生物型人工肝支持系統種子細胞的來源與應用

朱雪晶， 黃偉健，2， 鄢和新，2

1 上海賽立維生物科技有限公司， 上海 201210

2 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院麻醉科， 上海 200127

肝衰竭是由多種原因引起的嚴重肝臟損傷，其病死率極高［1］。肝移植術是目前唯一有效的治療方法。但供肝短缺、等待時間長、移植費用昂貴，故能夠進行肝移植治療的患者數量非常有限［2-3］。人工肝支持系統簡稱人工肝，包括生物型和非生物型。非生物型人工肝可以短期改善肝衰竭患者的肝臟代謝功能，但不能實現肝功能恢復，對患者的整體生存率無顯著性提高［2-6］。自1987年肝細胞型人工肝治療暴發性肝衰竭成功以來，生物型人工肝被認為是具有較好治療效果和應用前景的新型治療手段［7］。其不僅能夠幫助肝衰竭患者清除體內毒素，還具有合成及轉化功能，從而達到緩解肝衰竭、恢復肝功能的作用［8-9］。目前研究較多的生物型人工肝主要包括美國的ELAD、德國的MELS 以及荷蘭的AMCBAL。國內大部分處于臨床前研究階段［10］，截至目前，上海微知卓、蘇州瑞徠、廣東乾暉先后獲得國家藥品監督管理局藥品審評中心臨床批件，臨床試驗啟動在即。

生物型人工肝通常由種子細胞、生物反應器和輔助裝置組成。生物反應器是儲存細胞、實現物質交換的重要場所，多以中空纖維反應器、微載體或纖維支架反應器為主。輔助裝置主要為人工肝提供動力、保溫等作用。種子細胞是生物型人工肝發揮作用的核心要素，其應具備在體外代償肝臟的合成與解毒、生物轉化、分泌等功能，并且可持續、規?；苽?，達到一定的細胞數量。因此，開發合適的種子細胞，解決細胞數量、提高肝功能成為推動生物型人工肝發展的關鍵。本文就種子細胞的研究進展綜述如下。

1 種子細胞來源

目前，生物型人工肝種子細胞主要來源于豬肝細胞、人原代肝細胞、肝前體細胞、永生化肝細胞、腫瘤來源細胞、干細胞或胎肝細胞以及重編程的肝樣細胞等［4］（圖1）。

圖1 生物型人工肝種子細胞來源Figure 1 Cell sources for bioartificial livers

1.1 人原代肝細胞 人原代肝細胞理論上是最好的種子細胞，不存在跨種屬問題，也無致瘤和感染風險。鄧宏魁團隊［10］利用5C 化學小分子調控信號通路，解決了原代肝細胞體外功能穩定的難題。日本研究團隊［11］利用“YAPC”小分子組合發現原代肝細胞CYP450 酶活性可在體外維持達40天。此外，肝細胞與非實質肝細胞的共培養對于保持原代人肝細胞的功能非常重要。其中共培養中常用的非實質肝細胞包括人臍靜脈內皮細胞、血竇內皮細胞以及骨髓來源的間充質干細胞（mesenchymal stem cell， MSC）等［12］。然而，人原代肝細胞的體外增殖能力較差，導致其不能滿足生物型人工肝對種子細胞數量和功能的要求［13-14］。

1.2 人肝前體細胞 當肝臟持續暴露于慢性損傷時，肝細胞自我更新功能嚴重受損，可去分化為肝前體細胞以逃避損傷，并在損傷病因去除后成為再生修復的重要細胞來源［15-16］。筆者團隊［17-18］利用小分子重編程技術模擬體內肝再生微環境，將人原代肝細胞在特殊培養體系下，去分化為可體外增殖的肝前體樣細胞（hepatocytederived liver progenitor-like cell， HepLPC），并可在特定條件下重新分化為成熟肝細胞，成功在體外模擬了肝細胞再生過程?；堇F隊［19］通過篩選條件培養液將人原代肝細胞在低氧環境下去分化為一種介于肝細胞和肝前體細胞的狀態，實現了其體外擴增10 000 倍的能力。胡惠麗團隊［20］通過類器官技術實現人胚胎肝細胞體外培養及功能維持。雖然研究人員在人原代肝細胞體外擴增與功能維持方面取得了一定的進展，但依然受供肝的質量及數量限制，是否可作為生物型人工肝的種子細胞仍需要更深入的技術研究。

1.3 永生化肝細胞 外源永生化基因插入原代肝細胞可以使肝細胞獲得長期增殖能力。早期有研究者將SV40LT 聯合端粒逆轉錄酶轉染肝細胞，建立了IHH 永生化肝細胞［21］。高毅團隊［22-23］利用慢病毒載體對原代肝細胞穩定轉染了人端粒酶逆轉錄酶基因（H-TERT）和抑制Caspase-3表達的siRNA，建立了與原代肝細胞類似形態和生物學功能的HepGL。筆者團隊［24］在肝細胞來源的HepLPC 中過表達E6E7 基因，建立了具有良好合成、分泌、代謝功能的永生化肝前體樣細胞（iHepLPC），結合“液-氣”交互式反應器構建Aliver 生物型人工肝支持系統，將肝衰竭模型豬的生存率提高至83.3%，未來應用前景較好。但如何維持永生化細胞基因組的穩定性，保證臨床應用的安全性，是永生化細胞面臨的主要問題。

1.4 干細胞/轉分化來源的肝細胞 不同類型分化細胞之間的轉化不會在自然條件下自發發生，隨著細胞生物學和再生醫學的發展，目前可以利用技術手段在體外改變細胞分化的進程，從而實現細胞類型的轉化，這種方法稱為“重編程”?！爸鼐幊獭奔夹g的發展為肝細胞來源提供了新的研究思路［25］。以干細胞為基礎的人胚胎干細胞、誘導性多能干細胞、多潛能間充質干細胞均能夠誘導分化為肝樣細胞。這些細胞具有多向分化潛能、來源穩定、無倫理問題、功能接近于原代肝細胞，在細胞治療領域具有巨大的研究價值和應用前景［26］。但目前誘導為肝樣細胞技術尚不成熟，其分化效率差、誘導周期長、工藝復雜、成本高，且存在致瘤的風險，安全性在研究過程中備受關注。

惠利健團隊［27］通過插入轉錄因子，在特殊培養體系下，將新生兒皮膚成纖維細胞直接轉分化為人源性肝樣細胞hiHep，應用于生物型人工肝系統，成功救治了肝衰竭模型豬。謝欣團隊［28］在小鼠成纖維細胞體外插入1 個轉錄因子，聯合特定培養體系即實現了定向肝樣細胞轉分化。該轉分化條件更為簡便，移植后的肝樣細胞可以挽救肝衰竭小鼠的生命。但轉分化來源的肝樣細胞同樣存在殘留宿主細胞安全性風險、轉分化效率不確定、缺少統一標準等問題，仍需進一步研究。

1.5 腫瘤來源肝細胞 腫瘤細胞來源廣泛、易獲得，體外擴增能力強，從數量上可以滿足人工肝的需求。HepG2、C3A 是最常用于生物型人工肝研究的腫瘤細胞［29-30］。美國ELAD 系統自20 世紀90 年代開始研制生物型人工肝，將C3A 培養于中空纖維反應器內，早期臨床中取得了較好的效果［31］。但2015 年8 月由于Ⅲ期臨床試驗未達到評價終點而宣布失?。?2］。C3A 雖然具有一定的分泌、合成功能，并接近正常肝細胞，但代謝解毒功能差是其最大缺點，也可能是ELAD臨床試驗失敗的原因之一。HepaRG 細胞來源于人肝祖細胞系，因為其保留了肝細胞代謝酶、藥物轉運蛋白、核受體相關基因，在有或無DMSO 的條件下均可分化為成熟肝細胞。但是，HepaRG體外擴增能力差，分化條件復雜，尚無法獲得大批量細胞用于臨床前研究［33-34］。另外，腫瘤來源的肝細胞具有較大的安全風險，在臨床應用中若發生細胞泄露，將有致癌的風險。

1.6 動物源豬肝臟細胞 豬肝細胞由于易獲得、高功能活性，是最常用于人工肝研究的種子細胞。美國Mayo Clinic 醫學中心［35-37］將新鮮的豬肝細胞分離后，制備成懸浮肝細胞球，用于救治豬肝衰竭模型。四川大學華西醫院實驗室［38］利用豬肝細胞與內皮細胞混合成球培養，用于猴肝衰竭模型治療。BLSS 系統［39］是將豬原代細胞與膠原蛋白混合接種于中空纖維反應器內構建的人工肝系統。將患者血漿先經過氧合器和加熱器，再與豬肝細胞進行物質交換后回輸到患者體內，實現治療的目的。HepatAssist 2000 系統［40-41］是目前臨床研究最多的人工肝系統。通過體外循環裝置將患者的血液經過置換，再將有毒的血漿通過含有豬肝細胞的中空纖維管，進一步清除有毒物質，同時豬肝細胞分泌合成的細胞因子、蛋白等回到患者體內，實現代償肝功能的作用。早在1999 年已開展了基于HepatAssist 2000 系統的Ⅰ期多中心臨床研究［40］，研究者對39 例急性肝衰竭患者進行了治療，其中35 例患者生存期超過30 天，6 例患者在不需要移植物的情況下恢復正常。然而隨后的4年隨機對照試驗［41］顯示，該系統可顯著降低血清總膽紅素的含量，但生存率與對照組無顯著性差異（71% vs 62%）。目前該系統仍處于Ⅲ期臨床試驗階段，暫時沒有數據表明患者感染異種病毒。然而，豬源肝細胞存在跨物種的免疫反應、潛在的豬內源性逆轉錄病毒（PERV）感染的風險［42］，歐洲部分國家已禁止使用原代豬肝細胞用于生物型人工肝［7］，美國食品藥品監督管理局也未予以批準，其應用前景受到限制。

2 種子細胞培養方式

通常認為生物型人工肝需要裝載至少等同于1/10成年人肝臟大小的細胞數量才能發揮其體外代償肝功能的作用。肝細胞貼壁生長依賴于培養面積，傳統的2D培養模式很難實現肝細胞規?；苽?。目前，生物型人工肝種子細胞擴增多采用生物反應器，通過構筑3D 培養環境，模擬肝細胞在體內生長的微環境，實現肝細胞高密度培養的同時，增強肝細胞合成及代謝功能。3D肝細胞培養方式主要分為2 種，即支架結構培養和懸浮培養。

2.1 支架結構培養 3D 支架結構生物反應器能夠為肝細胞提供接近三維靜態生長環境，可有效降低細胞所受剪切力，減少細胞機械損傷，代表性反應器為中空纖維結構。中空纖維生物反應器通過將成束的中空纖維進行封裝，細胞可貼附在纖維管內、纖維管外等不同空間生長。高毅團隊［43］利用中空纖維生物反應器將MSC擴增至臨床應用數量級，并成功應用于肝衰竭大動物模型的救治實驗，實現有效抑制全身炎癥反應，將7天生存率從17%提升到87.5%。作為首個干細胞型生物人工肝藥械組合產品，“血液凈化用MSC”正式獲得國家藥品監督管理局臨床試驗批件，未來有望為肝衰竭患者提供新的治療手段。中空纖維生物反應器用于細胞體外培養的概念最早于1972 年被提出［44-45］，但同時存在氧合能力較差的缺陷，即使配合目前較完備的氧合裝置與持續培養基灌注系統，也僅適合特定的細胞類型，如適應低氧環境、對液體剪切力不敏感的MSC［45-46］。

2.2 載體懸浮培養 肝細胞載體懸浮培養，是將肝細胞自聚集或者貼附載體形成肝細胞團，通過不同方式懸浮分布于生物器內。懸浮培養能充分利用生物反應器內空間，增加肝細胞生長表面積、提高物質交換效率，從而達到規?；囵B的目的。肝細胞球技術是利用非黏附板培養細胞，促進肝細胞聚集成多細胞小球。南京大學鼓樓醫院將一定數量的肝細胞球置于自主開發的多層板生物反應器，克服了細胞球沉降聚集，在肝衰竭豬模型實驗中取得了顯著療效［47］。Lu等［48］利用人成纖維細胞直接重編程得到肝細胞樣細胞和人肝非實質細胞，并制作肝細胞球類器官結構，由于肝細胞球本身具有模擬肝臟生理微環境、促進肝功能表達等優點，在生物型人工肝等方面受到越來越多的關注與研究。

采用水凝膠包被的方式將肝細胞制成微囊包裹，是懸浮高密度培養肝細胞的重要方法。筆者團隊［49］利用可生物降解的海藻酸鹽包裹iHepLPC 與內皮細胞形成共培養3D 結構，實現異種肝樣細胞動物體內存活和肝功能維持的作用，有效治療化學誘導劑引起的小鼠急性肝損傷模型。但肝細胞球體積不易控制、中央區域營養物質傳輸受限、中心細胞容易壞死，影響肝細胞球發揮作用的效率。為了解決上述缺點，筆者團隊以網織纖維載體結合“液-氣交互式”動力裝置構建新型生物反應器，為iHepLPC 提供3D 結構培養的固定場所，實現了血漿與細胞之間的高效物質交換，使得生物型人工肝性能大幅提升，并成功在大動物模型中驗證了有效性［24］。由此可見，下一步應當通過優化生物反應器的結構設計，以適配不同細胞的生物學特性，從而達到增強肝細胞活性，提高生物型人工肝療效的目的。

3 生物反應器培養系統

生物反應器培養系統是指以生物反應器為核心，通過載體懸浮或者支架貼壁的方式在生物反應器內構建3D培養環境，采用工程技術手段對生物反應器內的環境參數實時在線測控，并輔以循環或連續灌注的手段，加強營養傳輸和物質交換，從而構建適合肝細胞生長、增殖的培養條件［50］。肝細胞作為生物型人工肝的活性成分，按藥品的質量要求進行生產，而培養過程的動態監測與控制是細胞治療行業發展的監管趨勢。只有構建多參數（pH 值、溶解氧濃度、溫度以及關鍵生化指標如葡萄糖、乳酸和銨離子等）實時在線檢測、協同控制的生物反應器系統，才能保證培養過程可控，獲得可靠的預期結果。以最早實現實時在線監測和反饋控制的pH 值和溶解氧濃度為例，電化學傳感器仍然是理想的選擇。得益于早期電化學傳感器的發展及其在生物發酵工業中的應用，電化學傳感器可直接安裝在生物反應器內實現原位監測，具有數據即時、檢測可靠穩定、精度高、響應時間短等優點［51-52］。在連續監測葡萄糖的乳酸濃度方面，Renneberg 等［53］首次通過接入測量葡萄糖和乳酸濃度的酶傳感器，建立動物細胞培養過程中葡萄糖和乳酸實時在線測量裝置。搭載不同的電化學和酶傳感器可實現細胞外環境參數實時在線監測和反饋控制，筆者開發的貼壁細胞工業化大規模、自動化生產設備，實現了研發至下游應用的全流程、封閉式、自動化、模塊化、可擴展的智能制造系統。細胞生產的智能制造和智慧工廠，為生物型人工肝的產業轉化和行業發展提供了硬件基礎。

4 小結

綜上所述，生物型人工肝作為新技術具有廣泛而確切的應用前景。在日益完善的集成化、智慧型制造系統支持下，生物型人工肝種子細胞體外大規模擴增技術也日漸成熟。然而，如何獲取理想的種子細胞并維持其肝功能的穩定、可靠、持續，滿足在臨床長時間使用過程中的活性與效力不丟失，仍是研究者們亟需解決的難題。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：朱雪晶、黃偉健負責文獻資料搜集和分析，撰寫論文；鄢和新負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。