再與等體積的氫氧化鋁佐劑混合，按40 μg/只的抗原劑量，分別免疫3 只BALB/c 小鼠，頸背部皮下多點注射。第14 天和第28 天時各加強免疫一次，加強免疫的方法和抗原劑量同上。第35天摘小鼠眼球取血，靜置離心后分離血清。

1.2.3 多克隆抗體特異性鑒定 外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）來源于中國旱獺，其分離的步驟如下：1 mL抗凝全血加入等體積的PBS混勻；將步驟1中的稀釋全血用滴管沿管壁緩慢疊加在另一個裝有2 mL的淋巴細胞分離液離心管內，注意保持清楚界面；2 500 r/min，離心20 min，管內液體分三層（從下至上為紅色細胞層、分離液層、血漿層）。上層與中間層有一白色云霧狀狹窄帶，包括淋巴細胞、單核細胞、血小板；抽吸云霧層至滅菌管中，加入5 倍體積以上的滅菌PBS（或D-Hank’s），2 000 r/min，離心5 min，棄上清；加入5倍體積以上的滅菌PBS（或D-Hank’s），2 000 r/min，離心5 min，棄上清；加入含10%小牛血清的RPMI1640 500 μL 重懸細胞，每張APES處理的玻片上滴加100 μL，自然風干后用冰丙酮固定30 min 行免疫組化及免疫熒光檢測。用Western Blot檢測其滴度。

1.2.4 mhIFNAR2功能的初步鑒定

1.2.4.1 中國旱獺α 干擾素的制備 將生長狀態良好的BHK 細胞接種到6 孔板內；生長24 h 后，細胞長滿至80%～90%；溶液A：2.5 μg 質粒+Optim 無血清培養基，總體積為100 μL；溶液B：5 μL Lipofectamine2000+95 μL Optim 無血清培養基；兩者室溫放置5 min；混合溶液A和B，輕輕混勻，室溫放置25 min；期間用無菌D-hank’s及培養基洗細胞兩次，并加入1 600 μL 無血清培養基；溶液A+溶液B內加入200 μL Optim 無血清培養基，輕柔混勻后加入培養細胞孔內；37 ℃孵育5 h；換用完全培養基2.0 mL 培養48 h 后收獲培養上清液，分裝后凍存于-70 ℃，待測干擾素生物學活性。

1.2.4.2 EMCV感染滴度的測定 將生長在培養瓶內的WH12-6細胞消化后加入Ham’s-12培養基，輕輕吹打分散細胞后轉種到96 孔板內，100 μL/孔；待細胞在96 孔板內長成單層后傾去培養液，滴定不同濃度的EMCV 到細胞孔內，從原液逐漸至10-10，呈10 倍系列稀釋，100 μL/孔，同時做細胞陰性對照，每個梯度接種4 孔細胞，第2 天觀察細胞生長狀況，計數不同稀釋度出現細胞病變效應（cytopathic effect，CPE）孔數，然后按Reed-Muench 法計算半數組織培養感染劑量（TCID50）。

1.2.4.3 中國旱獺干擾素α效價的確定 將生長在培養瓶中的WH12-6 細胞消化后加入Ham’s-12 培養基，輕輕吹打分散細胞轉種到96孔細胞培養板內；待細胞在96孔板內長成單層后傾去培養液，加入不同4 倍系列稀釋的BHK 細胞轉染上清100 μL/孔，每個稀釋度有4 個細胞孔，繼續培養24 h，加入0.1 mL EMCV，繼續培養24 h，以保護50%細胞不出現CPE 的BHK 細胞轉染上清液最高稀釋度作為干擾素效價。

1.2.4.4 siRNA 干擾實驗 WH12-6 細胞培養于含10%FBS 的Ham’s-12 培養基中，于5% CO2、飽和濕度及37 ℃條件下培養。勿使細胞融合度＞90%以防止細胞老化。siRNA由廣州銳博公司提供合成，序列見表2。另外設計一條陰性對照序列，Blast驗證為任何物種的無關序列。

表2 mhIFNAR2 siRNA 模板序列Table 2 Template of mhIFNAR2 siRNA

將正常培養于6孔板的WH12-6細胞于轉染前改用無抗生素Ham’s-12 培養基培養24 h。取2 μL Lipofectamine 2000加入250 μL Opti-MEM培養基，輕輕混勻。室溫孵育5 min。取20 μmol/L 合成siRNA，加入250 μL Opti-MEM培養基，siRNA 的終濃度分10、20 及50 nmol/L 三個梯度，輕輕混勻，室溫孵育5 min。隨后將兩者輕輕混合，室溫孵育20 min。加入一孔細胞中，用無血清無抗生素Ham’s-12培養基定容至2 mL。于37 ℃、5% CO2培養箱中培養6 h。換為含血清、抗生素的全培養基，培養24 h后加用中國旱獺干擾素刺激（同前），24 h后加Trizol提取RNA。用Trizol提取培養的WH12-6細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，使用SYBR Green嵌合熒光法進行RT-PCR擴增，反應條件為95 ℃、60 s預變性，95 ℃、15 s共40個循環，60 ℃、20 s延伸。mhIFNAR2、MxA 熒光定量RT-PCR 引物序列如下：mhIFNAR2（正義）ACAATCCACCGTGCCAACT，mhIFNAR2（反義）AACAGCATCGCTTTCCCTC；MxA（正義）CAGATTGTCTACTGCCAGGACCAGGT，MxA（反義）AGCCGCTCCTTCAGGAACTTC；β-actin （ 正 義 ）TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC，β-actin（反義）TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG；通過標準曲線獲得直線回歸方程，從而得到各個目的基因mRNA 的拷貝數，將其除以內參的拷貝數，然后乘以104作為該目的基因的相對值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 18.0 軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 mhIFNAR2的克隆、鑒定及同源性比較 RT-PCR從脾組織中擴增出149～1 300 bp 的mhIFNAR2 片段，并經測序證實［7］。同源重組構建重組質粒，經PCR、酶切和測序證實，命名為pRSET-B.mhIFNAR2。mhIFNAR2149-1300核苷酸序列與土撥鼠、人、牛、羊及小鼠的同源性分別為98.05%、72.89%、69.17%、69.76%及64.95%（圖1）。

圖1 mhIFNAR2片段核苷酸組成物種同源性比較Figure 1 Species homology comparison of mhIFNAR2

2.2 重組蛋白的表達

2.2.2 重組蛋白的小量誘導表達 SDS-PAGE 電泳可見，pRSET-B.mhIFNAR2重組質粒經IPTG誘導后1～6 h在大腸桿菌中均有表達，且在誘導4 h 時獲得量最大，而空菌及空載體轉化菌誘導4 h 在27 kD 處僅有較弱條帶（圖2）。

圖2 SDS-PAGE電泳分析His-mhIFNAR2蛋白的表達Figure 2 Expression of His-mhIFNAR2 analyzed by SDS-PAGE

2.2.3 目的蛋白的純化 誘導后的菌體超速離心后，經SDS-PAGE 電泳發現目的蛋白大部分存在于沉淀中，且主要以包涵體的形式存在。經Ni-NTA 純化得到的目的蛋白純度為95%，濃度約為160 μg/mL（圖3）。

圖3 pRSET-B.mhIFNAR2蛋白純化圖Figure 3 Purification of pRSET-B.mhIFNAR2

2.2.4 目的蛋白的Western Blot 檢測 抗His 與純化的重組蛋白反應，可見有特異性條帶（圖4）。

圖4 純化的目的蛋白Western Blot檢測Figure 4 Western Blot analysis of the activity and specificity of antisera

2.3 制備抗體的檢測

2.3.1 免疫組化檢測抗mhIFNAR2多克隆抗體特異性 抗原抗體結合部位可見明顯的陽性著色（圖5a），mhIFNAR2抗原的分布主要呈胞質型和胞膜型。而應用正常小鼠血清作為一抗則無陽性顯色（圖5b）。

圖5 mhIFNAR2多克隆抗體的免疫組化結果（DAB，×400）Figure 5 Immunohistochemical of mhIFNAR2 polyclonal antibodies（DAB，×400）

2.3.2 免疫熒光結果 PBMC 中mhIFNAR2 免疫熒光檢測主要分布于細胞質和細胞膜（圖6），而陰性對照則無陽性顯色。

圖6 PBMC中mhIFNAR2免疫熒光檢測Figure 6 Stained with mouse anti-mhIFNAR2 antibody by immunofluorescence in PBMC

2.3.3 Western Blot檢測 用純化的重組蛋白免疫BALB/c小鼠后，獲得了高效價的特異性多克隆抗體。經用Western Blot檢測的效價為1∶1 000。

2.4 干擾素效價的測定 以保護50%的細胞不出現CPE的BHK細胞轉染上清稀釋度作為干擾素的效價，表3為EMCV 感染滴度測定結果，本實驗所測得的干擾素效價為1∶128。

表3 EMCV感染滴度測定結果Table 3 Result of EMCV infection titer determination

2.5 siRNA 干擾效應 起始于840 位點的siRNA840 對WH12-6細胞mhIFNAR2基因無明顯的抑制作用（P＞0.05）（圖7）。起始于277位點的siRNA277（20 nmol/L）對WH12-6細胞mhIFNAR2、M×A 基因有明顯抑制作用，差異均具有統計學意義（P值均＜0.05）（表4）。

圖7 不同濃度的siRNA840對WH12-6細胞mhIFNAR2、M×A基因的抑制作用Figure 7 The inhibitory effect of siRNA840 at different concentrations on mhIFNAR2 and M×A

表4 不同濃度的siRNA277對WH12-6細胞mhIFNAR2、M×A基因的抑制作用Table 4 The inhibitory effect of siRNA277 at different concentrations on mhIFNAR2 and M×A

3 討論

干擾素受體由α、β 兩個亞基組成，當其與干擾素結合后迅速引起TYK2、JAK1、STAT1、STAT2磷酸化，進而激活轉錄產生各種抗病毒蛋白。盡管干擾素發現已有50年的歷史，但直到1990年才鑒定出干擾素受體由α、β兩個亞基組成。其中β 亞基有長、短及可溶等三種形式［8-10］。隨著干擾素與其受體相互作用、信號轉導機制及生物應答研究的深入，干擾素受體在介導干擾素抗感染中的天然免疫、獲得性免疫以及腫瘤中的作用逐漸引起人們的注意，干擾素受體缺失引起嚴重的病原體感染［11-12］。但是，干擾素在不同的細胞中會產生相反的生物學效應。比如在大多數細胞中干擾素表現為抑制增殖，促進凋亡，卻可延長記憶性T 淋巴細胞的存活時間［13-14］。因此，闡明干擾素受體復合物的功能有助于解釋這些現象的原因。在乙型肝炎動物模型中闡明干擾素抗病毒的作用機制及HBV的持續性感染具有重要的臨床意義。

本研究利用哺乳動物干擾素受體序列的保守區設計引物，成功地從中國旱獺脾組織中克隆出mhIFNAR2149-1300。mhIFNAR2149-1300核苷酸序列與土撥鼠、人、牛、羊及小鼠的同源性分別為98.05%、72.89%、69.17%、69.76%及64.95%。該結果與筆者前期克隆的中國旱獺其他分子相似［15-18］。

干擾素是具有多種生物功能的細胞因子，其發揮效應的始動環節是與其受體結合，使胞內段發生磷酸化，激活轉錄從而產生各種抗病毒蛋白。本研究目的是在mhIFNAR2克隆的基礎上，在體外用抗體阻斷及siRNA干擾的方法進一步證實所克隆基因的正確性，了解mhIFNAR2在干擾素信號通路的作用，為在乙型肝炎動物模型中國旱獺體內實驗奠定基礎。

前期研究［14］結果顯示IFNAR2 與干擾素結合的重要位點包括E78、W101、I104 以及D105，而既往的一些研究［19-20］也發現干擾素受體胞外段作為免疫原可以產生中和抗體。因此本文選擇了mhIFNAR2（50-181aa）胞外段重組蛋白作為抗原制備抗體。

本實驗以胞外段mhIFNAR2 重組蛋白免疫小鼠，制備了抗mhIFNAR2 的多克隆抗體。對所獲得的抗血清進行了Western Blot 檢測，證實制備的多克隆抗體特異性良好，具有免疫學活性，不僅可以識別作為免疫原的融合蛋白，還能有效識別PBMC 中的mhIFNAR2 蛋白。免疫組化及免疫熒光檢測可見mhIFNAR2 抗原的分布主要呈胞漿型和胞膜型。并且免疫血清在較高稀釋濃度下即可檢測到mhIFNAR2 蛋白，且無明顯的非特異性條帶，證實了多克隆抗體的高效性和抗mhIFNAR2 的特異性，為進一步研究mhIFNAR2 及干擾素在乙型肝炎動物模型中的作用提供了實驗基礎。

本研究用該抗體進行干擾素受體封閉實驗，結果顯示無明顯作用（具體數據未展示），原因可能有：（1）某些抗體雖然可以與其受體結合，但是不能阻斷干擾素的作用，且不同干擾素型別存在差異［21-22］；（2）不同細胞系與抗體的結合力也存在差異［17］；（3）一些抗體并不能阻止干擾素與其受體結合［22］。此外，本研究制備的是多克隆抗體，一是沒有純化，二是某些多克隆位點可能對干擾素信號通路產生影響。

本研究設計、合成針對中國旱獺mhIFNAR2的siRNA，并在基因水平成功驗證了起始于277位點的siRNA能夠有效抑制mhIFNAR2的表達，為深入研究mhIFNAR2的功能和機制，尤其是為在乙型肝炎中的研究提供了一個手段。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：陶穎、樊和斌負責課題設計，資料分析，撰寫論文；李智、劉藝、桂文甲參與收集數據，修改論文；楊東亮、王寶菊對課題進行指導；樊和斌負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。